張宇昕，孫紅梅，蓋 聰，程翠翠，楊璐平，郭振宇，高譽珊，胡 蝶

（北京中醫(yī)藥大學良鄉(xiāng)校區(qū)，北京 102488）

抑郁癥是一種廣泛存在的慢性精神疾病，可以影響思維、情緒和身體健康，特征是情緒低落、缺乏活力、失眠并且伴有其他軀體癥狀，嚴重時導致認知功能損害［1，2］。目前全球抑郁癥的患病率已超過3.5 億，2008 年WHO 將嚴重抑郁癥列為全球第三大疾病負擔原因，并預計到2030 年抑郁癥將成為首要導致人類患病和死亡的危險因素［3］。抑郁癥的病因至今仍不完全清楚，大麻素受體1（cannabinoid receptor 1，CB1）屬于內(nèi)源性大麻素受體之一，在大腦中廣泛分布，主要存在于神經(jīng)元突觸前膜，大量實驗及臨床研究表明內(nèi)源性大麻素是突觸可塑性和功能的重要調(diào)節(jié)因子，與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)［4］。離子型谷氨酸受體α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異丁唑基丙酸受體可介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞，AMPA 受體亞基1（glutamate receptor 1，GluA1）主要存在于突觸后膜，參與突觸可塑性調(diào)節(jié)，其表達異常是多種精神疾病的常見機制［5］。

慢性不可預見性溫和應激（chronic unpredictability mild stress，CUMS）被廣泛用于抑郁癥動物模型的建立，其主要是通過模擬人類受到慢性壓力與刺激，從而產(chǎn)生抑郁樣行為［6］。因此，在本實驗中對大鼠采取CUMS 造模，篩選出較為穩(wěn)定的CUMS造模時間，并通過檢測大鼠大腦內(nèi)側(cè)前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）腦區(qū)中突觸體中大麻素受體CB1 和GluA1 蛋白表達水平，探討應激導致的抑郁與mPFC 腦區(qū)中CB1 和GluA1 蛋白的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague-Dawley（SD）大 鼠30 只，雄 性，體 重220～240 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011。在北京中醫(yī)藥大學SPF 動物實驗中心飼養(yǎng)，許可證號為SYXK（京）2016-0038。動物房恒溫（23±2）℃，相對濕度為50%～60%，采用12 h 晝夜節(jié)律控制（8∶00～20∶00）。本研究經(jīng)過北京中醫(yī)藥大學實驗動物福利倫理委員會審查，并按實驗動物使用的3R 原則，符合國家實驗動物福利倫理相關(guān)規(guī)定，倫理審查編號：BUCM-4-2020080301-3004。

1.2 主要試劑和儀器

兔 多 克 隆 抗 體CB1（ImmunoWay，YT0687，1∶2 000）；兔多克隆抗體GluA1（abcam，ab31232，1∶2 000）、GAPDH（abcam，ab9485，1∶2 000）；Tanon-4500 化學發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.3 動物分組及模型建立

實驗前動物適應性飼養(yǎng)7 d 后按隨機數(shù)字表法將大鼠分為3 組，對照組、3 周模型組、4 周模型組每組各10 只。

1.3.1 3 周模型組 給予3 周CUMS 建立抑郁癥模型，每天選取一種長應激和一種短應激，同種應激不連續(xù)出現(xiàn)，防止動物產(chǎn)生適應性。

長應激的應激方法如下：（1）禁食：24 h 內(nèi)不給大鼠提供飼料；（2）禁水：24 h 內(nèi)將大鼠籠上水瓶拿掉或放置無水空瓶；（3）擁擠：將標準大鼠籠中放入15～20 只大鼠，不同組大鼠的尾部采用不同顏色的記號筆標記以區(qū)分，持續(xù)時間為24 h；（4）傾斜：將標準大鼠籠傾斜45 °放置，持續(xù)時間為24 h；（5）持續(xù)光照：給予大鼠飼養(yǎng)室24 h 持續(xù)燈光。

短應激的應激方法如下：（1）冰水游泳5 min：將大鼠放入裝有4 ℃的冰水桶中，水深約45 cm，需保證大鼠鼠尾不能觸底為準。（2）夾尾60 s：將大鼠放入固定裝置中暴露尾巴，用夾子夾住距尾跟1 cm處，以令大鼠發(fā)出叫聲為標準；（3）束縛2 h：將大鼠放入鐵絲網(wǎng)中，需保證大鼠在其中無法移動；（4）頻閃4 h：通過頻閃燈對大鼠進行頻閃，速度為每次1 s；（5）白噪音4 h：通過收音機播放白噪音，音量保持在100 dB。

