鐘鎮(zhèn)康，周曉玲，王月明，吳 騰，陸世銀，沈新輝

（1.廣西中醫(yī)藥大學研究生院，廣西 南寧 530001；2.柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545001）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是一種可由多類病因引起的細胞外基質(zhì)在肝組織中過度積累導致肝組織結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生異常的病理變化，是眾多慢性肝病的共同病理改變，也是發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)過程，其實質(zhì)是一種可逆的肝組織損傷的過度修復(fù)［1-5］。目前肝纖維化的西醫(yī)治療方式主要以祛除病因及對癥治療為主，但由于其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多個細胞、細胞因子、蛋白及信號通路等，單一靶標干預(yù)往往療效欠佳，例如使用核苷類似物抗病毒治療，即便已獲得滿意的病毒學效應(yīng)，肝臟炎癥得到有效改善，卻仍然有一部分患者不能完全逆轉(zhuǎn)肝纖維化，且病情仍可呈進行性發(fā)展［6］，對于病因尚不明確的肝纖維化治療顯得更為棘手，肝纖維化如進展至肝硬化失代償期或肝癌等將嚴重威脅患者生命健康［7］，故在病因治療的基礎(chǔ)上，積極有效地抗肝纖維化是阻斷疾病進展不可或缺的環(huán)節(jié)［8］。

中醫(yī)藥治療具有多靶點、多層次、整體調(diào)控作用及不良反應(yīng)相對較少的優(yōu)勢特點而成為抗肝纖維化藥物研究的熱點［9-11］。筆者所在團隊前期實驗研究中表明了濟生腎氣湯可促進移植后干細胞向肝臟歸巢，從而發(fā)揮治療肝硬化作用［12］，在臨床研究中也證實了此方聯(lián)合干細胞治療可降低肝硬化患者的臨床癥狀積分，改善患者肝功能及肝纖維化指標［13］。在前期研究成果的基礎(chǔ)上，筆者發(fā)現(xiàn)采用濟生腎氣湯加上具有活血化瘀消癥散結(jié)功效的三七與鱉甲具有顯著的抗肝纖維化作用，但具體作用機制尚未明確，故本研究建立CCI4誘導的肝纖維化大鼠模型，予中藥灌胃治療，檢測相關(guān)指標，觀察治療后肝纖維化大鼠肝組織病理形態(tài)學變化，探討其具體干預(yù)通路，從而為濟生腎氣湯加三七、鱉甲抗肝纖維化提供更多科學理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF 級雌雄各半SD 大鼠54 只，3~4 周齡，體質(zhì)量（140±10）g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司。實驗動物使用許可證號：SCXK（湘）2019-0014。所有大鼠置養(yǎng)于柳州市中醫(yī)醫(yī)院動物實驗室，室溫保持在20~25 ℃，濕度保持在50%~65%，處于自然光照，予普通飼料及正常飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。實驗大鼠的飼養(yǎng)及實驗過程遵循了國家實驗動物管理條例。

1.2 藥物

濟生腎氣湯加三七、鱉甲（熟地黃40 g、山茱萸20 g、山藥20 g、澤瀉15 g、茯苓15 g、丹皮15 g、肉桂5 g、附子5 g、車前子10 g、牛膝10 g、三七3 g、鱉甲15 g）。以上藥物為農(nóng)本方顆粒制劑，由培力（南寧）藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，將以上藥物顆粒制劑加入純水配制成1.56、3.11、6.22 g/mL 的低、中、高濃度中藥混懸液，放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

試劑：果爾特級初榨橄欖油（西班牙，GB/T23347）；CCl4（天津市富宇精細化工有限公司，GB/T688-2011）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson 三色染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，批號分別為：G1337、G1080、G1100）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒購于南京建成生物工程研究所，批號分別為C009-2-1、 C010-2-1。 Rat （TGF-β、 Ang-Ⅱ 、CHI3L1、IL-1、IL-6、TNF-α）ELISA Kit 購自武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：RA20599、RA20075、RA20662、RA20020、RA20607、RA20035；RNA 提取試劑盒Trizol（Invitrogen，批號：15596026），購自賽默飛世爾科技有限公司。MonScript RTllI All-in One Mix with dsDNase、MonAmp SYBR Green qPCR Mix（莫納生物科技有限公司，批號：MR05101、MQ10101）。主要儀器：高速冷凍離心機（長沙湘銳離心機有限公司，TGD-20MC），超速低溫離心機（美國Sigma 公司），光學顯微鏡Olympus-BH2（日本Olympus 公司），全自動生化分析儀（日本日立7170S），全波長酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號：1510），核酸蛋白定量檢測儀（美國Eppendorf公司，型號：6133），S1000TMTHermal Cycler 基因擴增儀（美國BIO RAD 公司），7500 Real PCR System（美國ABI 公司，型號：4345241）。

