張銳虎 姚茹 史澤雅郭民霍怡彤侯佳楠陳朝陽*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,太原 030001;2.山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030001)

氧化應(yīng)激與炎癥是造成許多疾病發(fā)生的重要原因,如急性肺損傷等[1]。因此,尋找同時(shí)具有抗炎與抗氧化作用的藥物將對(duì)此類疾病的治療具有積極作用。RAW264.7 細(xì)胞是小鼠巨噬細(xì)胞,巨噬細(xì)胞在一些炎性組織損傷中起關(guān)鍵作用,是一種主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞[2]。LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分,會(huì)通過抑制Nrf2/HO-1 通路與激活NFκB、MAPK 通路刺激巨噬細(xì)胞ROS 含量的增加和炎癥介質(zhì)的生成[3]。近年來,許多傳統(tǒng)藥物的活性成分被提取用于疾病的研究[4],其中蓮心堿是一種二芐基四氫異喹啉類生物堿,從蓮子中分離得到,具有抗高血壓、抗心律失常、血管平滑肌等生物活性[5]。已報(bào)道蓮心堿對(duì)叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞HepG2 細(xì)胞系氧化應(yīng)激具有細(xì)胞保護(hù)作用[6],還可抑制大鼠灌注后炎性因子TNF-α 和IL-1的表達(dá)[7],但并未報(bào)道其抗氧化抗炎作用靶點(diǎn),前期我們也在動(dòng)物水平證明了蓮心堿通過抗氧化與抗炎作用對(duì)急性肺損傷具有顯著預(yù)防效果[8]。因此,本研究我們將在細(xì)胞水平對(duì)蓮心堿抗炎抗氧化作用及分子機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

RAW264.7 細(xì)胞購于上海細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器

蓮心堿(HPLC ≥98%)(北京中科質(zhì)檢生物有限公司,批號(hào):2586-96-1,中國);脂多糖(Sigma 公司,美國);TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司,中國);CCK-8、NO、PGE2試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司);ROS、GSH、MDA、SOD 試劑盒(南京建成生物工程研究所,中國);PrimeScriptTMRTMasterMix、SYBR PremixEX TaqⅡ(TaKaRa 公司,日本);一抗、二抗(CST 公司,美國);β-actin、COX-2、iNOS 引物由上海生工合成;化學(xué)發(fā)光成像儀(G-Box Chemixx9,Syngene 公司,英國);流式細(xì)胞儀(FACS-Calibur,BD 公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7 細(xì)胞用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(89%的DMEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%的100 IU/mL 青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)在培養(yǎng)箱中(37℃和5% CO2)。

1.2.2 CCK-8 毒性檢測

將RAW264.7 細(xì)胞接種到96 孔板(5 × 104個(gè)細(xì)胞/孔)中,培養(yǎng)24 h 后,加入100 μL 不同濃度(0、0.25、0.5、1、2、4、8 和16 μmol/L)的蓮心堿。24 h后,倒掉培養(yǎng)基,每孔加入10 μL 的CCK-8 和100 μL 含蓮心堿的培養(yǎng)液,孵育4 h 后在酶標(biāo)儀450 nm 下檢測吸光度。

1.2.3 細(xì)胞炎癥相關(guān)指標(biāo)的測定

RAW264.7 細(xì)胞被接種到24 孔板(1 × 105個(gè)細(xì)胞/孔)中,培養(yǎng)24 h 后,加入100 μL 不同濃度的蓮心堿(0.5、1、2 μmol/L)2 h,用LPS(2 μg/mL)刺激24 h。將細(xì)胞培養(yǎng)液離心(2000 rpm,10 min)后吸取上清至新的離心管,在各孔細(xì)胞中均加入50 μL Griess Reagent Ⅰ、Griess Reagent Ⅱ后輕輕振蕩,于540 nm 下檢測,以測定NO 濃度。按ELISA 試劑盒說明書檢測上清液中PGE2、TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量。

1.2.4 qRT-PCR

RAW264.7 細(xì)胞被接種在6 孔板(2 × 105個(gè)細(xì)胞/孔),培養(yǎng)24 h,隨后用不同濃度的蓮心堿(0.5、1、2 μmol/L)處理細(xì)胞2 h,用2 μg/mL LPS 刺激細(xì)胞12 h。采用TRIzol 試劑裂解細(xì)胞提取總RNA 后進(jìn)行濃度測定,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行qRT-PCR 檢測,結(jié)果以2-ΔΔct相對(duì)表達(dá)量表示。引物為:COX-2:F:5′-CTGGAACATGGACTCACTCAGTTTG-3′,R:5′-AGGCCTTTGCCACTGCTTGTA-3′;iNOS:F:5′-CAAGC ACATTTGGGAATGGAGA-3′,R:5′-CAGAACTGAGGG TACATGCTGGAG-3′;β-actin:F:5′-CAAGCACATT TGGGAATGGAGA-3′,R:5′-CAGAACTGAGGGTACAT GCTGGAG-3′。

