李 瀟，高彥華,2，彭忠利,2，郭春華,2，王 琦，梁 紅，王 丹

(1.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.動物科學(xué)國家民委重點實驗室，四川 成都 610041)

牦牛是高原畜牧業(yè)的主要畜種，然而川西高原地區(qū)天然草場生態(tài)脆弱，飼草供應(yīng)不足，傳統(tǒng)的放牧養(yǎng)殖模式無法滿足牦牛的營養(yǎng)需求。牧民受傳統(tǒng)思想的影響，往往通過自然淘汰出欄，使得牦牛出欄時間長，養(yǎng)殖效率低，并且增加草地放牧強度，導(dǎo)致草畜矛盾凸顯，加劇草原生態(tài)破壞，嚴重制約川西高原畜牧業(yè)的發(fā)展。利用草原放牧繁育架子牛，后期集約化圈養(yǎng)育肥是提高牦牛養(yǎng)殖生產(chǎn)效率的重要方式。川西高原牧區(qū)交通不便，飼料運輸成本高昂，山地多不利于建設(shè)大型集約化養(yǎng)殖場，而臨近的成都平原能提供較好的集約化養(yǎng)殖條件和場地。楊勤等報道表明牦牛能夠適應(yīng)成都平原低海拔環(huán)境進行異地舍飼育肥，但尚不清楚牦牛適應(yīng)低海拔地區(qū)的敏感指標以及機制。因此，本研究在探討牦牛從高海拔向低海拔地區(qū)遷移后血液生理指標和血清皮質(zhì)醇濃度變化規(guī)律的基礎(chǔ)上，比較海拔高度變化對牦牛心臟及肺臟組織形態(tài)的影響，旨在確定牦牛對低海拔環(huán)境適應(yīng)的敏感指標，并從組織形態(tài)學(xué)角度初步揭示牦牛適應(yīng)低海拔環(huán)境的機制，為合理指導(dǎo)牦牛異地遷移飼養(yǎng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物選擇及試驗設(shè)計

隨機選擇來自高海拔地區(qū)(四川省阿壩州壤塘縣，平均海拔3 500 m)放牧飼養(yǎng)的6頭麥洼公牦牛，年齡3～5歲，平均體重200±30 kg。另外在成都青白江肉牛屠宰場隨機選擇6頭麥洼公牦牛(來自四川省阿壩州牧區(qū)，平均海拔3 500 m，體重年齡與試驗牦牛相近)和6頭西門塔爾與川南黃牛的雜交公黃牛(來自四川省成都平原，平均海拔500 m，年齡與試驗牦牛相近)作為比較屠宰試驗動物。

于第0天(試驗開始當天，在高海拔地區(qū))、第2天(d2，轉(zhuǎn)場至低海拔地區(qū)第1天)、5、8、16、31天牦?？崭惯^夜后頸靜脈采血，保存在肝素鈉抗凝管內(nèi)，測定血細胞生理指標；另取一份全血樣品，3 000 g離心10 min，分離血清，分裝至2 mL無菌凍存管中液氮速凍，-80 ℃保存。在飼養(yǎng)期結(jié)束后，對低海拔試驗牦牛、高海拔牦牛及低海拔黃牛進行屠宰，采集左心室下緣心肌組織和左側(cè)肺臟下緣組織樣本，置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)進行固定，后續(xù)用于制作石蠟切片。

1.2 試驗動物飼養(yǎng)管理

將試驗動物運輸轉(zhuǎn)移到低海拔地區(qū)(四川省長寧縣，平均海拔500 m)進行舍飼養(yǎng)殖，草料組成與養(yǎng)分含量見表1，飼養(yǎng)期共64 d。

表1 試驗牦牛的草料組成和養(yǎng)分含量(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 測定指標

1.3.1 血細胞生理指標 采集的牦牛全血樣本送至成都里來生物科技公司，利用全自動血細胞分析儀(江西特康TEK-II MINI系列)測定紅細胞數(shù)量(RBC)、紅細胞比積(HCT)、血紅蛋白含量(HGB)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板數(shù)(PLT)、血小板比積(PCT)、白細胞數(shù)量(WBC)、淋巴細胞數(shù)量(LYC)、中間細胞數(shù)量(MC)、粒細胞數(shù)量(GRC)等血細胞生理指標。