1.4 方法

1.4.1 分組與造模 將適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后的大鼠隨機取出10 只作為對照組，其余44 只大鼠采用腹腔注射40%CCl4橄欖油溶液（CCl4與橄欖油體積按2∶3 配備），每周2 次，持續(xù)8 周的方法制作肝纖維化大鼠模型。造模結(jié)束后隨機取4 只大鼠進行肝組織活檢，如出現(xiàn)肝細胞壞死，炎癥細胞浸潤，膠原纖維形成，肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，提示肝纖維化模型制作成功。將造模成功后的大鼠40 只隨機分為模型組、中藥治療（低、中、高濃度）組，每組10 只。

1.4.2 給藥 藥物劑量根據(jù)人與大鼠體表面積換算法計算，藥物溶液體積按1 mL/100 g 給予，中藥治療（低、中、高濃度）組分別予濟生腎氣湯加三七、鱉甲混懸液15.6、31.1、62.2 g/kg 灌胃。對照組及模型組均予等體積蒸餾水灌胃。每天給藥1 次，共4周。灌胃期間不限制大鼠飲食及飲水。

1.4.3 采集標本 灌胃結(jié)束后，隔夜禁食12 h，不限飲水，予10%水合氯醛，按0.5 mL/100 g 劑量予腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動脈采血后靜置1 h，用離心機3 000 r/min 離心10 min，獲得上層血清，?80℃保存?zhèn)溆?。采血結(jié)束后，迅速取出肝臟，采集0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 組織標本，一部分予液氮速凍后置于?90℃冰箱保存，用于RT-PCR 檢測；一部分用10%甲醛固定后，自動脫水機逐級脫水，浸蠟包埋，作0.3 μm 厚度切片，用于染色后肝組織病理形態(tài)學的觀察。

1.4.4 肝組織病理形態(tài)學觀察 將“1.4.3”所得的各組大鼠肝組織切片分別行HE、Masson 染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織炎癥及膠原纖維沉積情況。1.4.5 肝功能檢測 將“1.4.3”所采集的血清采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠ALT、AST 含量。

1.4.6 TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1、IL-1、IL-6、TNF-α含量測定 采用ELISA 法，將“1.4.3”所采集的血清按試劑盒說明書步驟嚴格進行操作，運用酶標儀在450 nm 吸光處讀取OD450值并計算TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1、IL-1、IL-6、TNF-α 含量。

1.4.7 Col-Ⅰ mRNA、Col-Ⅲ mRNA、TGF-β mRNA 表達水平測定 采用RT-PCR 法測定，取“1.4.3”中肝組織30 mg，Trizol 一步法提取總RNA。紫外分光光度計測定所總RNA 濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)成cDNA，隨后以cDNA 為模板進行擴增。qPCR 反應(yīng)體系：SYBR Green qpcr Mix 10 μL，正 反 向 引 物 個 各0.4 μL，cDNA 2 μL，Nuclease-Free Water 7.2 μL。反應(yīng)條件：采用三步法，預(yù)變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、10 s，退火55～65 ℃、10 s，延伸72 ℃、30 s，共41 個循環(huán)。以β-actin為 內(nèi) 參 基 因，采 用2-△△Ct法 計 算Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表 達 水 平。根 據(jù)Genebank 已 知 序 列 進 行Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 引物設(shè)計，引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列號如表1。

表1 各基因引物序列Tab 1 Primer sequences of each gene

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 24.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，作圖使用GraphPad Prism 5，計量資料以（±s）表示，多個樣本間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD-t檢驗，若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCl4致肝纖維化大鼠肝功能的影響

與對照組相比，模型組大鼠ALT、AST 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示造模成功；與模型組對比，中藥各組ALT、AST 水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其中以中藥高劑量組效果最為明顯。見表2。

表2 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCI4致肝纖維化大鼠肝功能指標的影響（U/L，n=10，±s）Tab 2 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on liver function（ALT and AST）of rats with CCI4-induced liver fibrosis（U/L，n=10，±s）

