李承積，俞 淵，甘苡榕，龐澆安，楊 文

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣西 南寧 530023）

肝內(nèi)膽管結(jié)石被稱為膽管良性疾病中的“不治之癥”，是引起膽管化膿性炎癥、膽管癌的重要因素，多發(fā)于中國(guó)、日本、韓國(guó)等亞太國(guó)家和地區(qū)［1］。肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病機(jī)制與諸多因素相關(guān)，較為復(fù)雜，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究已證實(shí)肝內(nèi)膽管結(jié)石形成與膽道感染的相關(guān)性［2］。膽道感染主要是以革蘭氏陰性菌感染為主，而革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要組成部分，LPS 可通過(guò)Toll 樣受體4（toll-like receptors TLR4）信號(hào)途徑激活下游NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells）和MAPK（mitogen-activated protein kinase）信號(hào)通路參與炎癥反應(yīng)［3］。持續(xù)性炎性損傷可導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞（bile duct epithelia cells，BDECs）增殖，改變膽管樹(shù)內(nèi)膽汁流，引起致石性膽汁的形成和分泌［4］。

大黃靈仙方是唐乾利教授防治肝內(nèi)膽管結(jié)石的經(jīng)驗(yàn)方，長(zhǎng)期臨床及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，該方可降低致石性膽汁的形成，并通過(guò)調(diào)控NF-κB/MAPK 信號(hào)通路關(guān)鍵下游因子，緩解膽道炎癥反應(yīng)［5，6］。細(xì)胞骨架纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）作為維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要結(jié)構(gòu)，在炎癥反應(yīng)中參與上皮連接的破壞和通透性屏障的形成［7］。調(diào)節(jié)NF-κB/MAPK 信號(hào)通路是否會(huì)引起F-actin 的改變并使膽管上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常變化，從而能影響結(jié)石的形成啟人深思。因此，本研究基于F-actin 水平，采用LPS誘導(dǎo)的膽管炎癥細(xì)胞模型，聯(lián)合免疫印跡及激光共聚焦檢測(cè)技術(shù)，觀察在不同信號(hào)通路處理及大黃靈仙方干預(yù)下的膽管上皮細(xì)胞骨架蛋白F-actin 改變，以完善大黃靈仙方緩解膽管炎癥治療肝內(nèi)膽管結(jié)石的機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SD 大鼠膽管上皮細(xì)胞（上海細(xì)胞庫(kù)）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)分別為（C11885500BT ；A3161002）；羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（Solarbio ，CA1610-300T）；LPS（脂多糖，sigma）；0.25% 胰 蛋 白 酶-0.02% 乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA）溶液（批號(hào)：25200056 公司：Gibco）；磷酸鹽緩沖液PBS（批號(hào)：P1022-500），水為超純水。

1.2 儀器

BSC-1300ⅡB2 型生物安全柜（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；5410 型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；371 型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；激光共聚焦掃描顯微鏡（日本Olympus 公司，F(xiàn)V3100）；IX71 型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)

在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和溫度條件下用含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞分組及干預(yù)

將培養(yǎng)好的膽管上皮細(xì)胞分別接種于9 個(gè)3 cm×3 cm 激光共聚焦培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%后，分別用藥干預(yù)，見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞的用藥干預(yù)Tab 1 Drug intervention of each group of cells

1.5 觀察各組膽管上皮細(xì)胞骨架重排情況

鬼筆環(huán)肽工作液配制取原液10 μL，加20 μL BSA 和2 mL PBS 稀釋染色；用PBS 洗細(xì)胞2 次，用2.5% 的戊二醛固定液固定細(xì)胞15 min，PBS 洗3次，每次3 min；0.5%Trito-X-100 室溫通透20 min，PBS 洗3 次，每次3 min。取300 μL 的TRIT 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液，室溫避光孵育30 min 后PBS 洗2次；用200 μL 的DAPI 核染3 min，PBS 洗2 次，共聚焦激光掃描顯微分析結(jié)果。采用ImageJ 6 軟件對(duì)各組圖片進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

