包正琦，段麗娟，戴于棟，孫偉，楊凱，高建軍

蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司，甘肅 蘭州 730046

馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2是由破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT）免疫馬所得血漿，經(jīng)胃酶消化后采用硫酸銨鹽析、超濾和柱色譜等工藝純化制成的液體免疫球蛋白F（ab′）2制劑，用于預(yù)防和治療破傷風(fēng)梭菌引起的感染［1］。與破傷風(fēng)抗毒素制備工藝比較，馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2增加了一步柱色譜純化工藝。柱層析工藝作為現(xiàn)代常用的蛋白質(zhì)純化技術(shù)手段，其純化過程快速簡單、易于放大和控制，已廣泛用于生物制品行業(yè)。親和層析（affinity chromatography，AC）是基于目的產(chǎn)物與其固相介質(zhì)上的配體能夠特異性結(jié)合和可逆結(jié)合的性質(zhì)而分離獲得目的產(chǎn)物的層析技術(shù)［2］。免疫親和層析（immunoaffinity chromatography，IAC）是親和層析的一種，是利用生物體內(nèi)存在的抗原、抗體之間高度特異性親和力進行分離的方法［3］。親和層析法由于具有高選擇性和快速性而成為使用最廣泛的抗體純化方法之一，隨著層析介質(zhì)和固定化方法的發(fā)展，免疫親和層析法在生命科學(xué)中已成為一種較有價值的技術(shù)［4-6］。

本實驗將TT 免疫馬所得的血漿經(jīng)胃酶消化、加溫變性、硫酸銨鹽析、明礬吸附、超濾，再經(jīng)免疫親和層析法純化制備馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2，并對其關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)進行測定，以評價免疫親和層析制備馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的可行性及所制備產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 血漿 TT 免疫馬血漿由張掖市長豐生物科技有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 SDS、丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺均購自美國Sigma 公司；N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、過硫酸銨、甲醇、考馬斯亮藍、NaHCO3、NaCl、HAc、HCl、H2SO4、CuSO4、K2SO4、烏酸鈉、NaOH及Tris-HCl 均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；寬分子量蛋白質(zhì)marker 購自寶生物工程（上海）有限公司；TT（批號：HP201208001）由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第一研究室提供；CNBr activated Sepharose 4FF、Superdex 200 Increase 10／300 GL 凝膠介質(zhì)及ATKA purifier 蛋白快速純化系統(tǒng)均購自美國GE 公司。

1.3 免疫親和介質(zhì)制備 稱取140 g CNBr activated Sepharose 4FF 干粉介質(zhì)，用560 mL 1 mmol／L HCl溶液充分溶解，倒入層析柱中，1 mmol／L HCl 溶液沖洗10 ～ 20 個柱體積。用含0.5 mol／L NaCl 的0.1 mol／L NaHCO3（pH 8.3）置換TT 的緩沖體系后，與上述介質(zhì)混合，室溫振蕩2 h；裝柱，用含0.5 mol／L NaCl 的0.1 mol／L NaHCO3（pH 8.3）沖洗5～10 個柱體積，采用0.1 mol／L Tris-HCl（pH 8.0）低流速沖洗層析柱5 ～ 10 個柱體積，封閉未結(jié)合位點。再依次用含0.5 mol／L NaCl 的0.1 mol／L Tris-HCl（pH 8.0 ～ 9.0）洗滌5 ～ 10 個柱體積，含0.5 mol／L NaCl 的0.1 mol／L HAc（pH 3.0 ～ 4.0）洗滌3 ～ 6 個柱體積，即完成介質(zhì)的偶聯(lián)與裝柱。

1.4 純化方法 馬血漿經(jīng)胃酶消化、加溫變性、硫酸銨鹽析、明礬吸附后，用平衡液（50 mmol／L PB +0.15 mol／L NaCl，pH 7.0）超濾濃縮至原血漿體積的20%，獲得3 批破傷風(fēng)抗毒素，批號分別為M-20160302、M-20160303、M-20160304，再進行柱層析純化。裝好的層析柱用平衡液平衡至少3 ～ 5 個柱體積，至UV 達到基線，開始上樣，上樣體積為3 個柱體積，經(jīng)平衡液平衡至UV 達到基線，再用洗脫液（0.25 mol／L HAc）進行洗脫，UV 大于100 mAU 時開始收集洗脫峰，收集至UV 降至100 mAU 以下結(jié)束。用1 mol／L NaOH 溶液調(diào)節(jié)洗脫液pH 至6.5，超濾濃縮，用0.22 μm 濾芯除菌，獲得相應(yīng)3 批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2原液，批號分別為S-20161013、S-20161028、S-20161103。平衡和上樣過程的線性流速均為150 cm／h，洗脫過程的線性流速為250 cm／h。