1.3.2 4 周模型組 給予4 周CUMS 造模。

1.3.3 對照組 正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.4 行為學指標測定

（1）一般行為學觀察：在大鼠存活期內(nèi)，對各組大鼠的一般行為學進行觀察。并對其各項行為學進行檢測。（2）糖水偏愛實驗［7，8］（sucrose preference test，SPT）：3 周模型組自造模開始后第21～23 天進行SPT 實驗，對每只大鼠進行單籠飼養(yǎng)；4 周模型組和對照組自造模開始后第28～30 天進行SPT 實驗。SPT 實驗第1 天為適應期，給予大鼠2 瓶糖水（濃度為1%），第2 天糖水和純水各1 瓶，12 h 后調(diào)換兩水瓶的位置。此階段需檢查水瓶是否漏水，避免正式測試時由于水瓶漏水導致的誤差。第3 天正式測試，對24 h 內(nèi)糖水攝入量和純水攝入量進行稱重，總攝入量=糖水攝入量+純水攝入量。糖水偏愛率=糖水攝入量/總攝入量×100%。并比較總飲水量排除不同大鼠飲水的差異性帶來的影響?？傦嬎?總攝入量（mg）/體重（g）。（3）新穎環(huán)境抑制 攝 食 實 驗［7，8］（novelty inhibited feeding test，NSFT）：3 周模型組自造模開始后第24～25 天進行NSFT 實驗，4 周模型組和對照組自造模開始后第31～32 天進行NSFT 實驗。大鼠禁食24 h 后在曠場中進行測試，曠場中央放置食物，將大鼠自曠場角落放入，并記錄其攝食潛伏期。若10 min 后大鼠未攝食，則攝食潛伏期計為600 s。測試時需保持周圍環(huán)境安靜，測試結(jié)束令大鼠自由攝食，記錄5 min內(nèi)食物消耗量（mg）/大鼠體重（g），排除大鼠的食欲對 實 驗 產(chǎn) 生 的 影 響。（4）強 迫 游 泳 實 驗［7，8］（forced swimming test，F(xiàn)ST）：3 周模型組自造模開始后第26～27 天進行FST 實驗，4 周模型組和對照組自造模開始后第33～34 天進行FST 實驗。強迫游泳實驗容器為透明玻璃缸，水深30 cm，大鼠游泳時尾巴不能觸及桶底，水溫25 ℃。FST 實驗第1 天為適應階段，令大鼠在水中游泳15 min，第2 天正式測試并視頻記錄，時間為5 min，根據(jù)游泳視頻分析大鼠的漂浮不動時間。測試時需保持周圍環(huán)境的安靜，每兩個游泳容器之間需要放置不透明的擋板，使大鼠無法觀察到其他大鼠的情況。（5）實驗流程（圖1）。

圖1 大鼠經(jīng)歷CUMS 后進行行為學測試及取材流程圖Fig 1 Flow chart of behavioral test and sampling after CUMS

1.5 Western blot 實驗

檢測突觸體GluA1 及CB1 蛋白的表達。大鼠斷頭取腦后放入正己烷20 s，驟冷后取出，對mPFC腦區(qū)進行腦組織勻漿。勻漿后下靜置使腦組織充分與緩沖液結(jié)合，離心10 min 取上清繼續(xù)離心30 min，取沉淀溶解于HEPES-Lysis 緩沖液中，靜置30 min 后在4 ℃下25 000g離心30 min，棄去上清獲得突觸體。突觸體用RIPA 裂解液溶解，并用BCA法測定突觸體蛋白的含量。采用SDS-PAGE 凝膠電泳，每道加20 μg 蛋白，電泳至條帶到凝膠底部結(jié)束，恒流250 mA 將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜后封閉液封閉1 h，后加入相應一抗工作液GluA1（1∶2 000），CB1（1∶2 000）孵育4 ℃過夜，TBST 洗脫后孵育與一抗來源相同的二抗1 h。將增強型化學發(fā)光液的兩種底物1∶1 混合，ECL 發(fā)光液均勻加到PVDF 膜上，放入化學發(fā)光儀中曝光。使用Image J 軟件進行灰度值分析。最終表征蛋白水平的數(shù)據(jù)為實驗組的數(shù)值比相應的對照組數(shù)值的比值［9］。

1.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SAS 8.2 進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差（ANOVA）進行統(tǒng)計分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05，雙側(cè)檢驗。實驗結(jié)果以Mean±SEM（±sem）表示。