1.6 Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞骨架蛋白F-actin 表達(dá)情況

細(xì)胞的總蛋白經(jīng)全蛋白試劑提取盒提取，蛋白濃度經(jīng)BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，予SDSPAGE 電泳后，凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，予5%脫脂牛奶封閉后，予F-actin 一抗4 ℃孵育過(guò)夜，3 次1×TBST 漂洗后，分別加入抗兔/鼠IgG 二抗（HRP 標(biāo)記），孵育1 h 于室溫下，經(jīng)1×洗滌后，予ECL 發(fā)光劑顯影，最后經(jīng)Image J 軟件分析條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)輸入SPSS20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組間比較采用單因素方差分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽管上皮細(xì)胞各組形態(tài)變化

在光學(xué)顯微鏡下觀察到正常膽管上皮細(xì)胞貼壁單層生長(zhǎng)，細(xì)胞外形不規(guī)則，細(xì)胞胞體較大，可見(jiàn)深褐色細(xì)胞核；LPS 干預(yù)后，與圖A 相比細(xì)胞形態(tài)改變，胞體明顯變圓變小，大量脫落，漂浮于液面；大黃靈仙方干預(yù)后，與圖B 相比，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，外形不規(guī)則，胞體膨大，細(xì)胞核明顯可見(jiàn)；通路阻制劑干預(yù)后，細(xì)胞脫壁死亡增多；大黃靈仙方干預(yù)后，各組細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)，脫壁較少。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同干預(yù)后各組細(xì)胞形態(tài)圖（4×20 倍數(shù)顯微鏡下觀察）Fig 1 Cell morphology of each group after different intervention（observed under 4×20 microscope）

2.2 細(xì)胞骨架圖片

共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)，正常組細(xì)胞核（藍(lán)色）完整，包膜清晰可見(jiàn)，細(xì)胞骨架（紅色熒光）成絲狀；LPS 干預(yù)后細(xì)胞核皺縮或破損，骨架絲狀斷裂或成團(tuán)；大黃靈仙方干預(yù)后，細(xì)胞核皺縮減少，細(xì)胞骨架少量成團(tuán)；通路阻制劑干預(yù)后，細(xì)胞核皺縮明顯，細(xì)胞骨架均有不同程度的斷裂，微絲排列紊亂；大黃靈仙方干預(yù)后，細(xì)胞核皺縮不明顯，微絲排列部分整齊。結(jié)果見(jiàn)圖2～4。

圖2 細(xì)胞骨架圖FIg 2 Cytoskeleton diagram

圖3 通路阻制劑干預(yù)后細(xì)胞骨架圖Fig 3 Cytoskeleton after intervention with pathway blocking agents

2.3 熒光強(qiáng)度

圖4 大黃靈仙方+通路阻制劑干預(yù)后細(xì)胞骨架圖Fig.4 Cytoskeleton diagram of RHUbarb Lingxianfang +pathway blocking preparation after intervention

（1）由表2 可見(jiàn)，與正常組（組A）相比，模型組（LPS 組）熒光強(qiáng)度明顯減弱（t=5.816，P=0.004）。（2）與模型組（LPS 組）相比，LPS+中藥組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（t=5.381，P=0.006）；LPS+PDTC 組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（t=9.021，P=0.001）；LPS+SB203580 組熒 光 強(qiáng) 度 增 強(qiáng)（t=13.798，P=0.000）；LPS+PDTC+SB203580 組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（t=15.520，P=0.000）；LPS+PDTC+中藥組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（t=9.643，P=0.000）；LPS+SB203580+中藥組熒光強(qiáng) 度 增 強(qiáng)（t=9.160，P=0.001）；LPS+PDTC+SB203580+中藥組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（t=3.613，P=0.023）；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組F-actin 熒光強(qiáng)度（±s，n=3）Tab 2 Fluorescence intensity of F-actin in each group（±s，n=3）

表2 各組F-actin 熒光強(qiáng)度（±s，n=3）Tab 2 Fluorescence intensity of F-actin in each group（±s，n=3）

