崔璐璐，陳季旺，2*，王玉環(huán)，廖 鄂，2，王 琦，2，夏文水，3

（1 武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 武漢 430023 2 大宗糧油精深加工教育部重點實驗室（武漢輕工大學(xué)） 武漢 430023 3 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇 無錫 214122）

油炸外裹糊食品是在食品原料表面裹上由小麥粉、鹽、水等復(fù)配的糊，再裹上一層面包糠，經(jīng)深度油炸后制得的一類風(fēng)味食品，例如：油炸肉制品、果蔬制品和海鮮制品等[1-2]。外裹糊作為外層屏障，在油炸過程中發(fā)生一系列的物理和化學(xué)變化，包括水分蒸發(fā)、淀粉糊化和蛋白質(zhì)變性等，形成一層金黃色保護(hù)層，使食品原料不直接與高溫油接觸，可以保持食品原料內(nèi)的水分和鮮味，減少營養(yǎng)成分的流失，賦予油炸外裹糊食品酥脆外殼，具有色澤誘人、濃郁香味等特點。同時，深度油炸也可以殺滅食品中的細(xì)菌，延長食品保質(zhì)期，改善食品風(fēng)味，增強(qiáng)食品營養(yǎng)成分的消化性，其加工時間比一般的烹調(diào)方法短，深受國內(nèi)外消費者的喜愛。

然而，油炸外裹糊食品的油脂含量過高，占食品質(zhì)量的三分之一，有的甚至高達(dá)50%，長期食用高油脂含量的油炸外裹糊食品容易造成肥胖，導(dǎo)致各種心血管疾病[3-5]。這使低脂油炸外裹糊食品成為油炸食品的研究熱點。目前，降低油炸外裹糊食品油脂含量的方法主要有：添加可食性成分，采用預(yù)處理工序（例如：熱風(fēng)干燥、微波干燥、熱水浸泡處理等），改變油炸介質(zhì)，物理法脫油（例如：過熱蒸汽脫油和真空高速離心脫油等）[4]。其中，添加可食性成分是一種常用的減脂方法，向基礎(chǔ)外裹糊中添加蛋白質(zhì)和多糖等可有效降低油炸食品的油脂含量[5-9]。

蛋白質(zhì)具有營養(yǎng)價值高，易消化，功能性強(qiáng)（例如：保水性、乳化性、凝膠性等）的特點，將蛋白質(zhì)作為可食性成分，以降低油炸食品油脂含量的研究，近年來受到很多學(xué)者的關(guān)注[2-3，5，10]。在外裹糊中添加蛋白質(zhì)能夠改善外殼的致密性和切面的平整度；形成的蛋白質(zhì)凝膠為立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，既能束縛水分又可作為風(fēng)味物質(zhì)的載體[11]。同時，蛋白質(zhì)良好的持水能力在深度油炸過程中可以減少油脂的吸收，從而抑制油脂的滲透[12]。Chen 等[13]在含玉米和小麥粉的外裹糊中分別加入1%小麥蛋白、1%大豆蛋白、1%羥丙基甲基纖維素（HPMC）制備油炸外裹糊魚塊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含1%小麥蛋白和1%大豆蛋白的外殼硬度和脆度均高于對照（未添加成分），且色澤金黃。Susanne 等[14]通過將大豆分離蛋白、酪蛋白酸鈉、乳清蛋白、甲基纖維素等11 種可食性成分對谷物制品進(jìn)行涂膜，比較這些成分對油炸谷物制品的品質(zhì)、水分和油脂含量等的影響，結(jié)果顯示，大豆分離蛋白、乳清蛋白和甲基纖維素顯著降低了油炸制品的油脂含量，尤其是10%的大豆分離蛋白涂膜使產(chǎn)品的吸油率降低80%。Dogan 等[15]將大豆分離蛋白、乳清分離蛋白及蛋清蛋白添加到外裹糊中，研究蛋白質(zhì)種類對油炸外裹糊雞肉塊品質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種蛋白質(zhì)均能抑制油炸過程油脂的滲透，其中乳清分離蛋白和蛋清蛋白能顯著降低油脂含量。