1.5 質(zhì)量檢測

對3 批破傷風(fēng)抗毒素及相應(yīng)3 批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2進行質(zhì)量檢測。

1.5.1 蛋白質(zhì)含量 按照《中國藥典》三部（2020版）［1］附錄通則0731 蛋白質(zhì)含量測定法第一法檢測制品的蛋白質(zhì)含量，破傷風(fēng)抗毒素及馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的蛋白質(zhì)含量應(yīng)分別不高于100 和50 mg／mL。

1.5.2 分子大小分布 采用分子排阻色譜法測定樣品的聚合物含量及F（ab′）2含量［7］，色譜柱為Superdex 200 Increase 10／300 GL 凝膠過濾預(yù)裝柱，流動相為50 mmol／L PB+0.15 mol／L NaCl（pH 7.0）。樣品蛋白濃度為2～2.5 mg／mL，進樣量為60 μL，檢測波長為280 nm，線性流速為30 cm／h，檢測時長為70 min，按照面積歸一化法計算色譜圖中F（ab′）2、完整IgG 和聚合物的相對含量。破傷風(fēng)抗毒素及馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的聚合物總和均應(yīng)不高于5%。

1.5.3 純度 參照《中國藥典》三部（2020 版）［1］附錄通則0541 電泳法中的第五法，采用7.5% SDSPAGE 分析樣品的純度，破傷風(fēng)抗毒素及馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的IgG 含量應(yīng)不高于5%，F(xiàn)（ab′）2含量應(yīng)不低于70%。

1.5.4 效價 按照《中國藥典》三部（2020 版）［1］附錄通則3508 破傷風(fēng)抗毒素效價測定法測定效價，馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2和破傷風(fēng)抗毒素的效價均應(yīng)不低于2000 IU／mL。

1.5.5 比活性 每1 g 蛋白質(zhì)所含的抗體總效價即為比活性。按照《中國藥典》三部（2020 版）［1］提供的公式計算馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2和破傷風(fēng)抗毒素的比活性［比活性（IU／g）= 效價（IU／mL）／ 蛋白質(zhì)含量（mg／mL）× 1000］。破傷風(fēng)抗毒素及馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的比活性應(yīng)分別不低于45000和75000 IU／g。

1.6 穩(wěn)定性評價 將1.4 項制備的馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2按1 mL／瓶分裝，置（25± 2）℃保存，于保存1、2、3、6 個月時取樣，分別按1.5.3 項方法測定效價。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)量檢測結(jié)果

2.1.1 蛋白質(zhì)含量 S-20161013、S-20161028、S-20161103 批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的蛋白質(zhì)含量分別為20.4、19.5、20.2 mg／mL，均值為20.03 mg／mL；M-20160302、M-20160303、M-20160304 批破傷風(fēng)抗毒素的蛋白質(zhì)含量分別為46.1、45.3、45.4 mg／mL，均值為45.6 mg／mL。前者的蛋白質(zhì)含量均遠(yuǎn)小于后者，降低了56%。

2.1.2 分子大小分布 3 批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2和3 批破傷風(fēng)抗毒素的F（ab′）2含量均值分別為91.84%和91.02%，含量變化較小；聚合物含量均值分別為1.22%和2.92%，前者比后者下降了59%。見表1。3 批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的分子大小分布圖譜重合度較高，見圖1。

圖1 馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2 和破傷風(fēng)抗毒素的分子大小分布圖譜Fig.1 Molecular size distribution map of equine tetanus immunoglobulin F（ab ′）2 and TAT

表1 分子大小分布的檢測結(jié)果（%）Tab.1 Detection result of molecular size distribution（%）

2.1.3 純度 經(jīng)7.5% SDS-PAGE 分析，3 批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2和3 批破傷風(fēng)抗毒素于相對分子質(zhì)量約100000 處可見F（ab′）2條帶，但前者比后者的小分子雜質(zhì)含量少。S-20161013、S-20161028、S-20161103 批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的F（ab′）2含量分別為90.7%、91.5%、94.3%，M-20160302、M-20160303、M-20160304 批破傷風(fēng)抗毒素的F（ab′）2含量分別為89.2%、89.5%、90.8%；兩者的IgG 含量均為0。見圖2。