表2 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCI4致肝纖維化大鼠肝功能指標的影響（U/L，n=10，±s）Tab 2 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on liver function（ALT and AST）of rats with CCI4-induced liver fibrosis（U/L，n=10，±s）

注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。

組別對照組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組AST 13.28±4.57 69.54±12.26**55.72±12.29##49.24±13.28##27.73±11.62##39.844 P＜0.01 FP ALT 21.72±7.21 139.00±20.21**108.36±18.83##92.35±22.80##53.08±20.62##60.448 P＜0.01

2.2 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCl4致肝纖維化大鼠肝組織病理形態(tài)學的影響

大鼠經(jīng)腹腔注射40%CCL 48 周后，肝組織病理切片HE、Masson 染色結(jié)果見圖1、2。圖1A 及圖2A 顯示：對照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞索以中央靜脈呈放射狀均勻緊密排列，肝組織未見炎癥及纖維化改變。與對照組相比，圖1B 及圖2B 顯示：模型組大部分肝細胞發(fā)生明顯變性壞死，肝細胞排列紊亂，壞死的肝細胞形成纖維間隔將肝實質(zhì)分成大小不一的肝細胞團，形成假小葉，提示造模成功。與模型組相比，圖1（C、D、E）及圖2（C、D、E）顯示中藥低、中、高劑量組大鼠炎癥及纖維化程度均有不同水平減輕。

圖1 肝組織HE 染色（×10）Fig 1 HE staining of liver tissue（×10）

圖2 肝組織Masson 染色（×10）Fig 2 Masson staining of liver tissue（×10）

2.3 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCl4致肝纖維化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1的影響

與對照組相比，模型組肝纖維化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示造模成功。與模型組相比，中藥各劑量組IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、CHI3L1 水 平 均 有 明 顯 下 降，差 異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中以中藥中、高劑量組干預(yù)效果最為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；對于Ang-Ⅱ而言，中藥中、高劑量組Ang-Ⅱ水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而中藥低劑量組治療效果不明顯（P＞0.05）。見表3、4。

表3 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCI4致肝纖維化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α 的影響（n=10，±s）Tab 3 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and trionyx sinensis on serum IL-1，IL-6 and TNF-α in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

表3 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCI4致肝纖維化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α 的影響（n=10，±s）Tab 3 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and trionyx sinensis on serum IL-1，IL-6 and TNF-α in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

TNF-α組別IL-1 IL-6 29.49±3.88 107.25±13.76**94.64±14.81#79.27±13.55##68.89±17.77##48.004 P＜0.01對照組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組FP 53.51±6.50 111.45±20.18**98.82±14.77#84.97±12.58##78.48±9.96##25.977 P＜0.01 75.69±11.10 129.62±19.12**114.90±14.71#104.16±12.58##89.59±15.45##20.145 P＜0.01

表4 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCI4致肝纖維化大鼠血清TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1 的影響（n=10，±s）Tab 4 Effects of Jisheng Shenqi Decoction on serum TGF-β，Ang-Ⅱand CHI3L1 in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

表4 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCI4致肝纖維化大鼠血清TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1 的影響（n=10，±s）Tab 4 Effects of Jisheng Shenqi Decoction on serum TGF-β，Ang-Ⅱand CHI3L1 in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

CHI3L1 97.10±10.41 418.90±46.80**334.50±57.33#312.80±59.59##259.20±50.94##60.854 P＜0.01組別對照組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組FP TGF-β 92.16±15.52 229.69±26.43**206.07±29.50#190.01±24.98##171.24±21.26##47.711 P＜0.01 Ang-Ⅱ19.13±2.34 178.34±21.43**171.61±22.01 141.36±19.75##125.96±25.10##104.511 P＜0.01

2.4 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCl4致肝纖維化大鼠 肝 組 織Col-ⅠmRNA、Col-Ⅲ mRNA、TGF-β mRNA 表達的影響

與對照組相比，模型組大鼠肝組織中Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組相比，中 藥 中、高 劑 量 組Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表達均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；除TGF-β mRNA 外，中藥低劑量組中Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA 表達也有不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCI4致肝纖維化大鼠肝組織Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表達的影響（n=10，±s）Tab 5 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on the expression of Col-ⅠmRNA，Col-ⅢmRNA and TGF-β mRNA in liver tissue of rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

表5 濟生腎氣湯加三七、鱉甲對CCI4致肝纖維化大鼠肝組織Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表達的影響（n=10，±s）Tab 5 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on the expression of Col-ⅠmRNA，Col-ⅢmRNA and TGF-β mRNA in liver tissue of rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

