趙順新

(南京康寧司法鑒定中心，江蘇 南京 210000)

酒精對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)有一定的抑制作用，可以使人思維遲鈍，甚至產(chǎn)生幻覺。當(dāng)前酒后駕車已經(jīng)被列為車禍致死的主要原因。隨著新交通法的實(shí)施，酒駕相關(guān)的檢測也日趨普遍，而乙醇含量是認(rèn)定行為人是否醉酒駕駛的關(guān)鍵性證據(jù)。駕駛員血液中乙醇濃度大于等于20 mg/100 mL小于80 mg/100 mL為飲酒后駕車，大于等于80 mg/100 mL則為醉酒后駕車[1]。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了各種各樣檢測血液中乙醇含量的方法，包括酶法、化學(xué)法、頂空氣相色譜法和頂空氣相色譜-質(zhì)譜法[2-5]等。其中，頂空氣相色譜法是最為常用并被納入公共安全行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的方法。目前能夠適用的檢驗(yàn)方法為GA/T 1073—2013[6]和GA/T 842—2019[7]。《司法鑒定/法庭科學(xué)機(jī)構(gòu)能力認(rèn)可準(zhǔn)則》[8](CNAS-CL08:2018)7.2.1.5鑒定機(jī)構(gòu)在引入方法之前，應(yīng)驗(yàn)證能夠正確運(yùn)用該方法，以確保實(shí)現(xiàn)所需的方法性能要求。并保留方法驗(yàn)證的記錄，當(dāng)方法發(fā)生變更或修訂時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行適當(dāng)程度的驗(yàn)證。

在檢測血液中乙醇含量的過程中，檢測人員、所使用的儀器設(shè)備、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、檢測方法、環(huán)境條件等都會(huì)影響檢測結(jié)果，這些均為血液中乙醇檢測不確定度的來源。不確定度越大，檢測結(jié)果距離真值越遠(yuǎn)，不確定度越小，檢測結(jié)果距離真值越近，所以不確定度也可以反應(yīng)一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測水平[9,10]。

本文參照GA/T 842—2019標(biāo)準(zhǔn)，并依據(jù)GB/T 27417—2017《化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[11]和《法醫(yī)毒物分析方法驗(yàn)證通則》[12]，利用雙柱雙檢測器頂空氣相色譜法對(duì)血液中乙醇含量的測定進(jìn)行方法驗(yàn)證，證實(shí)筆者所在實(shí)驗(yàn)室具備使用該標(biāo)準(zhǔn)方法的條件，能夠按照方法要求出具科學(xué)、準(zhǔn)確、公正的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

PerkinElmer Clarus 500氣相色譜儀(鉑金埃爾默股份有限公司)，PerkinElmer TurboMatrix40頂空自動(dòng)進(jìn)樣器(鉑金埃爾默股份有限公司)，100 μL移液槍，1 000 μL移液槍。

1.2 試劑

乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(5、10、20、50、80、200、300 mg/100 mL，純度≥99.9%，sigma aldrich)，叔丁醇(純度≥99.8%，sigma aldrich)，血液中乙醇樣品-1，血液中乙醇樣品-2(司法部司法鑒定科學(xué)研究院)。

1.3 溶液的配制

叔丁醇內(nèi)標(biāo)溶液：稱取適量的叔丁醇標(biāo)準(zhǔn)品置于500 mL容量瓶中，添加去離子水至刻度，混勻，得500 mg/100 mL叔丁醇對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，將儲(chǔ)備液用水稀釋得4 mg/100 mL叔丁醇內(nèi)標(biāo)工作液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 HS-GC條件

PerkinElmerClarus 500氣相色譜儀，色譜條件：毛細(xì)管色譜柱A柱：Elite-BAC1(30 m×1.8 μm×0.32 mm)；B柱：Elite-BAC2(30 m×1.2 μm×0.32 mm)；柱溫：50 ℃；檢測器：火焰離子化檢測器(FID1，F(xiàn)ID2)；檢測器溫度：200 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。PerkinElmer TurboMatrix40頂空自動(dòng)進(jìn)樣器，頂空爐溫：65 ℃；取樣針溫度：90 ℃；傳輸線溫度：110 ℃；樣品瓶加熱平衡時(shí)間10 min。