1.3.2 血清皮質(zhì)醇濃度 牦牛血清樣品用生理鹽水稀釋125倍，采用牛皮質(zhì)醇ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，通過競爭性抑制酶聯(lián)免疫吸附試驗測定皮質(zhì)醇的含量；同時采用BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，通過微孔板比色法測定牦牛血清樣本中總蛋白的含量，計算得到血清皮質(zhì)醇的相對濃度(血清中總蛋白含量/血清皮質(zhì)醇含量)。

1.3.3 心肌纖維直徑、數(shù)量和肺泡隔厚度 心臟和肺臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜后，經(jīng)脫水(常州中威TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機)、石蠟包埋(常州中威BMJ-Ⅲ型包埋機)、切片(德國徠卡-2016轉(zhuǎn)輪式切片機)，蘇木精-伊紅染色，利用顯微鏡(徠卡DM3000)對切片進行圖像采集，Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件測定心肌纖維直徑、心肌纖維數(shù)量和肺泡隔厚度，每張切片記錄3個不同視野計算平均值。

1.3.4 肺泡平均截距 采用STEPanizer軟件進行肺泡平均截距的測量與計算，其計算公式為：

其中：.肺泡平均截距(Mean linear intercept，又稱Chord length)，單位為μm；.測量體系中使用的參考測量線的長度，STEPanizer軟件在設(shè)置好測量體系后直接給出此參數(shù)，表示為L(P)，單位為μm；()測量體系中落在肺泡氣體區(qū)域內(nèi)的參考測量線端點(即指示肺泡腔空白區(qū)域的端點)的數(shù)量，記錄原則為記上不記下，記右不記左；().測量體系中參考測量線與肺泡間隔組織交叉點的數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

牦牛血液生理指標數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0進行重復(fù)測量數(shù)據(jù)單因素方差分析，利用一般線性模型GLM對數(shù)據(jù)進行球形檢驗，多重比較選擇Ducan法檢驗，<0.05表示差異顯著。牦牛心臟和肺臟組織形態(tài)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 6.0進行統(tǒng)計分析和繪圖。兩組之間的差異采用檢驗，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛血細胞生理指標

從高海拔地區(qū)向低海拔地區(qū)遷移后，牦牛血細胞生理指標隨時間變化情況見表2。紅細胞指標方面，隨著海拔高度降低，RBC呈現(xiàn)隨時間變化線性降低的趨勢但差異不顯著(>0.05)，HCT、HGB顯著線性降低(<0.05)，轉(zhuǎn)移至低海拔的第16和31天HCT、HGB顯著低于轉(zhuǎn)移前(第0天，<0.05)。MCH、MCHC極顯著線性降低(<0.01)，其中第31天時MCH顯著低于第0天(<0.05)，從第5天開始MCHC均顯著低于第0天(<0.05)。PLT、PCT未觀察到顯著變化。白細胞指標方面，海拔高度降低后，WBC、LYC和GRC隨時間發(fā)生顯著性改變(<0.05)，其中WBC呈現(xiàn)顯著先增加后降低二次變化規(guī)律(<0.05)，LYC也呈現(xiàn)顯著二次變化規(guī)律(<0.05)，而GRC未呈現(xiàn)顯著變化規(guī)律，MC無變化。

表2 牦牛的血細胞生理指標測定結(jié)果

2.2 牦牛血清皮質(zhì)醇濃度

牦牛從高海拔地區(qū)向低海拔地區(qū)遷移后，血清皮質(zhì)醇水平隨時間變化情況見圖1。結(jié)果表明，隨著海拔高度的降低，皮質(zhì)醇濃度隨時間延長極顯著升高(<0.01)。從轉(zhuǎn)移到低海拔的第5天起，牦牛血清皮質(zhì)醇濃度顯著高于遷移前(第0天)(<0.05)。

圖1 牦牛的血清皮質(zhì)醇濃度

2.3 牦牛心肺形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果

2.3.1 牦牛心臟組織形態(tài)檢查結(jié)果 牦牛遷移至低海拔地區(qū)飼養(yǎng)后，牦牛心肌纖維形態(tài)學(xué)變化情況見圖2和圖3。與高海拔放牧牦牛和低海拔舍飼黃牛相比，低海拔試驗牦牛心肌纖維直徑無明顯改變(圖3A)；低海拔試驗牦牛心肌纖維密度在低海拔富氧環(huán)境下發(fā)生了代償性的降低，顯著低于高海拔放牧牦牛(<0.05，圖3B)，但與低海拔舍飼黃牛之間差異不顯著。

圖2 牦牛心臟組織切片圖(400×)