注：與對照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別Col-ⅠmRNA Col-ⅢmRNA TGF-β mRNA 1.014±0.119 2.491±0.204**2.331±0.280 2.140±0.203##2.088±0.217##74.846 P＜0.01對照組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組FP 0.989±0.229 2.992±0.291**2.697±0.376#2.596±0.392##2.127±0.312##58.073 P＜0.01 0.922±0.146 1.975±0.223**1.756±0.2871#1.668±0.249##1.516±0.273##27.081 P＜0.01

3 討論

肝纖維化根據(jù)其病理特點及臨床表現(xiàn)，隸屬于中醫(yī)學“脅痛”、“積聚”、“臌脹”等范疇?！夺t(yī)宗必讀》曰：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”，《內(nèi)經(jīng)》曰：“溫氣不行，凝血蘊里而不散”，肝纖維化為慢性疾病，病程漫長，久病入絡(luò)，此病基本病機應(yīng)為虛損生積、正虛血瘀［10］，治療總則應(yīng)以補虛扶正，活血化瘀消積為主。仲景提出“血不利則為水”一說，“血不利”主要體現(xiàn)在瘀血狀態(tài)，“水不利”主要體現(xiàn)在水液停聚，此論述內(nèi)涵體現(xiàn)在血與水生理上同源互化，病理上互為因果，交結(jié)為患的密切關(guān)系?！堆C論》：“水病而累血，血病而兼水”、“瘀血化水，亦是血瘀而兼水也”，由此可知，治瘀血亦可從利水調(diào)氣入手。濟生腎氣湯出自宋代醫(yī)家嚴用和《濟生方》，由仲景金匱腎氣丸中桂枝改為肉桂，干地黃改為熟地黃，加車前子、牛膝組合而成，此方具有溫陽化氣，利水消腫之功，主治腎虛腰重水腫，小便不利。此方內(nèi)寓三補三瀉之法，三補以滋補腎陰為主，有“補腎生髓以生肝”之意，大劑滋陰之藥中少佐桂附之品，意在少火生氣，陽得陰助則生化無窮，溫腎補陽化氣以助活血利水，“三瀉”則為澤瀉、車前子、茯苓等滲泄水濕，調(diào)節(jié)氣機，唐容川：“治氣即是治水，治水亦即治氣”、“治血者必調(diào)氣”，故予本方溫補陽氣、益火之源，以施化氣利水，調(diào)暢三焦氣機之效，氣機疏暢，血脈自通，加三七、鱉甲既可消癥散結(jié)，又化瘀不傷正，全方共奏溫陽活血利水，化瘀消癥散結(jié)之功。

ALT、AST 在肝臟中含量最多，主要存在于肝細胞質(zhì)內(nèi)，是反映肝細胞損傷的靈敏指標，本研究結(jié)果顯示，相比對照組而言，模型組大鼠在肝細胞發(fā)生損傷壞死形成肝纖維化時，ALT、AST 在血清中顯著升高（P＜0.01），予濟生腎氣湯加三七、鱉甲干預(yù)后，ALT、AST 顯著降低（P＜0.01），表明濟生腎氣湯加三七、鱉甲可以發(fā)揮保護肝細胞的作用。肝組織病理活檢為診斷肝纖維化的金標準［14］，因其屬于有創(chuàng)操作，具有潛在感染、出血、可重復(fù)性差、操作誤差等特點而未能廣泛用于臨床，肝臟瞬時彈性成像技術(shù)也可因膽汁淤積、肝臟炎癥、脂肪變性及進食等方面而存在一定的檢測誤差，同樣傳統(tǒng)肝纖4 項檢查結(jié)果往往也容易受肝臟炎癥的影響［10］。殼多糖酶3 樣蛋白1（CHI3L1），又稱幾丁質(zhì)酶3 樣蛋白1，是一種與多種肝臟疾病密切相關(guān)的新型血清學標志物，其在肝臟中表達最為豐富，具有高度特異性［15-18］。CHI3L1 與肝纖維化程度呈正相關(guān)，參與肝纖維化的形成主要通過炎癥反應(yīng)、細胞增殖分化，抗細胞凋亡及促進細胞外基質(zhì)重塑等病理過程［19，20］。在評估肝纖維化程度評估方面，CHI3L1 優(yōu)于透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PⅢNP）、層黏連蛋白（LN）、Ⅳ型膠原（CⅣ），擁有較高的肝纖維化診斷價值［21-24］。因此，測量CHI3L1 對于評估肝纖維化療效有一定指導意義。本研究結(jié)果顯示，中藥各劑量組CHI3L1 水平顯著降低，表明濟生腎氣湯加三七、鱉甲可有效改善肝纖維化。繼發(fā)于肝細胞變性壞死的肝細胞再生及纖維組織增生進一步導致血管新生、血栓形成，加重肝細胞損傷及肝臟血液循環(huán)障礙［25］，肝竇血管病變及細胞外基質(zhì)在肝臟中過度沉積表現(xiàn)符合中醫(yī)“瘀血”本質(zhì)特點［10］，本方所加三七、鱉甲兩者合用具有活血化瘀、軟堅散結(jié)之效，兩者可通過抑制HSC 活化、促進細胞外基質(zhì)降解等多種途徑發(fā)揮顯著抗肝纖維化作用［26-29］。

