黃光明，蔣曉鳳，陳佳俊，符顯昭

(右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533099)

我國成人糖尿病患病率高達11.2%，患者數(shù)量約1.298億，高居世界首位[1]。糖尿病本身對患者影響較小，造成糖尿病患者住院、死亡的主要原因為糖尿病各種急、慢性并發(fā)癥，其中以心血管類并發(fā)癥影響最為廣泛和嚴重[2]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、腦卒中、外周動脈疾病等糖尿病大、中血管類并發(fā)癥致死、致殘的重要原因，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)所介導(dǎo)的動脈細胞凋亡則是AS重要的病理基礎(chǔ)和潛在治療靶點[3]。糖尿病可通過高血糖、高血脂、炎癥反應(yīng)與AS相聯(lián)系并加速其進展[4]，抑制動脈細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,對抗動脈細胞凋亡有望成為防控糖尿病AS的重要途徑。水中運動治療兼具物理因子與運動綜合康復(fù)效益，可緩解運動不耐受，有效改善動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)的病情[5]。中藥內(nèi)治是傳統(tǒng)康復(fù)醫(yī)學(xué)的重要手段，相關(guān)中藥在AS治療中具有抗炎、抗凋亡、調(diào)節(jié)代謝紊亂等多重功效和整體性作用優(yōu)勢[6]。本研究旨在探討水中運動聯(lián)合中藥內(nèi)治對糖尿病AS大鼠動脈細胞凋亡的影響，并探究其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠

雄性SPF級SD大鼠125只，體質(zhì)量(240±10)g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證編號SCXK(桂)2014-002，飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院動物實驗中心(溫度20 ℃±2 ℃，相對濕度50%～60%,每天12 h循環(huán)照明)，進食、飲水自由。實驗過程嚴格遵循動物實驗倫理相關(guān)準(zhǔn)則，并獲取右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(北京華越洋生物公司)，高脂飼料(江蘇省協(xié)同生物工程有限公司)，TUNEL試劑盒(北京華越洋生物公司)，糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin，GHb)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α，TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(c-reactive protein，CRP)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，4%多聚甲醛、磷酸鹽緩沖液、乙醇溶液、二甲苯、過氧化氫溶液、生理鹽水(成都市科隆化學(xué)品有限公司)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP 78)、CCAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhance-binding protein homologous protein，CHOP)、甘 油 醛-3-磷 酸 脫 氫 酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物合成及相關(guān)試劑(上海吉凱基因生物科技有限公司)。全自動生化儀( BS-400型，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司) ，酶 標(biāo) 儀 (美國珀金埃爾默股份有限公司)，超凈工作臺(山東博科生物科技有限公司)，高速低溫離心機[艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司]，-80 ℃超低溫冰箱(中國海爾)，光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，冷凍切片機(德國徠卡公司)。

1.3 動物分組與造模

造模方法參考已發(fā)表的相關(guān)文獻[7],實驗大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)表法將其分為空白組、模型組、水中運動組、中藥內(nèi)治組、水中運動聯(lián)合中藥內(nèi)治組(綜合康復(fù)組)，每組25只，空腹10 h后，除空白組外,各組按照50 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素，空白組腹腔注射相當(dāng)劑量檸檬酸鈉緩沖液。3 d后檢測大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，選擇連續(xù)2次FBG≥16.7 mmol/L大鼠,高脂飼養(yǎng)3個月后作為糖尿病動脈粥樣硬化模型。造模成功后，各組進行8周相應(yīng)灌胃、水中運動處理，期間繼續(xù)高脂飼養(yǎng)(高脂飼料組成：普通飼料78.2%、豬膽鹽0.3%、豬油10%、膽固醇1.5%、蛋黃粉10%)。喂養(yǎng)空白組大鼠所用普通飼料與上述高脂飼料中的普通飼料成分完全一致。

1.4 水中運動方案

水中運動組及綜合康復(fù)組利用自制大鼠水療運動池進行游泳運動，水療運動池水深≥30 cm，維持水溫32 ℃～35 ℃，每次使用前消毒，確保水質(zhì)安全。每周運動6次，第1周為適應(yīng)期，運動時間為10 min/次；第2周為延長運動適應(yīng)期，運動時間逐漸增至30 min/次；第3～8周運動時間為60 min/次。

1.5 灌胃處理方案

將中藥復(fù)方(人參、麥冬、黃芪、地黃、大黃、山茱萸、丹皮、黃連、桃仁、五味子、鱉甲，購自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,符合《中華人民共和國藥典》藥品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn))制成浸膏，每1 g浸膏劑量等同于原生藥10 g,中藥內(nèi)治組與綜合康復(fù)組按照1.0 g/(kg·d)確定劑量后，將浸膏置于EP管中，加入生理鹽水，經(jīng)渦旋震蕩配制成2 ml混懸液灌服，模型組與水中運動組每天給予等體積生理鹽水灌胃處理，連續(xù)灌胃8周,各組灌胃處理在運動前2 h進行。