2 結(jié)果

2.1 行為學結(jié)果

2.1.1 一般行為學的觀察 造模開始前各組大鼠均毛色光滑，飲食飲水正常，體重無明顯差異，活潑喜動，精神狀態(tài)良好。3 周CUMS 后大鼠毛發(fā)粗糙，體重降低。4 周CUMS 造模后大鼠毛色暗淡，精神萎靡，不喜動，嗜睡，體重較對照組大鼠下降。

2.1.2 糖水偏愛實驗結(jié)果 與對照組相比，3 周模型組大鼠糖水偏愛率與總飲水量均無顯著差異。而4 周模型組大鼠的糖水偏愛率較對照組顯著降低（P＜0.05），但兩組的總飲水量無顯著差異（P＞0.05）（表1）。提示4 周CUMS 造模可導致大鼠出現(xiàn)快感缺失癥狀。

2.1.3 新穎抑制攝食實驗結(jié)果 3 周模型組大鼠的攝食潛伏期較對照組大鼠無明顯差異，而4 周模型組大鼠的攝食潛伏期較對照組顯著延長（P＜0.01），3 組大鼠5 min 內(nèi)總食物消耗量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。提示4 周CUMS 后導致大鼠出現(xiàn)焦慮樣行為。

2.1.4 強迫游泳實驗結(jié)果 結(jié)果顯示，3 周模型組大鼠與對照組大鼠在5 min 內(nèi)不動時間無明顯差異，而4 周模型組大鼠在5 min 內(nèi)的不動時間較對照組延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。提示4 周CUMS 造模后可導致大鼠出現(xiàn)絕望行為。

表1 各組大鼠行為學數(shù)據(jù)（±sem，n=10）Tab 1 Behavioral data in each group（±sem，n=10）

表1 各組大鼠行為學數(shù)據(jù)（±sem，n=10）Tab 1 Behavioral data in each group（±sem，n=10）

注：與對照組相比,*P＜0.05,**P＜0.01。

組別對照組3 周模型組4 周模型組5 min 內(nèi)大鼠漂浮不動時間（s）14.80 ± 2.25 26.70 ± 7.79 47.40 ± 9.06**5.53 0.00 FP糖水偏愛率（%）88.78 ± 2.63 79.38 ± 4.59 64.55 ± 8.72*4.31 0.02總飲水量（mg/g）122.90 ± 12.97 102.60 ± 2.10 103.60 ± 3.13 2.16 0.14攝食潛伏期（s）166.20 ± 26.67 216.40 ± 29.85 303.30 ± 36.55*4.91 0.02 5 min 內(nèi)食物消耗量（mg/g）4.60 ± 0.59 4.92 ± 0.45 5.04 ± 0.52 0.19 0.83

2.2 大鼠mPFC 腦區(qū)CB1 和GluA1 蛋白的表達

在mPFC 腦區(qū)中，與對照組大鼠相比，3 周模型組大鼠突觸體中CB1 和GluA1 蛋白表達水平無明顯差異，而4 周模型組CB1 和GluA1 表達水平均明顯降低（P＜0.05）（圖2、表2）。

表2 各組大鼠CB1和GluA1蛋白的相對表達水平（±sem，n=10）Tab 2 Relative expression levels of CB1 and GluA1 protein in each group（±sem，n=10）

表2 各組大鼠CB1和GluA1蛋白的相對表達水平（±sem，n=10）Tab 2 Relative expression levels of CB1 and GluA1 protein in each group（±sem，n=10）

注：與對照組相比，*P＜0.05.

GluA1 0.92 ± 0.05 0.93 ± 0.10 0.67 ± 0.10*2.76 0.08組別對照組3 周模型組4 周模型組FP CB1 0.93 ± 0.04 0.88 ± 0.07 0.65 ± 0.06*6.73 0.00

圖2 各組大鼠PrL 腦區(qū)CB1 和GluA1 蛋白的表達情況Fig 2 Expression of CB1 and GluA1 proteins in PrL brain region of rats in each group

3 討論

抑郁癥的造模存在多種方式：應激模型、手術(shù)模型、藥物模型及轉(zhuǎn)基因模型［10-12］，其中CUMS 造模由于可以模擬人類抑郁的主要癥狀，因而被廣泛應用于抑郁癥相關(guān)機制的研究中［13］。對近十年CUMS 抑郁模型統(tǒng)計后觀察到造模時長通常為3～4 周［14-16］，因此本研究分別采用3 周CUMS 造模和4周CUMS 造模來篩選出最穩(wěn)定的造模時長。觀察到大鼠經(jīng)歷4 周CUMS 后，與對照組相比，糖水偏愛率降低，新穎抑制攝食測試中攝食潛伏期增加，強迫游泳測試中不動時間增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而3 周應激與對照組相比無明顯差異，提示4 周CUMS 造模后大鼠產(chǎn)生明顯的抑郁和焦慮樣行為，大鼠抑郁模型造模成功。