研究表明，人體肝臟中也存在腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RASS），RASS 可參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［30］，其中ACE-Ang-Ⅱ-AT1R 軸是促進肝纖維化形成的重要傳導通路，當肝臟受損時，RASS中如Ang-Ⅱ、AT1R 等成分會上調(diào)或重新分布，例如在肝纖維化時，Ang-Ⅱ含量明顯增多［31］，且與肝纖維化程度呈正相關(guān)。ACE 將Ang-Ⅰ裂解成Ang-Ⅱ，Ang-Ⅱ作為RASS 中最重要的活性物質(zhì)之一，具有顯著的促炎及促纖維化作用，既參與炎癥反應(yīng)，又 能激活HSC 促進TGF-β、TNF-α、IL 等細胞因子釋放［32，33］，上述細胞因子反過來又可持續(xù)刺激HSC 增 殖活化并增 加ECM 的生成［34-40］，HSC 活化作為肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，HSC 大量增殖，發(fā)生表型轉(zhuǎn)變分化為肌成纖維細胞，分泌ECM，ECM 生成過多，降解相對較少，在肝組織中過度沉積而導致肝纖維化形成。此外，Ang-Ⅱ還可通過AT1R 激活HSC，上調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF-β mRNA的表達［41，42］。有 研究表明，通過使 用AT1R 拮抗藥或ACE 抑 制 劑 可 發(fā) 揮 抑 制 肝 纖 維 化 作 用［30，43］。TGF-β 是調(diào)節(jié)ECM 生成與沉積最重要的細胞因子之一，其可促使HSC 活化，并能促進Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達，具有明顯的促肝纖維化作用［44，45］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組肝纖維化大鼠血 清 中 的Ang-Ⅱ、TGF-β、IL-1、IL-6、TNF-α 水 平均顯著升高（P＜0.01），經(jīng)予濟生腎氣湯加三七、鱉甲干預(yù)后，Ang-Ⅱ、TGF-β、IL-1、IL-6、TNF-α 水平均發(fā)生降低，表明濟生腎氣湯加三七、鱉甲可作用于ACE-Ang-Ⅱ-AT1R 軸，降 低Ang-Ⅱ、TGF-β 含量，進而減少IL-1、IL-6、TNF-α 等相關(guān)細胞因子的生成。Ⅰ、Ⅲ型膠原作為ECM 主要成分參與肝臟纖維組織結(jié)構(gòu)的形成，本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組肝纖維化大鼠肝組織中的Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表達明顯上升（P＜0.01），經(jīng)予濟生腎氣湯加三七、鱉甲干預(yù)后，以上基因表達均有不同程度水平下降，表明濟生腎氣湯加三七、鱉甲可調(diào)節(jié)ECM 生成與降解的平衡，抑制ECM 沉積，促進ECM 降解從而減輕肝纖維化。

綜上所述，濟生腎氣湯加三七、鱉甲可改善肝臟纖維化，其具體作用機制可能與改善肝臟炎癥壞死，調(diào)控ACE-Ang-Ⅱ-AT1R 信號轉(zhuǎn)導通路后使相關(guān)細胞因子水平下降，HSC 活化增殖減少，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β 等基因表達發(fā)生下調(diào)，減少ECM 在肝組織中的過度生成與堆積等方面有關(guān)。

作者貢獻度說明：

鐘鎮(zhèn)康：設(shè)計及完成實驗、指標檢測、論文撰寫、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；王月明、吳騰、沈新輝：協(xié)助完成實驗；周曉玲、陸世銀：實驗指導及論文修改。

本文作者均聲明不涉及相關(guān)利益沖突。