劉 敏 高 川 李 升

(1. 佳木斯大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154007)

生物體內(nèi)各種活性物質(zhì)處于平衡狀態(tài)是維持生理過程所必須的。在外部條件的刺激下，體內(nèi)活性物質(zhì)的異常表達(dá)如活性氧、硫醇、酶學(xué)等，使機(jī)體出現(xiàn)炎癥、組織損傷、甚至癌變等一系列復(fù)雜的過程[1，2]。因此實(shí)時(shí)的檢測(cè)活性物質(zhì)的變化，對(duì)疾病的早期診斷及治療具有重要意義。二氰亞甲基-4H-吡喃(dicyanomethylene-4H-pyran，DCM)是最常見的近紅外熒光染料，具有典型的供體-π-受體(D-π-A)結(jié)構(gòu)，含有供電子基的供體在分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)作用下將電子轉(zhuǎn)移至受體，光激發(fā)時(shí)吸收熱量，發(fā)射出近紅外波長(zhǎng)并發(fā)生紅移，產(chǎn)生高的熒光響應(yīng)[3，4]，克服了其他染料紫外/可見光發(fā)射、短波長(zhǎng)、小斯托克斯位移的缺點(diǎn)[5，6]，因此受到研究者的青睞。本文重點(diǎn)介紹DCM近紅外熒光探針在生物醫(yī)學(xué)中的進(jìn)展，并對(duì)該領(lǐng)域在今后的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1 DCM類近紅外熒光探針在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1.1 用于生物體內(nèi)酶學(xué)的檢測(cè)

酶是維持體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定重要的一員，酶的過量表達(dá)與各種疾病發(fā)生發(fā)展緊密相連。因此建立敏感，簡(jiǎn)便的酶學(xué)檢測(cè)方法有重要意義，同時(shí)為臨床診斷提供新的方法。

氨基肽酶N(Aminopeptidase N，APN)是一種水解蛋白質(zhì)和氨基酸末端殘基的重要蛋白水解酶，屬于鋅金屬肽酶家族，在信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，神經(jīng)肽的降解，免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要的作用[7]。此外作為腫瘤標(biāo)志物，參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，血管生成[8]。Li等[9]開發(fā)了可激活的雙電子熒光探針(two-photon near-infrared (NIR) fluorescence probe，DCM-APN)(圖1),用于APN的檢測(cè)，該探針由DCM發(fā)光基團(tuán)，L-丙氨酸識(shí)別基團(tuán)，在APN存在時(shí)與DCM-APN相互作用，水解丙氨酸形成DCM-NH2，氨基作為供電子基團(tuán)，通過分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)，發(fā)出近紅外熒光。結(jié)果表明DCM-APN在662 nm，pH=4.75～10.27，熒光增強(qiáng)[9]。具有時(shí)間和濃度依賴性，較高的敏感性和特異性，重要的是該探針能區(qū)分正常組織和腫瘤組織，能在溶酶體進(jìn)行定位，對(duì)腫瘤的早期診斷十分重要。

亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase，LAP)是蛋白水解酶，是M1，M17肽酶家族的一員[10]。作為腫瘤標(biāo)志物，與卵巢上皮癌、乳腺癌和膽管梗阻等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[11]。Gu等[12]人開發(fā)了可激活的定量近紅外熒光(LAP-targeting near-infrared fluorescent probe，DCM-Leu探針)(圖2)用于LAP的檢測(cè)，該探針由近紅外熒光基團(tuán)DCM和識(shí)別基團(tuán)L-亮氨酸經(jīng)酰胺鍵連接構(gòu)成，在加入LAP裂解酰胺鍵，在660 nm處釋放近紅外熒光。結(jié)果表明DCM-Leu加入LAP后熒光比顯著增強(qiáng)，且溶液由最初的黃色變?yōu)榧t色，表明反應(yīng)生成了DCM-NH2，同時(shí)隨著時(shí)間延長(zhǎng)和濃度增加，熒光強(qiáng)度也發(fā)生顯著變化并且對(duì)LAP有較高的選澤性，通過三維共聚焦成像實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)LAP的原位檢測(cè)[12]。

圖2 DCM-Leu探針的結(jié)構(gòu)和DCM-Leu對(duì)LAP的檢測(cè)機(jī)理Fig. 2 The structure of DCM-Leu probe and the detection mechanism of DCM-Leu on LAP

谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(g-glutamylTranspeptidase，GGT)是膜相關(guān)的外生酶，臨床上常作為肝損傷，肝毒性的標(biāo)志物[13]。GGT的過表達(dá)還與卵巢癌、宮頸癌有關(guān)[14]。Zhang 等[15]合成了雙光子的近紅外熒光探針(two-photon fluorescent “turn-on” GGT sensor，DCM-GA)(圖3)用于檢測(cè)發(fā)生藥物性肝損傷時(shí)GGT的活性，該探針由DCM衍生物為熒光基團(tuán)，r-谷氨酰胺為識(shí)別基團(tuán)，在GGT存在時(shí)r-谷氨酰胺裂解，恢復(fù)DCM的熒光發(fā)射。雙光子的熒光探針具有更長(zhǎng)的紅光發(fā)射，更深的組織穿透，低檢測(cè)限(小于0.057 U/L)，更適合生物體內(nèi)GGT的檢測(cè)[15]。