圖3 牦牛心臟組織形態(tài)比較

2.3.2 牦牛肺組織形態(tài)檢查結(jié)果 牦牛遷移至低海拔地區(qū)飼養(yǎng)后，肺組織形態(tài)學(xué)變化情況見圖4。與高海拔放牧牦牛相比，低海拔試驗牦牛肺泡間隔厚度極顯著降低(<0.001，圖5A)，但與低海拔黃牛之間差異不顯著(>0.05)。低海拔試驗牦牛與高海拔放牧牦牛的肺泡數(shù)量無差異，但二者仍都顯著高于低海拔舍飼黃牛(<0.05，圖5B)。低海拔試驗牦牛平均肺泡截距顯著高于高海拔放牧牦牛(<0.05，圖5C)，但與低海拔舍飼黃牛相比無差異。

圖4 牦牛肺組織切片圖(400×)

圖5 牦牛肺臟組織形態(tài)比較

3 討 論

牦牛()主產(chǎn)于中國青藏高原海拔3 000 m以上地區(qū)，是高海拔地區(qū)的特有牛種，具有耐高寒缺氧、耐粗飼的特點，是青藏高原牧區(qū)重要的畜種資源。傳統(tǒng)放牧模式下牦牛出欄時間長，生產(chǎn)效率低下，并容易造成草場過度載畜，對高原生態(tài)環(huán)境也造成了不利的影響。將牦牛由高海拔地區(qū)轉(zhuǎn)移至低海拔地區(qū)舍飼育肥能顯著增加牦牛養(yǎng)殖效益，緩解高原草場生態(tài)壓力，并已有相應(yīng)的研究及實踐。然而從高海拔向低海拔的異地遷移過程中，牦牛也面臨如長途運輸、溫度改變、氧分壓變化等諸多應(yīng)激情況，但相應(yīng)的適應(yīng)機制及敏感指標尚不清楚。

3.1 高海拔向低海拔遷移對牦牛血液生理指標的影響

牦牛世代生活在高海拔低氧條件下，需要保證組織細胞的氧氣供應(yīng)，因此血液生理指標變化往往能夠直觀地反映出牦牛對于海拔高度變化的適應(yīng)情況，其中紅細胞和血紅蛋白含量主要反映動物機體的攜氧能力。海拔高度越高，氧分壓越低，當動物血液含氧量降低時，可促使RBC、HCT、HGB等含量代償性增加，以滿足機體對氧的需求。生活在不同海拔高度地區(qū)牦牛的RBC、HCT、HGB等含量存在顯著差異，在較高海拔高度地區(qū)的牦牛具有更高的RBC、HCT、HGB等含量，表明RBC和HGB與海拔高度呈顯著正相關(guān)。本試驗中，牦牛從高海拔遷移到低海拔地區(qū)，隨著時間延長，紅細胞參數(shù)RBC、HCT以及血紅蛋白參數(shù)HGB、MCH、MCHC均出現(xiàn)顯著下降的變化規(guī)律，并且低海拔地區(qū)適應(yīng)31 d時，牦牛血液中HCT、HGB、MCH、MCHC含量顯著低于高海拔地區(qū)，此結(jié)果與江家椿等、劉鳳云等研究結(jié)果一致，提示牦牛在轉(zhuǎn)至低海拔地區(qū)飼養(yǎng)后，隨著氧分壓上升，通過降低血液中紅細胞及血紅蛋白含量的機制，逐漸適應(yīng)低海拔富氧環(huán)境。血小板指標是評價血液凝血能力和血液流通能力的重要參數(shù)，其中，PLT是主要反映血小板生成與衰亡的指標，PCT主要反映血小板總?cè)莘e。高海拔缺氧狀態(tài)能引起人的血小板被大量激活和消耗，使循環(huán)血中PLT減少，導(dǎo)致骨髓巨核細胞代償性增加，產(chǎn)生更大體積的血小板，其間伴隨著PCT的減小。因此，血小板參數(shù)可能與海拔高度變化呈現(xiàn)負相關(guān)。然而本試驗中沒有觀測到牦牛血液中PLT和PCT發(fā)生顯著變化，該結(jié)果與唐可人等對不同海拔高度飼養(yǎng)的淮北麻雞PLT和PCT結(jié)果一致。這可能是由于血小板指標受物種、品種、飼養(yǎng)環(huán)境、應(yīng)激等因素的影響，關(guān)于海拔高度與牦牛血小板含量的關(guān)系有待進一步研究予以揭示。白細胞是血液中主要免疫細胞的總稱，主要包括單核細胞、粒細胞和淋巴細胞，白細胞指標的變化能初步反映動物免疫應(yīng)答的能力。本試驗觀察到牦牛從高海拔地區(qū)向低海拔地區(qū)遷移后，白細胞指標總體上呈現(xiàn)隨時間先增加后降低的顯著性變化規(guī)律。特別是在遷移至低海拔的第一周，外周WBC、LYC、GRC隨時間延長顯著增加，其中WBC、LYC在遷移后第5天達到峰值，而GRC在第2天達到峰值，這可能是由于粒細胞主要發(fā)揮非特異性免疫的作用，應(yīng)答速度較快，而淋巴細胞主要發(fā)揮特異性免疫應(yīng)答，應(yīng)答速度較慢。劉培培等報道了環(huán)境因素的改變，如早期斷奶應(yīng)激，能促進牦牛外周血WBC增加；在藏豬異地遷移飼養(yǎng)的報道中也觀察到遷移后血液WBC增加的情況，均與本試驗的結(jié)果類似，可能是由于牦牛在遷移的過程中由于運輸、環(huán)境改變等因素導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)所致。在遷移一周以后(第8天)，牦牛血液白細胞指標就能恢復(fù)至轉(zhuǎn)移前的水平，表明牦牛逐漸適應(yīng)低海拔環(huán)境，應(yīng)激反應(yīng)減輕并恢復(fù)正常狀態(tài)。上述研究結(jié)果提示外周血白細胞水平能作為異地遷移過程中，反映牦牛應(yīng)對環(huán)境變化的敏感指標。