注：與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05。

組別正常組LPS 組LPS+中藥組LPS+PDTC 組LPS+SB203580 組LPS+PDTC+SB203580 組LPS+PDTC+中藥組LPS+SB203580+中藥組LPS+PDTC+SB203580+中藥組熒光強(qiáng)度18.80±3.09 8.09±0.79*19.57±3.61△15.66±1.22△19.27±1.16△25.95±1.83△22.21±2.41△26.55±3.40△21.25±6.26△

（3）與LPS+中藥組相比，LPS+SB203580+中藥組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.438，P=0.071）；LPS+PDTC+SB203580+中藥組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.403，P=0.708）；余下各組熒光強(qiáng)度均較模型組有不同程度增強(qiáng)。

2.4 Western Blot 檢測(cè)F-actin 骨架蛋白表達(dá)情況

（1）與正常組相比，LPS 組F-actin 蛋白表達(dá)明顯減少（t=6.473，P=0.003）。

（2）與LPS 組相比，LPS 組+中藥組F-actin 蛋白 表 達(dá) 明 顯 增 加（t=10.624，P＜0.05）；LPS+PDTC+中藥組F-actin 蛋白表達(dá)明顯增加（t=7.639，P=0.002）；LPS+SB203580+中藥組F-actin蛋白表達(dá) 明 顯增加（t=7.243，P=0.002）；LPS+PDTC+SB203580+中藥組F-actin 蛋白表達(dá)明顯增加（t=3.685，P=0.021）；其余各組F-actin 蛋白表達(dá)與LPS 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

（3）與中藥組相比，LPS+PDTC+中藥組、LPS+SB203580+ 中 藥 組 、 LPS+PDTC+SB203580+中藥組F-actin 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3 及圖2。

表3 各組F-actin 骨架蛋白的表達(dá)（±s，n=3）Tab 3 Expression of F-actin skeleton protein in each group（±s，n=3）

表3 各組F-actin 骨架蛋白的表達(dá)（±s，n=3）Tab 3 Expression of F-actin skeleton protein in each group（±s，n=3）

注：與正常組相比，*P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05。

組別正常組LPS 組LPS+中藥組LPS+PDTC 組LPS+SB203580 組LPS+PDTC+SB203580 組LPS+PDTC+中藥組LPS+SB203580+中藥組LPS+PDTC+SB203580+中藥組F-actin 蛋白含量0.526 3±0.063 1 0.286 1±0.012 2*1.404 9±0.182 0△0.364 6±0.018 4 0.273 7±0.0452 3 0.306 4±0.032 5 1.426 2±0.258 2△1.540 9±0.299 8△1.143 6±0.402 9△

圖5 各組細(xì)胞F-actin 蛋白表達(dá)情況Fig 5 Expression of F-actin protein in each group

3 討論

由微管、微絲和中間纖維構(gòu)成的細(xì)胞骨架是細(xì)胞的主要結(jié)構(gòu)，其中細(xì)胞骨架的主要構(gòu)成蛋白是Factin，也是細(xì)胞外信號(hào)啟動(dòng)和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)時(shí)的首要靶蛋白，其參與細(xì)胞維穩(wěn)、運(yùn)動(dòng)、收縮、黏附、增殖和凋亡等多種行為，節(jié)細(xì)胞通透性的重要機(jī)制［8］。細(xì)胞骨架能夠通過(guò)改變形狀或移動(dòng)來(lái)對(duì)環(huán)境做出反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞遭受到炎癥等惡性刺激時(shí)，F(xiàn)-actin 會(huì)發(fā)生重組和再分布，細(xì)胞周邊F 肌動(dòng)蛋白環(huán)斷裂，細(xì)胞中央出現(xiàn)大量呈束狀密集排列的應(yīng)力纖維，導(dǎo)致細(xì)胞中心張力增高，可加速細(xì)胞收縮，最終引起凋亡壞死的結(jié)局，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)［9，10］。

