張國(guó)新 高苒 *

(1.國(guó)家人類疾病動(dòng)物模型資源庫,國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021;2.北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021)

數(shù)十年的癌癥研究揭示了介導(dǎo)癌癥進(jìn)展的遺傳和分子途徑,發(fā)現(xiàn)了許多合理的治療靶點(diǎn),有望改善腫瘤患者的臨床治療效果[1]。但是,惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)包含多因素的動(dòng)態(tài)復(fù)雜過程,仍是導(dǎo)致90%以上腫瘤患者死亡的主要原因[2]。從原發(fā)灶脫離的播散性癌細(xì)胞在遠(yuǎn)處器官部位引發(fā)新腫瘤。轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)涉及多個(gè)步驟,包括侵襲、從原發(fā)腫瘤進(jìn)入循環(huán)、全身播散、外滲、再激活和生長(zhǎng)。肺轉(zhuǎn)移常見于不同類型的癌癥,包括乳腺癌、胃腸道腫瘤、腎癌、黑色素瘤、不同類型的肉瘤以及肺癌本身[3-4]。腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用顯著影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和腫瘤進(jìn)展[5],內(nèi)皮細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)成分,與癌細(xì)胞之間的相互作用通過生成新血管或破壞內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[6]。因此,研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞影響腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制需要進(jìn)一步探索,建立一種良好的肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型是研究和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的前提。

內(nèi)皮粘蛋白(endomucin,EMCN)是一種I 型完整膜糖蛋白,在靜脈和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。它由261 個(gè)氨基酸組成,其胞外結(jié)構(gòu)域在絲氨酸和蘇氨酸殘基處高度O-糖基化,并且具有幾個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)[7]。在涉及的許多細(xì)胞粘附分子中,EMCN 作為膜結(jié)合糖蛋白在毛細(xì)血管后小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的管腔側(cè)特異表達(dá),并在生理和病理性血管生成中發(fā)揮作用[8]。然而,EMCN 在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用尚未見報(bào)道。本研究擬采用尾靜脈注射LLC 細(xì)胞和皮下接種LLC 細(xì)胞后手術(shù)切除腫瘤的方法建立肺轉(zhuǎn)移小鼠模型,比較內(nèi)皮細(xì)胞EMCN 敲除小鼠和C57BL/6 小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10 只8 周齡SPF 級(jí)正常C57BL/6 小鼠,體重約為25 g,EMCNflox/flox純合子轉(zhuǎn)基因小鼠6 只和Tek-CreERT2 轉(zhuǎn)基因小鼠6 只購(gòu)自北京唯尚立德生物科技有限公司【SCXK(京)2019-0008】。小鼠于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)間飼養(yǎng)【SYXK(京)2019-0039】,實(shí)驗(yàn)操作在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所地下動(dòng)物房進(jìn)行,室內(nèi)溫度控制在20～25℃,濕度范圍40%～70%。小鼠用具每周進(jìn)行1 次清洗高壓處理。在實(shí)驗(yàn)時(shí),嚴(yán)格遵循3R 原則及動(dòng)物福利。本課題使用小鼠通過了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(IACUC-GR21003)。

1.1.2 細(xì)胞

LLC 小鼠肺癌細(xì)胞株為本課題組保藏。

1.1.3 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)買自美國(guó)Gibco公司,細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自NEST,手術(shù)器械購(gòu)自德國(guó)FST 公司,吸入麻醉劑異氟烷(Isoflurane)購(gòu)自深圳瑞沃德公司。相差倒置顯微鏡(Zeiss,日本);離心機(jī)(eppendorf,德國(guó));數(shù)字游標(biāo)卡尺(上海臺(tái)海工量具公司)。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖與鑒定

將內(nèi)皮細(xì)胞特異性 Tek-CreERT2 小鼠與EMCNflox/flox小鼠雜交,獲得子代后,將子代雄性EMCNflox/wt/Tek-CreERT2+與雌性EMCNflox/flox小鼠交配,取得內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除EMCN 基因小鼠(EMCNflox/flox/Tek-CreERT2+,EMCNecko)。EMCNflox/flox為純合子小鼠,后續(xù)雌雄均取純合子EMCNecko小鼠與EMCNflox/flox小鼠雜交繁殖。利用DNA 提取試劑盒提取鼠尾DNA,設(shè)計(jì)合成鑒定flox位點(diǎn)引物(Forward:5′-AACAAAATTATGGTCTTT TCCG-3′,Reversed:5′-CCTAAGATGCTAGTGTTCG CC-3′) 和 Tek-creERT2 的引物(Forward:5′-AAGATACAGCCTTTCCCATCCTAAT-3′,Reversed:5′-TTAAGCAAAATAATAGATTTGAGGC-3′)。PCR總反應(yīng)體系20 μL:2 × PCR Master Mix 10 μL,上游引物和下游引物各1 μL,提取的DNA 作為模板2 μL,無RNA 酶的水6 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;95℃ 變性30 s;60℃ 退火30 s,72℃延伸30 s,共30 個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。結(jié)束后,取PCR 反應(yīng)產(chǎn)物7 μL 在1.2%瓊脂糖凝膠電泳,110 V 25 min,凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.2.2 尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC 細(xì)胞消化離心,用PBS 重懸細(xì)胞,制成1 × 107/mL 的細(xì)胞懸液,尾靜脈注射C57BL/6 和EMCNecko小鼠每只100 μL,尾靜脈注射14 d 后,解剖取肺,HE 染色觀察肺轉(zhuǎn)移情況。