3.2 高海拔向低海拔遷移對牦牛血清皮質(zhì)醇濃度的影響

皮質(zhì)醇是腎上腺皮質(zhì)分泌的糖皮質(zhì)激素，受下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸調(diào)控釋放，作用是提高機體對應(yīng)激情況的適應(yīng)力與抵抗能力，增加白細胞溶酶體膜穩(wěn)定性，減少熱敏蛋白釋放，緩解炎癥，皮質(zhì)醇水平變化能反映出動物對免疫應(yīng)激反應(yīng)程度及適應(yīng)情況。在本試驗中，牦牛遷移至低海拔地區(qū)后，由于運輸過程及海拔高度的變化，血清皮質(zhì)醇濃度呈現(xiàn)顯著線性增加的變化規(guī)律，表明異地遷移使牦牛發(fā)生了較強的應(yīng)激反應(yīng)，與血液白細胞指標在轉(zhuǎn)移初期的變化規(guī)律相符，提示血清皮質(zhì)醇含量也是應(yīng)對環(huán)境變化的敏感指標，該結(jié)果也與楊磊等報道的人群在高原短期暴露后返回低海拔地區(qū)適應(yīng)期血清皮質(zhì)醇水平的變化結(jié)果類似，高原短期暴露人群返回平原初期皮質(zhì)醇水平顯著上升，之后下降恢復(fù)正常水平。然而本試驗并未觀察到牦牛血清皮質(zhì)醇濃度下降的拐點，可能是由于遷飼牦牛仍處于應(yīng)激期，還需檢測其他指標予以佐證。也有報道表明高海拔地區(qū)人群血清皮質(zhì)醇水平顯著低于低海拔地區(qū)人群，因此低海拔牦牛血清皮質(zhì)醇含量上升可能是其對低海拔環(huán)境適應(yīng)，但海拔高度對血清皮質(zhì)醇含量的影響機制還需進一步研究予以揭示。

3.3 高海拔向低海拔遷移對牦牛心肺形態(tài)學(xué)的影響

動物機體長期對低氧環(huán)境適應(yīng)會引起其心臟在組織學(xué)和酶化學(xué)水平的改變，以維持正常生理功能，例如低氧會增加動物的肌肉組織中微血管密度，以提高肌肉的攝氧效率，增強動物對低氧環(huán)境的適應(yīng)能力，因此，本試驗從心臟組織形態(tài)學(xué)角度，分析探討了牦牛對海拔高度變化的適應(yīng)機制。對心肌纖維直徑和密度的分析結(jié)果表明，牦牛心肌纖維直徑和密度存在品種差異，與張勤文等報道發(fā)現(xiàn)大通牦牛的心肌纖維直徑與密度均高于樂都牦牛的結(jié)果一致。隨著海拔高度的降低，牦牛心肌纖維密度也顯著降低，提示經(jīng)過一段時間適應(yīng)低海拔富氧環(huán)境以后，牦牛可代償性的減少心肌纖維數(shù)量，與張勤文等發(fā)現(xiàn)高海拔地區(qū)大通牦牛心肌纖維表面積密度高于低海拔地區(qū)大通牦牛的結(jié)果相一致，提示心肌纖維密度于環(huán)境氧分壓存在負相關(guān)，在低氧環(huán)境中的動物可能通過代償性增加心肌纖維數(shù)量，增強心臟泵血功能與氧氣的供應(yīng)，從而維持低氧情況機體對氧氣代謝的需求。

