馬亮亮，陳雪林，楊新婷

(1北京老年醫(yī)院感染科，北京 100095；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院結(jié)核三科，北京 101125)

結(jié)核性胸膜炎(tuberculous pleurisy,TBP)是由于結(jié)核分枝桿菌侵犯胸膜引發(fā)的遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)。2018年我國對結(jié)核病重新分類，將結(jié)核性胸膜炎歸為第5型肺結(jié)核[1]。在我國，結(jié)核性胸膜炎占結(jié)核病患者的6.5%～8.7%，結(jié)核性胸膜炎是胸腔積液的主要原因[2]。目前結(jié)核性胸膜炎的診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”仍是菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌，但培養(yǎng)的陽性率不超過40%[3]，且在胸水中難以檢測出結(jié)核分枝桿菌，有時需要手術(shù)胸膜活檢、微生物學(xué)、分子生物學(xué)等檢測來提供診斷依據(jù)。但臨床上培養(yǎng)時間長，易延誤診斷。胸膜活檢和胸腔鏡陽性率達(dá)80%以上，但其均為有創(chuàng)操作，臨床上難以大范圍開展，難以成為常規(guī)診斷手段。以上檢測方法的局限性使其均不能滿足臨床的迫切需求。

胸腔積液腺苷脫氨酶(adenosine deamianse，ADA)是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有關(guān)的嘌呤代謝酶，是臨床常用的診斷結(jié)核性胸膜炎的重要指標(biāo)[4]。γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma releas assay,IGRAs)近年來也廣泛應(yīng)用于臨床。診斷是否存在結(jié)核桿菌感染時，通常以外周靜脈血為標(biāo)本，用胸腔積液作為標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)檢查的報道較少。本研究用胸腔積液行結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗(T cell spot test，T-SPOT.TB)，探討其輔助診斷結(jié)核性胸膜炎的臨床價值。結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥基因(mycobacterium tuberculosis/rifampicin resistance gene，Xpert MTB/RIF)檢測是一種快速、自動化的分子檢測方法，通過檢查胸腔積液中是否存在結(jié)核桿菌DNA來診斷，2013年世界衛(wèi)生組織推薦其用于肺外結(jié)核病的診斷[5]。近年來，有報道將Xpert MTB/RIF檢測應(yīng)用于胸腔積液的化驗，我國在這方面研究較少，且其對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值尚未明確。因此需要開發(fā)更準(zhǔn)確、高效的方法來快速診斷結(jié)核性胸膜炎，提高診斷水平，更好的為臨床診療工作服務(wù)。

本研究通過對胸腔積液進(jìn)行Xpert MTB/RIF、T-SPOT.TB和ADA檢測，評價各項檢測指標(biāo)的靈敏度及特異度,并探討聯(lián)合檢測對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019年1月至2021年4月就診于北京老年醫(yī)院感染科的胸腔積液患者為研究對象。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入167例。入選患者中結(jié)核性胸膜炎114例(結(jié)核性胸膜炎組)，其中男性68例，女性46例；年齡( 47.52±22.05)歲。非結(jié)核性胸膜炎53例(非結(jié)核性胸膜炎組)，其中男性33例，女性20例；年齡( 54.26±23.27)歲。結(jié)核性胸膜炎組中68例患者經(jīng)胸腔積液涂片(或培養(yǎng))抗酸桿菌陽性或胸膜活檢病理提示結(jié)核干酪性肉芽腫伴(或不伴)抗酸桿菌陽性；另外46例患者為臨床診斷。非結(jié)核性胸膜炎組，包括肺炎旁胸腔積液11例，肺部真菌感染4例，肺癌胸膜轉(zhuǎn)移24例，胸膜間皮瘤3例，乳糜胸2例，風(fēng)濕性疾病2例，漏出液7例。

結(jié)核性胸膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：(1)胸腔積液找到結(jié)核分枝桿菌；(2)胸膜活檢病理表現(xiàn)為典型結(jié)核改變；(3) 臨床有發(fā)熱、盜汗、咳嗽等典型感染結(jié)核中毒癥狀；(4)胸部影像學(xué)提示有結(jié)核病灶；(5)胸腔積液為滲出液；(6)結(jié)核抗體檢查陽性；(7)結(jié)核菌素試驗表現(xiàn)為中度陽性或強(qiáng)陽性；(8)血γ干擾素釋放試驗陽性；(9)排除其他原因的胸腔積液，且抗結(jié)核治療有效。