1.2.3 皮下腫瘤手術(shù)切除肺轉(zhuǎn)移模型構(gòu)建

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC 細(xì)胞消化離心,用PBS 重懸細(xì)胞,制成3 × 106/mL 的細(xì)胞懸液,皮下注射C57BL/6 和EMCNecko小鼠每只100 μL,皮下注射21 d后,手術(shù)切除皮下腫瘤,在腫瘤切除后14、21 d解剖取肺觀察肺轉(zhuǎn)移情況。

1.2.4 HE 染色

將福爾馬林固定的組織石蠟包埋后,組織切片4 μm 厚度。60℃烘箱2 h 后進(jìn)行切片的常規(guī)脫蠟,二甲苯Ⅰ20 min,二甲苯Ⅱ10 min,無水乙醇30 s,95%乙醇30 s,75%乙醇30 s,蒸餾水5 min,蘇木素染色4 min,0.5%鹽酸酒精分化9 s,流水沖洗15 min,75%乙醇10 s,85%乙醇10 s,伊紅染色10 s,后續(xù)脫水95%乙醇10 s,無水乙醇10 s,二甲苯Ⅰ10 s,二甲苯Ⅱ10 s,封片劑封片后觀察。

1.2.5 Western Blot

將小鼠麻醉后解剖,心臟灌注后取肺,使用RIPA 裂解液冰上裂解30 min,12 000 rpm 離心30 min,取上清后加入5 × loading buffer,金屬浴中100℃10 min。通過SDS-PAGE 將蛋白分離,250 mA 90 min 電泳將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜,5 %脫脂奶粉封閉后,一抗孵育過夜。TBST 清洗后,二抗室溫1 h,在成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

腫瘤轉(zhuǎn)移面積通過Image J 測(cè)量,腫瘤體積的數(shù)據(jù)通過Graphpad Prime 8 軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示,使用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EMCNecko小鼠表型分析

C57BL/6 遺傳背景的內(nèi)皮細(xì)胞EMCN 基因敲除小鼠與野生型C57BL/6 鼠外觀形態(tài),繁殖能力無顯著性差異。通過HE 切片染色顯示,與C57BL/6小鼠比,EMCNecko小鼠主要臟器未見異常(見圖1)。

圖1 C57BL/6 和EMCNecko小鼠主要臟器HE 染色Note.There was no significant difference between C57BL/6 and EMCNecko mice.Figure 1 HE staining of main organs of C57BL/6 and EMCNecko mice

2.2 內(nèi)皮細(xì)胞EMCN 敲除小鼠基因和蛋白鑒定

對(duì)C57BL/6 和EMCNecko小鼠鼠尾基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定結(jié)果。如圖2 所示:A 圖中1 號(hào)為野生型對(duì)照,未見條帶。2,3,5 號(hào)樣品條帶在1800 bp 位置左右,為Tek-creERT2 陽性小鼠,4 號(hào)樣品未見條帶,為Tek-creERT2 陰性小鼠。B 圖中1 號(hào)樣品條帶大小在180 bp 左右,為野生型小鼠。對(duì)于EMCNflox/flox小鼠鑒定,2 號(hào)和4 樣品條帶在220 bp 位置左右,為EMCNflox/flox純合小鼠,3 號(hào)樣品條帶在 180 bp 和 220 bp 位置左右,為雜合EMCNflox/flox小 鼠。Western Blot 檢 測(cè)C57BL/6 和EMCNecko小鼠肺組織中EMCN 的表達(dá)情況,結(jié)果顯示EMCNecko小鼠肺中EMCN 被敲除(P＜0.001)(見圖3)。

圖2 部分小鼠PCR 基因型鑒定結(jié)果Note.A.1.Wild type.2,3,5.Tek-creERT2 positive mice.4.Tek-creERT2 negative mice.B.1.Wild type.2,4.EMCNecko homozygous mice.3.EMCNecko Heterozygote mice.Figure 2 Results of genotype identification of some mice by PCR

圖3 Western Blot 檢測(cè)結(jié)果Note.The expression of EMCN in lung tissue of C57BL/6 and EMCNeckomice.Figure 3 Western Blot results