1.6 實驗取材

各組完成最后一次灌胃、運動處理后，給予戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。收集頸靜脈血，4 ℃、3 500 轉(zhuǎn)/min下分離血清，-20 ℃冰箱保存，用于各項生化指標(biāo)檢測。處死大鼠、剝離大鼠主動脈，部分經(jīng)多聚甲醛固定，石蠟包埋和切片后用于原位末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)檢測動脈細胞凋亡指數(shù)，另一部分在-80 ℃冰箱保存，用于實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 血清生化指標(biāo)檢測 利用全自動生化儀檢測血清甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平。嚴格按照試劑盒操作說明采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELASA)染色檢測血清GHb、IL-6、TNF-α、CRP水平。

1.7.2 TUNEL染色檢測動脈細胞凋亡水平 (1)將主動脈組織石蠟切片在二甲苯中浸泡10 min，清除切片中的石蠟。(2)用100%乙醇溶液、85%乙醇溶液、75%乙醇溶液、蒸餾水依次浸泡，各5 min，進行水化處理。(3)滴加蛋白酶K，室溫下反應(yīng)15 min，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗15 min。(4)3%過氧化氫溶液浸泡10 min，PBS清洗5 min。(5)添加TUNEL工作液，37℃，反應(yīng)60 min，PBS清洗15 min。(6)添加二氨基聯(lián)苯氨(diaminobenzidin，DAB)顯色劑。(7)85%、95%、100%乙醇溶液逐級脫水。(8)使用二甲苯進行透明處理，最后滴加中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。凋亡陽性動脈細胞核呈黃棕色，正常動脈細胞核呈藍色,每張切片選擇5個不重復(fù)視野對細胞核總數(shù)和凋亡細胞核數(shù)目進行統(tǒng)計，并計算動脈細胞凋亡指數(shù)(cell apoptosis index，CAI)。CAI=凋亡動脈細胞核數(shù)/總細胞核數(shù)×100%。計算每個視野內(nèi)的CAI，并取平均值。

1.7.3 qRT-PCR測定主動脈組織中GRP-78、CHOP mRNA表達水平 取主動脈組織，液氮研磨后利用總RNA抽提試劑(total RNA extractor，Trizol)提取大鼠主動脈組織總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性后按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲取目的基因。qRT-PCR測定GRP78、CHOP mRNA 相對表達水平，反應(yīng)條件為96 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共計40個循環(huán)。目的基因的相對表達標(biāo)準(zhǔn)化為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)，各項數(shù)據(jù)使用2＿△△Ct法進行分析、計算。擴增目的基因所用引物見表1。

表1 引物及序列Table 1 Primers sequence

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 5組大鼠血糖與血脂水平比較

與空白組比較，其余各組GHb、TG、LDL-C顯著升高，HDL-C顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與模型組比較，各治療組GHb、TG、LDL-C明顯降低，HDL-C明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與水中運動組相比，綜合康復(fù)組GHb、TG、LDL-C水平明顯降低，HDL-C明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05；表2)。

表2 5組大鼠血糖與血脂水平比較

2.2 5組大鼠炎癥因子水平比較

與空白組比較，其余各組IL-6、TNF-α、CRP水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。與模型組比較，各治療組IL-6、TNF-α、CRP水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與水中運動組比較，綜合康復(fù)組IL-6、TNF-α、CRP明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05；表3)。

表3 5組大鼠血清IL-6與TNF-α與CRP水平比較

2.3 5組大鼠GRP78 mRNA與CHOP mRNA表達水平比較

與空白組比較，其余各組GRP78、CHOP mRNA表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，各個治療組GRP78、CHOP mRNA表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與水中運動組比較，綜合康復(fù)組GRP78、CHOP mRNA表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表4)。

表4 5組大鼠GRP78 mRNA與CHOP mRNA表達水平比較

2.4 5組大鼠動脈細胞凋亡情況比較

光鏡下TUNEL法檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組、水中運動組、中藥內(nèi)治組、綜合康復(fù)組動脈CAI顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，水中運動組、中藥內(nèi)治組、綜合康復(fù)組心肌細胞凋亡率明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與水中運動組比較，綜合康復(fù)組動脈CAI明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖1；表5)。

圖1 5組大鼠動脈細胞凋亡情況Figure 1 Aorta cell apoptosis in five groups(TUNEL×200)The nucleus of normal cells were blue, the nucleus of apoptotic cells brown, and the nucleus of normal cells were larger than that of apoptotic cells. The red arrows indicate apoptotic cells; few apoptotic cells can be observed in the blank group; lots of apoptotic cells can be observed in the model group; less apoptotic cells can be observed in AE group, CMIT group and CMIT+AE group. AE: aquatic exercise; CMIT: Chinese medicine internal treatment; TUNEL: terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling.