圖3 DCM-GA探針的結(jié)構(gòu)和DCM-GA對(duì)GGT的檢測(cè)機(jī)理Fig. 3 The structure of DCM-GA probe and the detection mechanism of GGT by DCM-GA

1.2 用于抗腫瘤藥的釋放

腫瘤在所有疾病中位居首位，因其不可逆轉(zhuǎn)，而損害機(jī)體的器官組織[16]。臨床上腫瘤的治療主要以射線，藥物，手術(shù)為主[17]。藥物治療作為常用的方式之一，因其對(duì)細(xì)胞，組織，器官具有毒副作用，因此尋找高效的方法是研究者不斷探索的方向[18]。而前藥可以實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)藥物的釋放，減少副作用，提高藥物的療效而備受研究者關(guān)注[19]。

Cao等[20]開發(fā)了可激活的糖化納米囊熒光探針(Lac-SS-DCM)(圖4)用于監(jiān)測(cè)抗腫瘤藥鹽酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX)的釋放和靶向腫瘤的能力，Lac-SS-DCM由兩親性的物質(zhì)構(gòu)成，一部分是具有疏水基團(tuán)的近紅外熒光染料(DCM),另一部分是有親水基團(tuán)的乳糖衍生物，兩者通過二硫鍵相連，此時(shí)Lac-SS-DCM表現(xiàn)為熒光淬滅。在腫瘤發(fā)生時(shí)腫瘤表面的糖蛋白異常表達(dá)。在GSH存在時(shí)，二硫鍵斷裂，釋放出DCM-NH2，近紅外熒光開，而納米囊上的乳糖與腫瘤表面的糖蛋白結(jié)合，實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向能力，結(jié)果證實(shí)了在肝癌細(xì)胞中，GSH存在時(shí)，Lac-SS-DCM熒光顯著增強(qiáng)[20]。而裝載抗腫瘤藥DOX-Lac-SS-DCM顯現(xiàn)出高的藥物利用度和抗腫瘤效果。隨后Liu等[21]開發(fā)了近紅外前藥(DCM-S-PPT)(圖5)用于抗癌藥鬼臼毒素(podophyllotoxin，PPT)的靶向釋放，DCM-S-PPT由DCM衍生物通過二硫鍵與PPT連接而成，在谷胱甘肽存在時(shí)激活DCM-S-PPT,釋放抗癌藥物PPT。將兩親性共聚物(Mpegdspe)作為納米載體包覆在DCM-S-PPT上增強(qiáng)了PPT的滯留效應(yīng)，對(duì)腫瘤有較好的靶向性[21]。另外Wu等[22]設(shè)計(jì)了近紅外前藥雙氰基甲基-4H-吡喃裝載聚乙二醇(PEG-PLA納米粒子)(圖6)治療癌癥，該前藥由DCM及CPT以二硫鍵相連。在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)GSH,使得二硫鍵斷裂，釋放出抗腫瘤藥(CPT)和發(fā)出強(qiáng)烈的近紅外熒光。而用PEG-PLA包載提高藥物的滲透性及降低CPT在血中的清除速度，使CPT大量積聚在腫瘤細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)將結(jié)果表明在加入GSH后，產(chǎn)生比色和光譜的顯著變化，顏色從黃色變?yōu)榉凵?，?65 nm發(fā)出近紅外熒光，且靈敏度高,特異性強(qiáng),在PH=6～9, 20 min，即可完成熒光響應(yīng)[22]。體外實(shí)驗(yàn)顯示低毒性，高熒光特性；體內(nèi)荷瘤小鼠成像有強(qiáng)熒光，移植瘤實(shí)驗(yàn)表明腫瘤重量，體積減小，組織切片顯示腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[22]。

圖4 糖化納米囊熒光探針Lac-SS-DCM的結(jié)構(gòu)Fig. 4 The structure of thesaccharified nanocapsule fluorescent probe Lac-SS-DCM

圖5 近紅外前藥DCM-S-PPT的結(jié)構(gòu)Fig. 5 The structure of the near-infrared prodrug DCM-S-PPT

圖6 裝載聚乙二醇PEG-PLA納米粒子的前藥結(jié)構(gòu)Fig. 6 Prodrug structure of PEG-PLA nanoparticles loaded with polyethylene glycol

2 結(jié)語

本文對(duì)近年來DCM的近紅外熒光探針在生物醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。DCM染料由于具有紅光發(fā)射，大Stokes位移受廣大研究者的追捧。另外DCM近紅外熒光探針有強(qiáng)的滲透能力，能無創(chuàng)的對(duì)細(xì)胞組織進(jìn)行檢測(cè)且自發(fā)熒光干擾小廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。盡管DCM近紅外熒光探針在合成和設(shè)計(jì)上具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在一些問題有待優(yōu)化。基于DCM類染料的諸多優(yōu)點(diǎn)開發(fā)越來越多的近紅外熒光探針用于活性物質(zhì)的檢測(cè)將是未來的重要研究方向。DCM染料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大，將會(huì)出現(xiàn)更多新的設(shè)計(jì)策略，更多的探針不斷涌現(xiàn)，為生物醫(yī)學(xué)做出更大的貢獻(xiàn)。