本課題組前期研究表明：在外裹糊中分別添加大豆蛋白、乳清蛋白、蛋清蛋白、大米蛋白，能夠明顯抑制外裹糊魚塊深度油炸過程的油脂吸收[16]。然而，在模式外裹糊體系（高純度的小麥淀粉和小麥面筋蛋白）中添加蛋白質(zhì)，研究蛋白質(zhì)抑制外裹糊魚塊在深度油炸過程中油脂滲透的機(jī)制未見報道。添加的蛋白質(zhì)與小麥淀粉、小麥面筋蛋白相互作用抑制油脂滲透的機(jī)制尚不清楚。本試驗在模式外裹糊中分別添加大豆蛋白、蛋清蛋白、乳清蛋白和大米蛋白（添加量均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%），經(jīng)170 ℃初炸40 s 后190 ℃復(fù)炸30 s，制作油炸外裹糊魚塊，通過分析外殼中蛋白質(zhì)的表面疏水性、巰基和二硫鍵含量、熒光強(qiáng)度和二級結(jié)構(gòu)，小麥淀粉晶體結(jié)構(gòu)，油炸外裹糊魚塊的表面油脂和表面滲透油脂含量及油脂的滲透與分布規(guī)律，從蛋白質(zhì)之間及蛋白質(zhì)與小麥淀粉相互作用的角度，探討添加蛋白質(zhì)抑制油脂滲透的機(jī)制，為低脂油炸外裹糊魚制品的規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚魚糜，洪湖市新宏業(yè)食品有限公司；金龍魚大豆油，益海嘉里（武漢）糧油工業(yè)有限公司；小麥淀粉（水分含量10.9%，淀粉含量87.2%）、小麥面筋蛋白（水分含量7.5%，蛋白質(zhì)含量81.9%），北京瑞麥嘉禾商貿(mào)有限公司；面包糠（粒徑＜2 mm），無錫圣倫特國際貿(mào)易有限公司；大豆蛋白（水分含量6.3%，蛋白質(zhì)含量87.4%），山東御馨生物技術(shù)有限公司；蛋清蛋白（水分含量5.2%，蛋白質(zhì)含量81.6%），大連綠雪蛋品發(fā)展有限公司；乳清蛋白（水分含量5.3%，蛋白質(zhì)含量81.8%），河南盛之德商貿(mào)有限公司；大米蛋白（水分含量5.5%，蛋白質(zhì)含量77.4%），無錫金農(nóng)生物科技有限公司。

考馬斯亮藍(lán)G250，天津大茂化學(xué)試劑廠；巰基乙醇（分析純），山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸 （1-Anilino-8-naphthalisene sulfonate，ANS）、磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7.0），上海源葉生物科技有限公司；Ellman's 試劑，北京科展生物科技有限公司；抗熒光猝滅劑，武漢谷歌生物科技有限公司；Nile Red 染料，Sigma 公司（圣路易斯）。

1.2 儀器與設(shè)備

F-4600 型熒光光譜儀，日本Hitachi 公司；FD-1-50 真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；7200 型可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；Bruker D8 Venture X-射線衍射儀，荷蘭帕納科公司；傅里葉紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；SZF-06C 脂肪測定儀，浙江托普儀器有限公司；XSP-BM-4C 光學(xué)顯微鏡，上海彼愛姆（BM）光學(xué)儀器制造公司；Cryotome E 冷凍切片機(jī)，美國Thermo 公司；LYMPUS FV1200 激光共聚焦掃描顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 油炸外裹糊魚塊的制作

1）制備魚糜腸 參考Weng 等[17]的方法并稍作修改。將大塊冷凍魚糜切成小塊（約500 g）室溫（25 ℃）解凍，1 200 r/min 空斬5 min，再添加1%的食鹽，2 000 r/min 鹽斬7 min。取出魚糜，放入灌腸機(jī)進(jìn)行灌腸封口，置于-18 ℃冰箱冷凍成型備用。