1.4.2 校準(zhǔn)曲線制備

分別移取100 μL系列濃度乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(5、10、20、50、80、200、300 mg/100 mL)，加入20 mL頂空瓶中，然后均加入500 μL叔丁醇內(nèi)標(biāo)工作液，每個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液獨(dú)立重復(fù)測定5次。每個(gè)濃度點(diǎn)后均分析空白樣以評(píng)價(jià)延遲效應(yīng)。

1.4.3 樣品分析

分別移取100 μL血液中乙醇樣品-1和血液中乙醇樣品-2血樣各兩份，加入20 mL頂空瓶中，然后加入500 μL叔丁醇內(nèi)標(biāo)工作液，作頂空進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1 校準(zhǔn)曲線和延遲效應(yīng)

按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)系列濃度乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，乙醇的質(zhì)量濃度在5.0～300.0 mg/100 mL范圍均未見延遲效應(yīng)。

用乙醇濃度值為橫坐標(biāo)，乙醇與叔丁醇內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，5次重復(fù)測量數(shù)據(jù)疊加作圖，得到校準(zhǔn)曲線見圖1和圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線殘差值的分布見圖3和圖4。在濃度范圍5～300 mg/100 mL內(nèi)，A通道的線性回歸方程為Y=0.010 983X-0.019 970，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 967；B通道的線性回歸方程為Y=0.011 148X-0.012 749，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 947，兩個(gè)通道的線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，標(biāo)準(zhǔn)曲線殘差值以0為中心隨機(jī)分布，因此線性方程回歸成立，且繪制的校準(zhǔn)曲線線性良好，滿足日常檢測分析的需要。

圖1 A通道校準(zhǔn)曲線Fig. 1 Linear regression equation of channel A

圖2 B通道校準(zhǔn)曲線Fig. 2 Linear regression equation of channel B

圖3 A通道標(biāo)準(zhǔn)殘差值Fig. 3 Standard residuals of channel A

圖4 B通道標(biāo)準(zhǔn)殘差值Fig. 4 Standard residuals of channel B

2.2 檢出限和定量限

選擇三個(gè)來源不同的空白血液，逐步稀釋乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)批次重復(fù)測定三次，同時(shí)記錄乙醇的信噪比，S/N≥3且符合定性要求的添加樣品最低濃度為1 mg/100 mL，即為方法的檢出限。定量限為校準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)(5 mg/100 mL)，且此濃度點(diǎn)能滿足精密度和準(zhǔn)確度的要求。

2.3 回收率和精密度

取同一空白血樣3份，分別添加乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，使血液中乙醇的質(zhì)量濃度分別為5 mg/100 mL、50 mg/100 mL和150 mg/100 mL。每個(gè)濃度點(diǎn)配制三個(gè)質(zhì)控樣，連續(xù)測定5天，計(jì)算日內(nèi)精密度、日間精密度和回收率，見表1，表2。

表1 日內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab. 1 Results of within-day precision(n=3)

表2 回收率和日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=15)Tab. 2 Results of recovery rate and day to day precision(n=15)

結(jié)果表明該方法兩個(gè)通道進(jìn)樣的日間精密度和日內(nèi)精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于5.0%，說明測定數(shù)據(jù)間的波動(dòng)性小。A通道的回收率在99.32～101.40%之間，B通道的回收率在99.40～100.20%之間，說明該方法回收率良好。即本方法精密度和回收率均符合日常檢測的需要。