mPFC 腦區(qū)參與了多種精神疾病的發(fā)病過程，其腦區(qū)體積減小、突觸結(jié)構(gòu)及功能的改變，腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元萎縮和均與抑郁癥［17，18］，課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)mPFC 腦區(qū)內(nèi)mPFC 腦區(qū)中GABA 能神經(jīng)元功能異常與慢性應激導致的抑郁相關(guān)［7］。mPFC 是皮層中負責執(zhí)行功能的主要區(qū)域，當其功能受損時，與情緒障礙相關(guān)的情緒加工、認知表現(xiàn)、神經(jīng)傳遞、自主調(diào)節(jié)和神經(jīng)內(nèi)分泌反應障礙［19］。在實驗研究中可觀察到mPFC 腦區(qū)損傷大鼠的應激易感性較正常大鼠增加，其機制可能是由于涉及神經(jīng)內(nèi)分泌和自主反應的大腦區(qū)域的激活［20］。因此，本研究主要通過觀察慢性應激對大鼠mPFC 腦區(qū)內(nèi)CB1和GluA1 蛋白表達水平的影響。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)因參與多種不同的大腦生理過程（包括情緒、動機和認知功能的調(diào)節(jié)）而受到越來越多的關(guān)注，內(nèi)源性大麻素的產(chǎn)生能夠促進神經(jīng)可塑性［21］。此外動物和臨床研究表明，內(nèi)源性大麻素信號傳導功能障礙會產(chǎn)生類似抑郁的行為［22］。內(nèi)源性大麻素的活性可通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CB1 受體進行調(diào)節(jié)，在抑郁癥患者的PFC 腦區(qū)中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性大麻素濃度和CB1 受體的結(jié)合親和力及其密度的變化［23］。本實驗也證實了大鼠經(jīng)4 周CUMS 后誘導的抑郁模型大鼠發(fā)病與mPFC 腦區(qū)CB1 表達水平降低有關(guān)。

神經(jīng)元之間突觸傳遞強度的變化對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息處理至關(guān)重要，離子型谷氨酸受體AMPA 受體介導了哺乳動物大腦中的大部分快速興奮性突觸傳遞。AMPA 受體可快速地插入以及移出突觸后膜，這種動態(tài)轉(zhuǎn)運方式被認為是突觸可塑性、學習和記憶的主要機制［24］。GluA1 作為AMPA 受體亞基，存在于興奮性突觸的突觸后膜中，參與突觸可塑性調(diào)節(jié)，其表達異常是抑郁癥、精神分裂癥和慢性藥物成癮等精神疾病的常見機制［25］。本實驗也證實了大鼠經(jīng)4 周CUMS 后誘導的抑郁模型大鼠發(fā)病與mPFC 腦區(qū)GluA1 水平降低，從而影響突觸可塑性。

研究發(fā)現(xiàn)，CB1 可能與谷氨酸能信號傳導有關(guān)，在酒精依賴并抑郁癥動物模型中，抗抑郁藥治療的中止會導致PFC 腦區(qū)CB1 受體表達下降以及谷氨酸受體GluN1、GluA1、和mGlu5 表達異常［26］。在大鼠青春期腹腔注射CB1 受體拮抗劑AM251 會導致谷氨酸受體亞基的表達異常，從而影響谷氨酸神經(jīng)元的成熟［27］。 注射四氫大麻酚會導致大鼠腳橋核中AMPA 亞基組分的變化，以及引發(fā)長時程抑制（long term depression，LTD）作用，導致突觸可塑性的變化，而此過程可被AM251 逆轉(zhuǎn)［28］。然而尚未發(fā)現(xiàn)有報道闡明在抑郁癥中CB1 如何影響谷氨酸能信號傳導及突觸可塑性。

綜上所述，采用4 周慢性應激建立的抑郁癥動物模型更加穩(wěn)定。此外，本研究從基礎(chǔ)研究的角度探討mPFC 腦區(qū)中CB1 和GluA1 表達異常影響與慢性應激導致的抑郁相關(guān)，為今后抑郁癥的研究和治療提供了新的思路。

作者貢獻度說明：

張宇昕：進行實驗操作、數(shù)據(jù)收集處理及撰寫文章；孫紅梅：寫作審查和監(jiān)督；蓋聰、程翠翠：數(shù)據(jù)分析；楊璐平、郭振宇、高譽珊：參與了實驗的執(zhí)行；胡蝶：負責提出實驗方案、文章修改。所有作者都設(shè)計了實驗、撰寫了手稿并修改了論文。