1.2.5 細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定

RAW264.7 細(xì)胞被接種在6 孔板(2 × 105個(gè)細(xì)胞/孔),培養(yǎng)24 h,隨后用不同濃度的蓮心堿(0.5、1、2 μmol/L)處理細(xì)胞2 h,用2 μg/mL LPS 刺激細(xì)胞1 h。孵育30 min(10 μmol/L DCFH-DA,37℃),收集細(xì)胞懸液離心(1000 r/min,10 min),倒掉上清加200 μL Binding Buffer 用流式進(jìn)行檢測,結(jié)果以平均熒光強(qiáng)度值表示,代表ROS 含量。

RAW264.7 細(xì)胞被接種到6 孔板(2 × 106個(gè)細(xì)胞/孔),培養(yǎng)24 h 后,加入100 μL 不同濃度的蓮心堿(0.5、1、2 μmol/L)2 h,用2 μg/mL LPS 刺激12 h,倒掉上清,收集細(xì)胞后根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書測定MDA、SOD 和GSH 的含量。

1.2.6 Western Blot

將3 × 106細(xì)胞接種于T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶,培養(yǎng)12 h,隨后用0.5、1、2 μmol/L 的蓮心堿干預(yù)細(xì)胞6 h,2 μg/mL LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞1 h。PBS 清洗兩次細(xì)胞,加入1 mL 裂解液冰上裂解30 min,吸至離心管中離心(12 000 rpm,10 min,4℃),吸取上清測蛋白濃度,加入Loading Buffer 后煮沸5 min。進(jìn)行凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗孵育過夜,二抗孵育,曝光,用Image J 進(jìn)行條帶分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示,兩組比較采用LSD-t檢驗(yàn),P＜0.05 與P＜0.01 被認(rèn)為差異具有顯著性以及差異極具顯著性。

2 結(jié)果

2.1 蓮心堿對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞具有抗炎作用

當(dāng)用0～4 μmol/L 蓮心堿處理時(shí),細(xì)胞存活率沒有降低,我們在隨后的實(shí)驗(yàn)中使用了無毒濃度(0.5、1 和2 μmol/L)蓮心堿。

如圖1 所示,與對(duì)照組相比,LPS 組NO(表示為亞硝酸鹽)、PGE2 和促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1)的含量顯著增加(P＜0.01),與LPS 組相比,蓮心堿組顯著抑制了這些促炎介質(zhì)的生成(P＜0.01),且與蓮心堿劑量呈依賴性。

圖1 蓮心堿對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞的NO、PGE2、TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量的影響Note.Compared with the control group,#P ＜0.05,##P ＜0.01.Compared with the LPS group,*P ＜0.05,**P＜0.01.(The same in the following figures)Figure 1 Effects of LIE on the concents of NO,PGE2,TNF-α,IL-6 and IL-1β in LPS-induced RAW264.7 Macrophages

2.2 蓮心堿抑制了LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中 COX-2、iNOS mRNA 表達(dá)和NF-κB、MAPK通路

qRT-PCR 結(jié)果如圖2A,2B 所示,與對(duì)照組相比,LPS 組COX-2 與iNOS mRNA 表達(dá)量顯著升高(P＜0.01),蓮心堿處理后,與LPS 組相比,顯著降低了COX-2 與iNOS 的mRNA 表達(dá)量(P＜0.01)。

Western Blot 檢測結(jié)果如圖2C,2D,2E,2F 所示,與對(duì)照組相比,LPS 組IκBα 顯著發(fā)生降解和磷酸化,NF-κB p65、p38、ERK1/2、JNK1/2 顯著發(fā)生磷酸化(P＜0.05);與LPS 組相比,蓮心堿組顯著抑制了IκBα 的降解和磷酸化以及NF-κB p65、p38、ERK1/2 和JNK1/2 的磷酸化(P＜0.05),這些結(jié)果表明蓮心堿可以抑制NF-κB 和MAPK 通路。

圖2 蓮心堿對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞的COX-2 和iNOS 的表達(dá)以及NF-κB 和MAPKs 通路的影響Figure 2 Effects of LIE on iNOS mRNA expression and NF-κB and MAPKs pathway in LPS -induced RAW264.7 Macrophages

2.3 蓮心堿對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞的抗氧化作用

如圖3 所示,通過對(duì)平均熒光值分析表明,與對(duì)照組相比,LPS 組的ROS 生成增加,但使用蓮心堿進(jìn)行處理后,ROS 生成顯著減少(P＜0.01),LPS組MDA 含量顯著增加,GSH 含量和SOD 活性顯著降低(P＜0.01),蓮心堿進(jìn)行處理后,MDA 含量顯著減少,SOD 活性和GSH 含量顯著增加(P＜0.01)。