2.4 樣品分析

2020年5月8日本中心收到2個(gè)標(biāo)稱“血液中乙醇含量測定-1”和“血液中乙醇含量測定-2”的能力驗(yàn)證樣品，將其編號(hào)為NL-2020-12-1和NL-2020-12-2。用所建立的方法對(duì)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。本實(shí)驗(yàn)室選擇將相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較好的A通道的數(shù)據(jù)反饋給能力驗(yàn)證提供方。經(jīng)確認(rèn)，能力驗(yàn)證結(jié)果為滿意，此方法能滿足中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)能力驗(yàn)證計(jì)劃樣品測定的需要，同時(shí)也能滿足本實(shí)驗(yàn)室法醫(yī)毒物相關(guān)樣品分析的需要。

表3 能力驗(yàn)證樣品測定結(jié)果Tab. 3 Results of proficiency testing samples

2.5 不確定度

2.5.1 A類不確定度

來源于重復(fù)測定次數(shù)、檢測人員。

將質(zhì)量濃度為80 mg/100 mL的血樣平行測定10次，結(jié)果如下：A通道：79.15、79.74、78.89、79.23、79.58、79.52、80.09、80.38、79.02、80.37 mg/100 mL；B通道：78.22、79.63、78.64、78.99、78.11、79.02、79.41、80.29、79.04、80.13 mg/100 mL來計(jì)算不確定度。

測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差：

(1)

測定平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(2)

經(jīng)公式2計(jì)算：A通道樣品平行測定產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)=2.16×10-3，B通道樣品平行測定產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)=2.92×10-3。

2.5.2 B類不確定度

來源于校準(zhǔn)曲線、乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液純度、移液器、氣相色譜和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境等。

2.5.2.1 校準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的不確定度

由以下公式可以計(jì)算校準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的不確定度:

(3)

SE為標(biāo)準(zhǔn)曲線峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差;

(4)

SXX為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度殘差的平方和；

(5)

urel(X)為校準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

經(jīng)計(jì)算，A通道由校準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為7.10×10-3，B通道由校準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為4.99×10-4。

2.5.2.2 乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的不確定見表4。

表4 乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液純度的不確定度Tab. 4 Uncertainties of ethanol standard solution

2.5.2.3 移液器

(1) 取內(nèi)標(biāo)用移液器產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

(2) 取血樣用移液器產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.5.2.4 氣相色譜儀引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.5.3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評(píng)定見表5：

表5 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量一覽表Tab. 5 Components of relative standard uncertainty

由以上分析可知，不確定度主要來源于樣品平行測定、校準(zhǔn)曲線、對(duì)照品純度和氣相色譜儀，其余來源的不確定度可忽略。由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式計(jì)算出相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度μrel=1.10×10-2(A通道)，μrel=1.02×10-2(B通道)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般用擴(kuò)展不確定度表示。擴(kuò)展不確定度是由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的倍數(shù)表示的測量不確定度，通常用符號(hào)U表示。它是將合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度擴(kuò)展k倍，k稱為包含因子。k值一般取2～3，多數(shù)情況取k=2。即U=k×μrel=2×1.10×10-2×79.60=1.75 mg/100 mL(A通道)；U=k×μrel=2×1.02×10-2×79.15=1.61 mg/100 mL(B通道)

本方法測得樣本中乙醇含量為：(79.60±1.75)mg/100 mL,k=2(A通道)；(79.15±1.61)mg/100 mL,k=2(B通道)。

3 結(jié)論

本次方法驗(yàn)證線性范圍，檢出限和定量下限均滿足GA/T 842—2019《血液酒精含量的檢驗(yàn)方法》的要求。高、中、低不同濃度血樣測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差滿足生物樣品定量分析方法的RSD控制在15%以內(nèi)的要求，精密度良好。A通道的回收率在99.32～101.40%之間，B通道的回收率在99.40～100.20%之間。證明本實(shí)驗(yàn)室檢測血液中酒精含量的精密度和回收率能夠滿足方法的要求。通過方法驗(yàn)證，確認(rèn)GA/T 842—2019方法在本實(shí)驗(yàn)室可行、適用。