圖2 馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2 及破傷風(fēng)抗毒素的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE profile of equine tetanus immunoglobulin F（ab′）2 and TAT

2.1.4 效價 S-20161013、S-20161028、S-20161103批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的效價分別為3800、3500、3900 IU／mL，均值為3733 IU／mL；M-20160302、M-20160303、M-20160304 批破傷風(fēng)抗毒素的效價分別為2500、2600、2500 IU／mL，均值為2533 IU／mL。前者效價比后者提高了47%。

2.1.5 比活性 S-20161013、S-20161028、S-20161103批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的比活性分別為186275、179487、193069 IU／g，均值為186277 IU／g；M-20160302、M-20160303、M-20160304 批破傷風(fēng)抗毒素的比活性分別為54229、57395、55066 IU／g，均值為55563 IU／g。前者的比活性比后者提高了335%。

2.2 穩(wěn)定性 馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2于（25 ±2）℃放置6 個月后，效價均在合格范圍之內(nèi)，見表2。

表2 馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2 的穩(wěn)定性檢測結(jié)果Tab.2 Stability test result of equine tetanu immunoglobulin F（ab′）2

3 討論

破傷風(fēng)抗毒素的臨床應(yīng)用非常廣泛，作為預(yù)防和治療破傷風(fēng)感染的特殊藥品，進入體內(nèi)與血液中的游離毒素結(jié)合后被機體免疫系統(tǒng)清除而發(fā)揮作用［8］。馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2作為破傷風(fēng)抗毒素的升級產(chǎn)品，與破傷風(fēng)抗毒素相比，蛋白質(zhì)含量大幅降低，同時效價和比活性得到了較大提高，聚合物也得到了大幅降低。兩者同屬于動物源性制品，對于人體而言是外源性蛋白，輸入人體不良反應(yīng)發(fā)生率較高［9-10］，輸入外源性蛋白的總量越多則發(fā)生不良反應(yīng)的發(fā)生率也越高［11］。另外，據(jù)有關(guān)文獻報道，聚合物含量可能是影響不良反應(yīng)發(fā)生的因素之一［12］，馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2與破傷風(fēng)抗毒素比較，蛋白質(zhì)含量和聚合物含量大幅降低，進一步降低了發(fā)生不良反應(yīng)的發(fā)生率［13］。本實驗采用免疫親和層析法制備的馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2，其蛋白質(zhì)含量和聚合物含量更低，因此發(fā)生不良反應(yīng)的可能性較破傷風(fēng)抗毒素更小。

李景玉等［14］在專利申請中采用DEAE 柱層析純化的馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2比活性為80000 ～100000 IU ／g；楊俊杰等［7］采用辛酸沉淀結(jié)合DEAE柱層析技術(shù)純化馬IgG，比活性為60000～80000 IU／g；ZHANG 等［15］采用兩步鹽析加一步蛋白G 親和層析制備的馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2片段，比活性為90000 IU／g。綜上所述，增加一步層析步驟均可提高馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的比活性，但上述層析方法均是非特異性方法，因此比活性提高幅度較低。本研究采用的免疫親和層析技術(shù)屬于特異性方法，純化過程中收集的均是具有中和活性的目的蛋白，因此獲得馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2的比活性平均值可達186277 IU／g，遠(yuǎn)高于其他方法。本研究純化過程中去除的主要是無中和活性的雜蛋白，純化后目的蛋白收率范圍為40% ～ 60%，在今后的大規(guī)模生產(chǎn)中會導(dǎo)致從馬血漿中提取蛋白效價的總收率下降，基于獲得更高比活性的馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2，收率下降是可以接受的。

親和層析是分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子特異而有效的層析技術(shù)，分離過程簡單、快速，分辨率高，具有高度的選擇性、分辨率和優(yōu)良的載量［16-17］。與其他層析技術(shù)相比，免疫親和層析技術(shù)更具專一性、高效性、特異性［18-19］。本實驗采用免疫親和層析法制備馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2，可進一步降低聚合物含量和制品的蛋白含量，從而得到高效價和高比活性的破傷風(fēng)馬免疫球蛋白F（ab′）2制劑。本研究穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示，采用免疫親和層析制備的馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2于（25 ± 2）℃放置6 個月，效價均在合格范圍之內(nèi)，穩(wěn)定性較好。本研究為馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F（ab′）2制劑及同類產(chǎn)品的制備提供了新的思路。