周 娟，萬瑞東，李 鳳，王欣玥，秦鴻楠，陳勇豪，方莉莉，張勤文

(青海大學 農牧學院動物醫(yī)學系，青海 西寧 810016)

牦牛是高原土著動物，生活在海拔3 000 m以上的高山草甸。由于長期受到低氧等高原特殊氣候因子的影響，牦牛在各水平層次均已獲得穩(wěn)定的低氧適應特征。近年來，許多學者從組織學及分子生物學方面研究牦牛在缺氧條件下組織器官水平對環(huán)境的適應性。而一些學者認為，牦牛能在低氧寒冷的環(huán)境中生存主要是與一些低氧適應性的相關基因有關，而并非僅靠組織器官發(fā)揮作用。

低氧誘導因子-1(HIF-1)調控許多與低氧反應相關的基因，由α、β兩個亞基構成異二聚體，其中HIF-1β亞基在常氧和低氧環(huán)境中均能以組成型結構表達，而HIF-1α亞基僅在缺氧環(huán)境下表達于細胞核中，決定HIF-1的活性，因此機體內HIF-1α的表達對缺氧適應起重要作用。在常氧下，HIF-1α的氧依賴降解結構域(oxygen-dependent degradation domain，ODDD)，ODDD上特異的脯氨酸殘基(Pro402和Pro564)可以被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，PHD)結合并發(fā)生羥化反應，導致HIF-1α蛋白復合體在常氧下降解，半衰期很短很難在常氧下檢測其表達。而在缺氧環(huán)境中，PHD喪失活性，無法進行羥基化反應，HIF-1α激活低氧相關靶基因的轉錄位點，從而增加氧氣的利用并促進機體新陳代謝，在缺氧條件下會穩(wěn)定表達，并且通過調控下游基因的轉錄和表達發(fā)揮特定生物學功能。

目前關于牦牛胎兒低氧適應中HIF-1α作用的分子調控機制的研究相對較少，本試驗研究牦牛胎兒不同組織-1基因，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)及免疫印跡(Western-blot)技術，對不同海拔高度牦牛胎兒組織中的表達情況進行分析，以期對牦牛低氧適應分子機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 動物及處理

從青海省海晏縣(海拔3 200 m，以下簡稱“海晏牦牛”)和青海省澤庫縣(海拔3 700 m，以下簡稱“澤庫牦牛”)選擇臨床健康的懷孕16周左右的牦牛各3頭，頸動脈放血處死，迅速解剖并取牦牛胎兒的腦組織、心肌、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、骨骼肌等器官或組織，置液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物的設計與合成

于GenBank查詢牦牛()-1基因(XM_005890693.1)序列及內參基因-(XM_005887322.2)序列，利用Oligo7軟件設計特異性引物(引物信息序列見表1)，并交由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 高原牦牛HIF-1α基因引物序列

1.3 總RNA提取和cDNA第一條鏈的合成

按照總RNA提取試劑盒說明書提取牦牛各組織中總RNA，使用核酸蛋白檢測儀測定濃度后，取2 μg OD/OD介于1.8～2.0之間的RNA樣品，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性。按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄出cDNA的第一條鏈，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實時熒光定量PCR

為比較各組-1mRNA轉錄水平，采用實時熒光定量PCR方法檢測其相對表達量。實時熒光定量PCR擴增體系(總體積為20 μL)：cDNA 2 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，TB Green Premix Ex Taq II酶10 μL，ddHO 6.8 μL。以-為內參，目的和內參分別設3個平行。反應條件：預變性95 ℃ 30 s；變性95 ℃ 5 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s。采用相對ΔΔCt法(2)對-1mRNA在牦牛胎兒組織中的轉錄水平進行分析。同海拔不同組織mRNA轉錄水平標準化到腦組織結果中；不同海拔牦牛mRNA轉錄水平標準化到海晏牦牛中。

1.5 蛋白提取及Western-blot分析

用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，蛋白質濃度通過BCA法測定，4×蛋白上樣緩沖液對蛋白進行變性；取40 μg變性后的蛋白上樣，經過SDS-PAGE 電泳(5%濃縮膠，8%分離膠)跑膠，電泳停止后采用濕轉法轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉3 h，4 ℃一抗孵育16 h，1×TBST洗滌5次(10 min/次)；25 ℃二抗孵育2 h，1×TBST洗滌10次(10 min/次)；取ECL發(fā)光液，按說明書步驟充分混合后，在自動蛋白曝光儀曝光，待條帶清晰呈現(xiàn)，拍照。使用AlphaView軟件測得光密度值對目的蛋白條帶進行量化，每個樣品做3次重復。-作為內參，通過劃分目標蛋白平均灰度值將其標準化。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

通過SPSS軟件進行單因素方差分析，用“平均值±標準誤”來表示qRT-PCR和Western-blot結果。<0.05表示差異顯著，>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 組織總RNA提取

隨機選取OD/OD值介于1.8～2.0的各組織總RNA 進行1%瓊脂糖凝膠電泳，28S、18S、5S清晰可見(見圖1)，說明所提取的RNA完整良好。利用反轉錄試劑盒反轉錄出cDNA第一條鏈。

圖1 RNA 1%瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2 牦牛胎兒組織中HIF-1α mRNA的檢測