表5 各組大鼠動脈細胞凋亡情況比較Table 5 Comparison of CAI in aorta tissue among five groups (n=25，%， ±s)

3 討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是合成蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及調(diào)控鈣離子平衡的細胞器，細胞內(nèi)外病理性刺激均可擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未/錯誤折疊蛋白質(zhì)蓄積，導(dǎo)致ERS發(fā)生[8]。ERS發(fā)生時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白感受器肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme1,IRE-1)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor6,ATF6)及蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)分離，以激活未折疊蛋白反應(yīng)，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[9]，但持續(xù)的ERS未被糾正時，IRE-1、ATF6及PERK將激活下游的凋亡信號分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteine-containing aspartate specific protease 12，Caspase-12)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,c-JNK)、CHOP，啟動相應(yīng)Caspases-12、c-JNK、CHOP 3條ERS凋亡路徑，導(dǎo)致細胞凋亡[10]。

本研究利用鏈脲佐菌素破壞大鼠胰島β細胞并聯(lián)合高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)AS病變，以模擬糖尿病并發(fā)AS的病理過程。實驗結(jié)束后，主動脈TUNEL染色觀察到模型組大量動脈細胞凋亡，而經(jīng)過8周康復(fù)治療干預(yù)的3個治療組動脈細胞凋亡水平較模型組均明顯降低，其中以綜合康復(fù)組下降程度最為明顯。同時qRT-PCR結(jié)果顯示，各實驗組動脈細胞中ERS標(biāo)志物分子GRP78、CHOP的mRNA轉(zhuǎn)錄水平依次為模型組>水中運動組>中藥內(nèi)治組>綜合康復(fù)組，表明實驗中糖尿病AS大鼠動脈細胞發(fā)生過度ERS，并存在CHOP凋亡通路激活，而水中運動和中藥內(nèi)治干預(yù)均可降低動脈細胞ERS，抑制CHOP凋亡通路，減少動脈細胞凋亡，且兩者抗凋亡效果可疊加。實驗進一步對綜合康復(fù)療法對抗糖尿病AS的可能機制進行了探究，ELISA及全自動生化儀檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠存在顯著的高血糖、高血脂及高炎癥水平狀態(tài)。長期血糖變異將增加動脈僵硬風(fēng)險[11]，持續(xù)血脂代謝紊亂也使ASCVD風(fēng)險大幅升高[12]，AS合并糖尿病的病理機制和治療也更為復(fù)雜，此時單純降脂療法對AS病變改善不佳，但當(dāng)聯(lián)合降糖治療時可觀察到粥樣斑塊縮小[13]。本研究中綜合康復(fù)組GHb、TG均明顯降低，同時動脈細胞凋亡水平明顯下降，提示綜合康復(fù)方案具有改善糖尿病AS的潛在臨床應(yīng)用價值。LDL-C水平升高可直接損傷動脈平滑肌細胞，氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)可激活CHOP凋亡通路，引發(fā)內(nèi)皮細胞凋亡[14]，HDL-C則可抑制LDL-C氧化修飾，對抗LDL-C危害[15]，本研究綜合康復(fù)組LDL-C降低的同時，可觀察到HDL-C水平的升高。AS也被認為是一種炎癥性疾病，IL-6、TNF-α與粥樣斑塊形成、破裂及血栓形成有關(guān)，其所參與的炎癥反應(yīng)貫穿AS全程，由巨噬細胞分泌的TNF-α可使平滑肌細胞凋亡[16]。血清CRP水平異常可影響內(nèi)皮細胞一氧化氮(nitricoxide，NO)生物利用，促發(fā)內(nèi)皮細胞功能障礙[17],而本研究3個治療組均可觀察到IL-6、TNF-α及CRP水平明顯降低。此外，大量研究表明ERS所介導(dǎo)的動脈細胞凋亡機制雖然復(fù)雜，但與血糖、血脂代謝紊亂和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[18]，因此改善糖尿病基礎(chǔ)病情也可能是本研究中糖尿病AS大鼠動脈細胞凋亡水平降低的重要原因。

綜上所述，水中運動聯(lián)合中藥內(nèi)治可改善糖尿病AS大鼠的血糖、血脂代謝異常及炎癥反應(yīng)，抑制ERS，下調(diào)促凋亡信號分子GRP78、CHOP的mRNA表達水平，減少動脈細胞凋亡，對糖尿病AS發(fā)揮治療作用。