牦牛適應(yīng)環(huán)境氧氣含量變化的機制還能通過肺組織形態(tài)學(xué)的變化反映。肺泡隔厚度和肺泡密度是反映動物肺臟對空氣交換能力的指標，平均肺泡截距是一種可定量評價肺氣體交換功能的形態(tài)學(xué)表觀指標。本試驗發(fā)現(xiàn)高海拔放牧牦牛肺泡隔厚度極顯著的高于低海拔試驗牦牛和低海拔黃牛，并且低海拔試驗牦牛與黃牛相比無差異，與張勤文報道的海拔高度對牦牛肺泡隔厚度影響結(jié)果和魏青等報道的高原牦牛肺泡隔厚度大于黃牛的結(jié)果相一致，表明肺泡隔厚度變薄是牦牛適應(yīng)低海拔環(huán)境的特征，并且與品種無關(guān)。海拔高度影響肺泡隔厚度的可能原因是由于肺泡隔內(nèi)含有較多的毛細血管和彈性纖維，且隨著環(huán)境氧分壓變化, 肺泡隔中細小動脈中平滑肌含量代償性增加或減少，從而使動物適應(yīng)海拔高度變化。此外，高海拔牦牛肺泡隔厚度增加可能還與肺泡壁中毛細血管擴張、紅細胞較多有關(guān), 這種變化可以使肺氣體交換過程中氧氣的吸入增多和二氧化碳的排出加快，氣體交換效率提高，能夠更好地適應(yīng)高海拔低氧的環(huán)境。本試驗還發(fā)現(xiàn)海拔高度變化對牦牛肺泡數(shù)量無影響，這與魏青等報道對高原牦牛和平原牦牛肺泡組織結(jié)構(gòu)的比較結(jié)果一致。牦牛出生在高原，初生時期肺泡發(fā)育較平原黃牛完善，并且能夠以“芽生”的形式快速增加，單位面積內(nèi)肺泡數(shù)量的增多，有利于增大肺的呼吸面積，提高肺組織對氧氣的利用率，從而促進高原牦牛適應(yīng)高原低氧環(huán)境，并且牦牛肺泡發(fā)育到一定階段之后的結(jié)構(gòu)能保持相對穩(wěn)定，這可能是低海拔試驗牦牛肺泡數(shù)量與高海拔牦牛相比無差異的原因。此外，肺泡數(shù)量存在品種差異，牦牛的肺泡數(shù)量顯著高于黃牛，這與賈榮莉、俞紅賢報道的藏羊肺組織單位面積內(nèi)肺泡數(shù)多于小尾寒羊、孫宏夫等報道高原犬單位面積肺泡數(shù)多于平原犬的結(jié)果類似，提示肺泡數(shù)量是動物對氣候環(huán)境長期適應(yīng)發(fā)生基因水平改變并能穩(wěn)定遺傳與表現(xiàn)。本試驗還發(fā)現(xiàn)低海拔試驗牦牛平均肺泡截距顯著高于高海拔放牧牦牛，但與低海拔舍飼黃牛相比無差異。平均肺泡截距衡量了呼吸道內(nèi)發(fā)生氣體交換的空間大小，低海拔試驗牦牛肺泡截距顯著增加，表明海拔降低后，隨著空氣氧分壓的上升和肺泡隔的變薄，牦牛呼吸道內(nèi)參與氣體交換的空間增大，也是牦牛逐漸適應(yīng)低海拔環(huán)境的表現(xiàn)。

4 結(jié) 論

牦牛從高海拔遷移至低海拔地區(qū)降低了血液紅細胞生理指標HCT、HGB、MCH和MCHC的含量，在遷移后1周內(nèi) WBC、LYC、GRC先升高后降低，血清皮質(zhì)醇含量升高，并在一段時間后通過降低心肌纖維密度和肺泡間隔厚度以及提升平均肺泡截距，適應(yīng)低海拔富氧環(huán)境。研究結(jié)果為合理指導(dǎo)牦牛的異地遷移至低海拔地區(qū)飼養(yǎng)提供了數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。