結(jié)核性胸膜炎納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有低熱、盜汗、乏力、消瘦等結(jié)核中毒癥狀；(2)超聲提示胸腔積液，胸部CT伴或不伴結(jié)核病變；(3)胸水化驗是以單核細(xì)胞為主的滲出液，ADA≥40 U/L；(4)抗癆治療有效，胸水明顯吸收；(5)胸膜活檢有典型結(jié)核病變(如結(jié)核性肉芽腫或干酪樣病變)。

非結(jié)核性胸腔積液納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺炎旁積液，經(jīng)檢查細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)、影像學(xué)及療效等證實；(2)胸腔積液，病理細(xì)胞學(xué)檢查或胸膜組織病理學(xué)檢查明確腫瘤；(3)胸腔積液為滲出液，涂片及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陰性，根據(jù)臨床表現(xiàn)、實驗室、影像學(xué)及療效等證實。

排除標(biāo)準(zhǔn)：上述患者診斷均依據(jù)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],同時排除人類免疫缺陷病毒感染、妊娠、自身免疫系統(tǒng)疾病、有免疫抑制劑用藥史、其他臟器疾病終末期及血性胸腔積液。

1.2 方法

1.2.1 Xpret MTB/RIF檢測 取20 ml胸腔積液離心15 min，棄上清，加入2 ml處理液后置入基因平臺內(nèi)自動運行。2 h后自動讀取利福平的耐藥結(jié)果與結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果。對照探針Ct值≤38為陽性，對照探針Ct值>38為陰性。

1.2.2 T-SPOT.TB檢測 取10 ml胸腔積液，加入肝素抗凝，分離單個核細(xì)胞，洗滌后對細(xì)胞計數(shù)，培養(yǎng)濾液蛋白10結(jié)核特異抗原前期所分泌抗原靶蛋白6及單個核細(xì)胞，同時置入有γ干擾素抗體反應(yīng)孔內(nèi)，對斑點進(jìn)行計數(shù)，如果測試孔中的斑點數(shù)減去對照孔中的斑點數(shù)≥6，或兩個測試孔中的斑點計數(shù)至少是陰性對照孔的2倍，為陽性，反之則為陰性。

1.2.3 ADA檢測 取2～3 ml胸腔積液置于無菌管中，離心5 min后,取上清液，吸入樣本杯上機(jī)進(jìn)行檢測。檢測儀采用德國西門子全自動生化儀和邁克生物股份有限公司試劑盒，按試劑盒說明書，參考值≥25 U/L為陽性，<25 U/L為陰性。

1.2.4 聯(lián)合檢測 分別對2組患者胸腔積液進(jìn)行Xpert MTB/RIF、T-SPOT.TB和ADA檢測，比較不同檢測方法靈敏度和特異度的差異。(1)串聯(lián)試驗：2項或3項分別進(jìn)行比較時，檢測結(jié)果均為陽性視為陽性；任意一項檢測結(jié)果為陰性視為陰性；(2)并聯(lián)試驗：2項或3項分別進(jìn)行比較時，其中任意一項檢測結(jié)果為陽性視為陽性，檢測結(jié)果均為陰性視為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同檢測方法診斷水平比較

Xpert MTB/RIF檢測：結(jié)核性胸膜炎組陽性43例，未見利福平耐藥病例。Xpert MTB/RIF診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度和特異度分別為37.72%和100.00%。T-SPOT.TB檢測：結(jié)核性胸膜炎組T-SPOT.TB檢測陽性93例，陰性21例；而非結(jié)核性胸膜炎組T-SPOT.TB檢測陽性10例，陰性43例。T-SPOT.TB診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度和特異度分別為81.58%和81.13%。ADA檢測：結(jié)核性胸膜炎組胸腔積液ADA[50.6(12.6，66.6)U/L]明顯高于非結(jié)核性胸膜炎組[14.9(8.6，29.2)U/L]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-4.273，P=0.000)。ADA診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度和特異度分別為73.68%和71.70%(表1)。

2.2 不同檢測方法診斷價值比較

胸腔積液患者ADA單獨檢測的靈敏度(73.68%)>Xpert MTB/RIF(37.72%)>羅氏培養(yǎng)(23.68%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=29.880，5.277；P<0.05)；胸腔積液T-SPOT.TB單獨檢測的靈敏度(81.58%)與ADA單獨檢測的靈敏度(73.68%)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.046，P>0.05)。Xpert MTB/RIF單獨檢測的特異度(100.00%)和羅氏培養(yǎng)單獨檢測的特異度(100.00%)均高于T-SPOT.TB單獨檢測特異度(81.13%)，也高于ADA的特異度(71.70%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.042，11.042，17.473，17.473；P<0.05)。T-SPOT.TB單獨檢測特異度(81.13%)與ADA單獨檢測特異度(71.70%)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.309，P>0.05；表1)。