2.3 C57BL/6 和EMCNecko 小鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移情況對(duì)比分析

C57BL/6 和EMCNecko小鼠每組各5 只,尾靜脈注射LLC 細(xì)胞14 d 后,解剖取肺,然而檢測(cè)肺轉(zhuǎn)移情況,C57BL/6 和EMCNecko小鼠均發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,與C57BL/6小鼠比,EMCNecko組小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目顯著增多,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),表明,內(nèi)皮細(xì)胞EMCN 的敲除顯著地促進(jìn)了肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

圖4 肺轉(zhuǎn)移檢測(cè)Note.A.Lung metastasis in C57BL/6 and EMCNecko mice.B.The number of metastases foci.Compared with WT group,**P ＜0.01.Figure 4 Lung metastasis detection

2.4 C57BL/6 和EMCNecko 小鼠皮下腫瘤手術(shù)后切除肺轉(zhuǎn)移情況對(duì)比分析

為了更好的模擬臨床腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā),我們構(gòu)建了皮下腫瘤手術(shù)后切除肺轉(zhuǎn)移小鼠模型,該模型可以模擬腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離,突破基質(zhì)穿入血管的過程,比傳統(tǒng)的尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞直接進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)更能模擬腫瘤轉(zhuǎn)移的整個(gè)過程[9]。結(jié)果顯示:C57BL/6 和EMCNecko小鼠在手術(shù)后3 周均可發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,而EMCNecko小鼠比C57BL/6 小鼠更容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移(P＜0.05,P＜0.01),EMCNecko小鼠作為一種快速肺轉(zhuǎn)移模型優(yōu)于C57BL/6 小鼠,為腫瘤肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型各項(xiàng)研究提供快速發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的小鼠模型(見圖5)。

圖5 肺轉(zhuǎn)移檢測(cè)Note.A.Establishment of lung metastasis model after subcutaneous tumor resection in C57BL/6 and EMCNecko mice.B.Lung metastasis at different times in C57BL/6 and EMCNecko mice.C.Lung tissue HE staining.D.The analysis of lung metastasis area.Compared with WT group,*P ＜0.05,**P ＜0.01.Figure 5 Lung metastasis detection

3 討論

開發(fā)新的有效藥物以阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的研究離不開有效的動(dòng)物模型[10]。然而建立快速肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型用于腫瘤轉(zhuǎn)移研究至關(guān)重要[11]。以往的腫瘤肺轉(zhuǎn)移模型是通過尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞直接進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng),然而缺少了腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶進(jìn)入血液的過程,因此無法模擬人類腫瘤轉(zhuǎn)移的過程,在本研究中,我們通過手術(shù)切除原發(fā)腫瘤,觀察肺轉(zhuǎn)移情況,構(gòu)建了一種更好的模擬臨床腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)的肺轉(zhuǎn)移小鼠模型。

粘蛋白屬于構(gòu)成粘液主要結(jié)構(gòu)成分的糖蛋白家族[12]。EMCN 屬于糖蛋白家族成員之一,是一種膜結(jié)合糖蛋白,由毛細(xì)血管后小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)腔表達(dá)[7]。毛細(xì)血管后小靜脈是炎癥期間白細(xì)胞募集的主要場(chǎng)所,EMCN 在維持正常的生理狀態(tài)發(fā)揮了重要作用[13]。本實(shí)驗(yàn)采用Cre-Loxp 系統(tǒng)構(gòu)建了內(nèi)皮細(xì)胞條件性敲除小鼠模型,取鼠尾組織基因組DNA、PCR 擴(kuò)增和凝膠電泳等鑒定出EMCN 敲除鼠的基因型,通過Western Blot 法檢測(cè)不同臟器中EMCN 的表達(dá)水平,結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞條件性敲除EMCN 基因小鼠模型構(gòu)建成功。HE 染色結(jié)果顯示,C57BL/6 和EMCNecko小鼠肺能夠觀察到細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)存在,這表明構(gòu)建的手術(shù)后切除模型發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,建模成功。與C57BL/6 小鼠相比,EMCNecko小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)顯著增加,表明內(nèi)皮細(xì)胞EMCN 的敲除顯著的促進(jìn)了腫瘤的肺轉(zhuǎn)移。

綜上,與正常C57BL/6 小鼠比,在腫瘤肺轉(zhuǎn)移的形成能力上,EMCNecko小鼠具有明顯優(yōu)勢(shì),我們分析推斷內(nèi)皮細(xì)胞EMCN 基因缺失引起的肺部的改變是易于形成肺轉(zhuǎn)移的重要原因,在應(yīng)用方面,預(yù)期可將EMCN 敲除小鼠肺轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型應(yīng)用于各項(xiàng)分子機(jī)制探索及藥物研發(fā)中,該方法模型構(gòu)建周期短,成功率高,節(jié)約成本,更能符合臨床腫瘤患者的術(shù)后復(fù)發(fā),可用于腫瘤肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的防治研究。