2.2.1 牦牛胎兒不同組織內-1mRNA相對定量比較 由圖2、圖3可見，目的基因和內參基因熔解曲線峰值單一，引物特異性良好。海晏牦牛與澤庫牦牛的胎兒組織中-1mRNA相對定量表明，-1mRNA在不同組織中均有轉錄，且-1mRNA在海晏牦牛和澤庫牦牛的胎兒組織中轉錄水平具有相似性，表達量最高的都是腦組織，其次是肺臟和腎臟組織，心肌與骨骼肌組織最低，各組織間差異顯著(<0.05)。

圖2 目的基因(HIF-1α)qRT- PCR熔解曲線

圖3 內參基因(β-actin)qRT-PCR熔解曲線

2.2.2 不同地區(qū)牦牛胎兒組織-1mRNA相對定量比較 通過比較海晏牦牛胎兒與澤庫牦牛胎兒的腦、心肌、骨骼肌、肺、脾、肝、腎等7種組織-1mRNA相對轉錄水平(見圖4)，結果顯示澤庫牦牛胎兒組織中-1mRNA轉錄水平顯著高于海晏牦牛胎兒(<0.05)。

圖4 不同地區(qū)牦牛胎兒組織中HIF-1α mRNA相對定量

2.3 牦牛胎兒組織中HIF-1α蛋白的檢測

2.3.1 牦牛胎兒不同組織HIF-1α蛋白相對表達量比較 Western試驗結果見圖5，海晏牦牛和澤庫牦牛的胎兒組織中HIF-1α蛋白均有表達，且在不同組織中HIF-1α的蛋白表達特點與其mRNA轉錄水平相似。表達量最高的是腦組織，其次是肺臟和腎臟組織，然后是心肌和骨骼肌組織，各組織間表達差異顯著(<0.05)。

圖5 牦牛胎兒不同組織HIF-1α蛋白印跡結果

2.3.2 不同地區(qū)牦牛胎兒組織HIF-1α蛋白相對表達量比較 由圖6及圖7可知，澤庫牦牛胎兒組織中HIF-1α蛋白相對表達量顯著高于海晏牦牛胎兒(<0.05)。

圖6 不同地區(qū)牦牛胎兒組織中HIF-1α蛋白Western-blot分析結果

圖7 不同地區(qū)牦牛胎兒組織中HIF-1α蛋白相對表達量

3 討 論

平原健康哺乳動物進入高原，隨著海拔升高，空氣中氧分壓下降，平原動物會發(fā)生肺血管肌化、血管壁增厚和肺血管收縮增強而導致的肺動脈高壓，而牦牛等高原土著動物卻鮮有肺動脈高壓的發(fā)生，這與高原牦牛的心臟、肺臟適應性結構有關，這些結構特點使高原牦牛對氧的攝取及運輸能力更強。楊琨等研究發(fā)現(xiàn)牦牛胎兒也有肺動脈內皮細胞變大并突入管腔等低氧適應的結構特點，這與胎兒在發(fā)育過程中受低氧相關基因調控有關。

HIF-1是由分子質量為120 ku的α亞基和分子質量為91～94 ku的3種不同β亞基組成。在常氧條件下HIF-1α亞基存在于細胞質中；當機體處于缺氧時，HIF-1α從細胞質易位至細胞核與HIF-1β結合成異二聚體。激活的HIF-1隨后結合到下游目標基因缺氧反應元件(HRE)上，參與并啟動與缺氧相關的一系列目標基因的轉錄。Schofield等研究發(fā)現(xiàn)，-1可調控超過100個與低氧適應相關的下游基因，涵蓋血管及紅細胞生成，能量代謝等方面。

但-1在各組織中的表達結果不完全相同。王德朋等研究發(fā)現(xiàn)，-1mRNA在家牦牛心臟、肝臟、肺臟多個組織中都有表達，其中最高的為睪丸與脾臟；高原鼠兔腦組織-1mRNA表達量最高；而高原鼢鼠腎組織-1的mRNA表達量最高，蛋白表達在心、肝和肺臟中的表達量高。本試驗結果表明牦牛胎兒-1在不同的組織間均有表達，且不同海拔牦牛-1在組織中的表達特點具有相似性，均表現(xiàn)為腦組織表達量最高，其次是肺組織和腎組織，表達量最低的心肌與骨骼肌，這與趙同標等的研究結果一致；而比較不同海拔間胎兒7種主要組織或器官中HIF-1α的相對表達水平，結果顯示澤庫牦牛胎兒HIF-1α的相對表達量顯著高于海晏牦牛，說明牦牛胎兒中HIF-1α的表達與海拔高度呈正相關，這是因為隨著海拔升高氧含量逐漸降低，而HIF-1α作為低氧敏感基因，在基因缺氧時被激活表達，調控下游靶基因維持機體氧平衡，從而適應缺氧環(huán)境。

4 結 論

相同海拔牦牛胎兒不同組織中-1mRNA和蛋白均有表達并具有一致性，且澤庫牦牛胎兒-1的表達量顯著高于海晏牦牛，說明其表達具有差異性且隨海拔的升高而增加，提示牦牛胎兒時期-1發(fā)揮著重要作用，推測這種表達特征與牦牛胎兒在出生前為適應低氧環(huán)境做出的適應性改變有關。