表1 不同檢測方法對結(jié)核性胸膜炎的診斷價值比較Table 1 Comparison of diagnostic value of different detection methods for tuberculous pleurisy

2.3 3種檢測方法聯(lián)合檢測的價值

串聯(lián)試驗：T-SPOT.TB+ADA檢測靈敏度(60.53%)明顯高于Xpert MTB/RIF+ADA(35.96%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.081，P<0.001)；Xpert MTB/RIF+T-SPOT.TB靈敏度(31.58%)和Xpert MTB/RIF+ADA靈敏度(35.96%)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.490，P>0.05)。兩者或三者串聯(lián)檢測,特異度無顯著差異(P>0.05)。故3種檢測方法串聯(lián)檢驗時，靈敏度與特異度無顯著提高(表2)。

表2 3種檢測方法串聯(lián)試驗的診斷價值比較Table 2 Comparison of diagnostic value of series test of three detection methods

并聯(lián)試驗：胸腔積液T-SPOT.TB或ADA檢測靈敏度(94.74%)明顯高于單獨ADA檢測(73.68%)及單獨T-SPOT.T檢測(81.58%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.000，9.453；P<0.05)。Xpert MTB/RIF或T-SPOT.TB靈敏度(87.72%)、T-SPOT.TB或ADA靈敏度(94.74%)、Xpert TB/RIF 或T-SPOT.TB或ADA靈敏度(96.49%)分別與Xpert MTB/RIFor或ADA靈敏度(75.44%)檢測比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.720，16.730，20.939；P<0.05)；而T-SPOT.TB或ADA靈敏度(94.74%)與T-SPOT.TB或ADA或Xpert TB/RIF靈敏度(96.49%)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.418，P>0.05)。T-SPOT.TB或ADA(62.26%)與T-SPOT.TB或ADA或Xpert MTB/RIF特異度(62.26%)相同，均低于Xpert MTB/RIF或T-SPOT.TB(81.13%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.649，4.649;P<0.05)；其余組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；表3)。

表3 3種檢測方法并聯(lián)試驗的診斷價值Table 3 Diagnostic value of parallel test of three detection methods

3 討 論

從胸水中獲得結(jié)核分枝桿菌檢測陽性證據(jù)或胸膜活檢組織符合典型的結(jié)核病理學(xué)改變，方能明確結(jié)核性胸膜炎的診斷，但目前臨床上無論是胸腔積液還是胸膜活檢，獲得確診證據(jù)較難，結(jié)核性胸膜炎臨床表現(xiàn)和胸水檢測特異性較差。因此，需要積極尋找有效的檢測手段，Xpert MTB/RIF、T-SPOT.TB均為近年來適用臨床的新檢測方法。

Xpert MTB/RIF檢測為核酸擴(kuò)增檢測方法，可在2 h內(nèi)檢測出標(biāo)本是否存在結(jié)核分枝桿菌DNA和利福平耐藥相關(guān)基因，使獲得結(jié)核病細(xì)菌學(xué)證據(jù)的時間大大縮短，具有較高價值[8]。Sehagl等[9]對21個研究中Xpert-MTB/RIF檢測對結(jié)核性胸腔積液的診斷價值進(jìn)行meta分析，結(jié)果顯示2 167例結(jié)核性胸膜炎患者匯總靈敏度為51.4%，特異度為98.0%。Akhter等[10]應(yīng)用Xpert MTB/RIF技術(shù)對134例結(jié)核性胸膜炎患者檢測靈敏度為52.2%，特異度為100.00%。本研究結(jié)果顯示Xpert MTB/RIF檢測對于結(jié)核性胸膜炎靈敏度僅為37.72%，低于之前的研究，特異度為100.00%符合上述研究，且43例Xpert MTB/RIF檢測的陽性患者中均無利福平耐藥情況。分析可能的原因為胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌負(fù)荷量低[11]，如發(fā)生rpoB基因利福平耐藥區(qū)RRDR突變的細(xì)菌負(fù)荷量低有關(guān),而且當(dāng)?shù)陀跈z測最低限時，也會出現(xiàn)假陰性。提示Xpert MTB/RIF檢測對結(jié)核性胸膜炎靈敏度低，近期有報道超敏結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥基因檢測(Xpert MTB/RIF Ultra)是在Xpert MTB/RIF基礎(chǔ)上進(jìn)行了技術(shù)改良，使檢測靶標(biāo)極限提高，可明顯調(diào)高靈敏度，待進(jìn)一步行臨床研究。