有關(guān)研究表明，NF-κB/MAPK 炎癥信號(hào)通路的激活主要從以下兩方面對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行影響。一方面，MAPK 信號(hào)通路不僅能夠通過(guò)過(guò)度磷酸化MAPs 的方式來(lái)降低微管的穩(wěn)定性，還能通過(guò)調(diào)節(jié)其它蛋白如DOC1R/MRP14 的磷酸化影響微管的穩(wěn)定性［11］。另一方面，細(xì)胞在炎癥等外界因素的刺激下，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，經(jīng)MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進(jìn)一步促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 活化，活化后的NFκB 進(jìn)入細(xì)胞核中，加速TNF-a、IL-6 等炎癥因子釋放，導(dǎo)致F-actin 大量解聚［10］。除此以外，藥物調(diào)控炎癥信號(hào)通路對(duì)不同細(xì)胞骨架的變化在文獻(xiàn)中均有報(bào)道，如淫羊藿苷通過(guò)抑制細(xì)胞骨架相關(guān)因子RhoA 和Cofilin 的mRNA 表 達(dá) 而 保 護(hù)LPS 誘 導(dǎo) 的成骨細(xì)胞F-actin 損傷［12］。巖白菜素通過(guò)抑制NFκB 及MAPKs 通 路 來(lái) 減 少 促 炎 因 子NO、TNF-α、IL-1β 及IL-6 的產(chǎn)生維持巨噬細(xì)胞骨架的穩(wěn)態(tài)［13］。

本課題組基于“炎癥假說(shuō)”長(zhǎng)期進(jìn)行肝內(nèi)膽管結(jié)石的機(jī)制研究，探究大黃靈仙方調(diào)節(jié)膽管炎癥對(duì)肝內(nèi)膽管結(jié)石形成的影響。前期研究表明，大黃靈仙方可以調(diào)控TLR4/NF-κB/MAPK 信號(hào)通路中Myd88、p-p38、TLR4、NF-κB 等蛋白及mRNA 的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)膽管細(xì)胞炎性反應(yīng)［14，15］。該方以“疏肝利膽，攻下排石”為擬方原則，其組成中生大黃［16］和芒硝［17］具有瀉下、抗炎等藥理作用，兩藥共為君藥起攻下導(dǎo)滯、利膽排石之功；金錢草［18］、郁金［19］可通過(guò)抗炎作用保護(hù)膽管上皮細(xì)胞；柴胡［20］中含有的柴胡皂苷a 和d 可抑制脂多糖（LPS）活性；枳殼、澤蘭均具有保肝作用，可減少致石性膽汁的分泌［21］。可見(jiàn)大黃靈仙方具有保肝、調(diào)節(jié)膽道功能、抗炎等功效。

在本研究中，課題組通過(guò)觀察炎癥狀態(tài)及不同通路阻制劑干預(yù)下細(xì)胞骨架蛋白的變化，以完善大黃靈仙方緩解膽管炎癥治療肝內(nèi)膽管結(jié)石的分子機(jī)制。研究結(jié)果表明，LPS 干預(yù)后膽管上皮細(xì)胞出現(xiàn)F-actin 含量減少，肌絲排列紊亂、斷裂的情況，而大黃靈仙方干預(yù)后有所好轉(zhuǎn)，尤其是聯(lián)合了通路阻制劑后，F(xiàn)-actin 含量提高，肌絲排列趨于整齊，可見(jiàn)大黃靈仙方可恢復(fù)炎癥狀態(tài)下膽管上皮細(xì)胞骨架的排列順序，保護(hù)其微絲結(jié)構(gòu)。表明了大黃靈仙方可能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB/MAPK 炎癥通路，緩解膽管細(xì)胞炎癥，修復(fù)并維持細(xì)胞骨架的完整性。而F-actin 骨架蛋白的變化與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，膽管炎癥的發(fā)生與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間的分子機(jī)制研究將是課題組下一步的研究方向。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

李承積：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施，執(zhí)筆；俞淵：實(shí)驗(yàn)實(shí)施；甘苡榕、龐澆安：實(shí)驗(yàn)評(píng)估；楊文：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及審校。

文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。