2.4 蓮心堿激活了LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中Nrf2/HO-1 通路

如圖4 所示,與LPS 組相比,蓮心堿組Keap1表達(dá)顯著降低,并以劑量依賴的方式促進(jìn)Nrf2 和HO-1 表達(dá)(P＜0.05)。這些結(jié)果表明,蓮心堿有效地激活了Nrf2/HO-1 通路。

圖4 蓮心堿對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞中Nrf2/HO-1 通路的影響Figure 4 Effects of LIE on Nrf2/HO-1 pathway in LPS-induced RAW364.7 macrophages

3 討論

炎癥與氧化應(yīng)激是互相依賴存在的[9],許多疾病同時(shí)伴隨著炎癥與氧化應(yīng)激的發(fā)生,如急性肺損傷,蓮心堿已被證實(shí)具有抗炎抗氧化作用[8],但分子機(jī)制尚未明確,因此明確其抗炎抗氧化機(jī)制對(duì)于此類疾病的治療具有重要意義。我們通過LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞不僅驗(yàn)證了蓮心堿的抗炎抗氧化作用而且證明了其抗炎抗氧化作用的機(jī)制。

PGE2 和NO 是兩種重要的促炎介質(zhì)[10];iNOS向體內(nèi)傳遞氣體信號(hào)并參與NO 的產(chǎn)生;環(huán)氧合酶COX-2 參與PGE2 的產(chǎn)生[11]。我們的研究表明,蓮心堿通過降低COX-2 和iNOS 的轉(zhuǎn)錄水平,顯著降低了PGE2 和NO 的生成。TNF-α、IL-1β 和IL-6 作為促炎因子可以促進(jìn)炎癥[12]。我們的研究結(jié)果表明,蓮心堿能顯著降低TNF-α、IL-1β 和IL-6 的釋放,從而證實(shí)了蓮心堿的抗炎活性。LPS 通過促進(jìn)IκBα 的降解,將重要的抗炎分子靶標(biāo)NF-κB 從IκBα 中分離出來。許多炎癥介質(zhì),包括誘導(dǎo)型iNOS 和COX-2,將隨著NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核而增加表達(dá)[13-14]。當(dāng)LPS 誘導(dǎo)炎癥時(shí),MAPK 信號(hào)通路被激活,P38、ERK 和JNK 被磷酸化,還調(diào)節(jié)某些基因的轉(zhuǎn)錄水平,包括iNOS 和COX-2[15-16]。在我們的研究中,蓮心堿阻斷了IκBα 的降解,并抑制了p65、p38、ERK 和JNK 的磷酸化。因此,蓮心堿的抗炎作用可能是通過抑制NF-κB 和MAPK 通路來實(shí)現(xiàn)的。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激會(huì)產(chǎn)生過量的ROS,破壞抗氧化系統(tǒng),致使細(xì)胞發(fā)生氧化性損傷[17]。MDA可以破壞細(xì)胞膜,這是氧化應(yīng)激的標(biāo)志,氧化應(yīng)激造成的損害可以通過抗氧化酶的活性得到改善,包括SOD 和GSH[18-19]。實(shí)驗(yàn)表明,蓮心堿能顯著降低LPS 誘導(dǎo)的ROS 和MDA 的生成。此外,LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞會(huì)降低GSH 水平和SOD 活性,蓮心堿可以有效地逆轉(zhuǎn)這一改變。許多天然植物化合物可以通過Nrf2/HO-1 途徑減輕LPS 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。當(dāng)抗氧化分子進(jìn)入細(xì)胞時(shí),Nrf2 從Keap1 分離并移位到細(xì)胞核,上調(diào)HO-1 的表達(dá),從而發(fā)揮抗氧化作用[20]。我們的研究表明,用蓮心堿處理后顯著增加了Nrf2 和HO-1 的核表達(dá),降低了Keap1 的表達(dá)。在此,我們證明了蓮心堿可能通過激活Nrf2/HO-1 通路來減輕LPS 引起的氧化應(yīng)激。

綜上所述,蓮心堿通過抑制NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路,從而抑制iNOS 和COX-2 的表達(dá)和促炎因子(TNF-α、IL-1β 和IL-6)的釋放,發(fā)揮抗炎作用;通過活化Nrf2/HO-1 通路,抑制ROS、MDA 的生成,增加SOD 的活性和GSH 的含量,發(fā)揮抗氧化作用。本研究對(duì)蓮心堿抗炎抗氧化作用機(jī)制的研究期望可以為伴有炎癥與氧化應(yīng)激的疾病的治療提供一個(gè)新的方向。