T-SPOT.TB檢測近年來逐漸推廣并應(yīng)用于臨床，是目前臨床常用的γ-干擾素釋放試驗檢測方法。它利用結(jié)核特異抗原早期分泌靶向抗原6 ku蛋白及培養(yǎng)濾過蛋白10，通過酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)檢測體內(nèi)是否存在結(jié)核桿菌效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，判斷受試者是否感染結(jié)核桿菌，靈敏度高，特異性強(qiáng)。與結(jié)核桿菌純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)相比，T-SPOT.TB陽性可排除卡介苗接種及完成的大部分非結(jié)核分枝桿菌感染。Aggarwal等[12]完成的meta分析顯示，胸腔積液T-SPOT.TB檢測匯總靈敏度為72.0%，匯總特異度為78.0%。Luo等[13]在武漢和廣州2家醫(yī)院分別對218例和210例患者采用T-SPOT.TB技術(shù)檢測胸腔積液行診斷性評價，2個研究中心的靈敏度和特異度均在90.0%左右。本研究胸腔積液T-SPOT.TB檢測靈敏度為81.85%，特異度為81.13%。在非結(jié)核性胸膜炎組有10例檢測結(jié)果陽性，其中惡性胸腔積液4例，肺炎旁積液2例，漏出液2例,乳糜胸1例，風(fēng)濕性胸腔積液1例。分析假陽性原因[14]：(1)此檢驗技術(shù)無法區(qū)分潛伏感染還是活動性結(jié)核??；(2)癌癥的某些腫瘤抗原有可能與兩種結(jié)核抗原有交叉表位，易引起免疫反應(yīng)；(3)患者存在常規(guī)檢測不出的肺外結(jié)核??；(4)感染同時并發(fā)一過性感染，也可出現(xiàn)T-SPOT.TB陽性可能；(5)部分非結(jié)核分枝桿菌感染時，也會出現(xiàn)陽性可能。

ADA是一種與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有密切關(guān)系的核酸代謝酶，在淋巴細(xì)胞中分布最高，是目前臨床診斷結(jié)核性胸膜炎的常規(guī)檢測項目。Mollo等[15]研究顯示，胸腔積液ADA診斷結(jié)核性胸膜炎的靈敏度為88.0%～100.0%，特異度為81.0%～97.0%。本研究ADA檢測的靈敏度和特異度分別為73.68%和71.70%。非結(jié)核性胸膜炎組有15例假陽性，考慮其他疾病也可能引起胸腔積液的ADA升高，最常見的是肺炎旁積液，其中有1/3患者ADA增高；膿胸也會有2/3患者胸水中ADA升高現(xiàn)象；風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、布氏桿菌病、惡性腫瘤、斑疹傷寒、球孢子菌病等也可引起ADA升高。李雪蓮等[16]研究顯示，當(dāng)Xpert TB/RIF、T-SPOT.TB、ADA 3種檢測串聯(lián)時，2項和3項組合特異度均可達(dá)100%，但靈敏度較低。并聯(lián)時，三者并聯(lián)靈敏度最高，達(dá)97.8%，提示聯(lián)合檢測是最優(yōu)的選擇。本研究結(jié)果顯示，Xpert TB/RIF和T-SPOT.TB，Xpert MTB/RIF和ADA，Xpert TB/RIF和T-SPOT.TB和ADA組合的特異度均達(dá)到100%。特異度方面2項和3項聯(lián)合檢測無顯著差異。3項并聯(lián)檢測、T-SPOT.TB或ADA檢測均有較高的靈敏度，但無統(tǒng)計學(xué)差異，故T-SPOT.TB或ADA檢測聯(lián)合Xpert TB/RIF并沒有提高靈敏度和特異度。而T-SPOT.TB和ADA的聯(lián)合檢測均較單獨檢測靈敏度高，且串聯(lián)時特異度也較高。本研究結(jié)果提示，單獨檢測手段都有自己的局限性，對胸腔積液行T-SPOT.TB與ADA的聯(lián)合檢測具有較高的靈敏度和特異度，同時結(jié)合臨床資料加以分析，可提高早期結(jié)核性胸膜炎的診斷效能。