2）調(diào)制外裹糊 將小麥淀粉（91.67 g）、小麥面筋蛋白（8.33 g）和添加蛋白質(zhì)（6%，以小麥淀粉和小麥面筋蛋白為基準(zhǔn)）依次加入不銹鋼盆中，用筷子攪拌混合均勻后緩慢加入98 g 的水，邊加邊攪拌至充分混合，用保鮮膜封住盆口防止水分損失，精密攪拌機(jī)以1 000 r/min 攪拌10 min，調(diào)制成均勻的外裹糊。

3）裹糊、油炸 將冷凍魚糜腸室溫（25 ℃）解凍，切成質(zhì)量約為5 g 的圓柱形魚塊 （直徑2.5 cm，長約1.5 cm），浸沒在配制好的外裹糊中，約10 s 后緩慢取出，待魚塊上的外裹糊不成股滴下時進(jìn)行二次裹糊。將裹好外裹糊的魚塊放入盛有面包糠的不銹鋼盆中，抖動面包糠，使面包糠均勻黏附在魚塊表面制成外裹糊魚塊。將3 L 新鮮大豆油倒入油炸鍋，待油溫升至170 ℃放入外裹糊魚塊，每次投入量為4 塊，初炸40 s 后撈出放在濾網(wǎng)中，使油溫升至190 ℃復(fù)炸30 s，且油炸過程中不斷用筷子翻動魚塊，使其受熱均勻。油炸完成后用笊籬撈出魚塊，放入不銹鋼濾網(wǎng)中室溫（25 ℃）冷卻1 h，自然瀝去表面多余的油脂。

1.3.2 熒光強(qiáng)度

1）蛋白質(zhì)溶液的制備 用不銹鋼手術(shù)刀將外殼剝下，在-80 ℃的超低溫冰箱中冷凍4 h，放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥48 h，再用高速粉碎機(jī)粉碎。取2.5 g 粉碎的外殼放入100 mL 離心管中，加入25 mL 磷酸鹽緩沖液 （0.01 mol/L，pH 7.0），冰水浴條件下均質(zhì)機(jī)以20 000 r/min 勻漿1 min，再在4 ℃，8 000 r/min 離心15 min，取上清液，重復(fù)離心至上清液澄清。采用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液的蛋白質(zhì)濃度后，通過稀釋使得上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg/mL。

2）測定方法 采用F-4600 型熒光光譜儀測定，參數(shù)設(shè)置：激發(fā)波長280 nm；發(fā)射光譜300～450 nm；狹縫寬度2.5 nm；掃描速度240 nm/min；電壓700 V。以磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0）為空白對照[18]。

1.3.3 表面疏水性 參照Tang 等[19]的方法并稍作修改，采用ANS 作為熒光探針測定外殼中蛋白質(zhì)的表面疏水性。按照1.3.2 節(jié)步驟（1）的方法制備蛋白質(zhì)溶液，并用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度。分別取0.4，1.2，2，2.8，3.6 mL 上清液，加入磷酸鹽緩沖溶液混合至4.0 mL，再加入40 μL ANS溶液（8 mmol/L），漩渦振蕩混勻后靜置5 min，在激發(fā)波長390 nm 和發(fā)射波長490 nm 下測其熒光強(qiáng)度（FI）。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，初始段的斜率即為外殼中蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.3.4 巰基和二硫鍵 參照Tang 等[19]的方法并稍作修改，采用Ellman's 試劑比色法測定外殼中蛋白質(zhì)的-SH 和S-S 含量。

1）配制溶液 Tris-Gly 緩沖液：精確稱量5.2085 g Tris、3.3781 g Gly、0.5855 g 乙二胺四乙酸（EDTA），用0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至8.0，加蒸餾水定容至500 mL。

含8 mol/L 尿素的Tris-Gly 溶液：在200 mL Tris-Gly 溶液中加入96.096 g 尿素。

12%三氯乙酸（TCA）溶液：稱量12 g 三氯乙酸，加蒸餾水定容至100 mL。

2）蛋白質(zhì)溶液的制備 按照1.3.2 節(jié)步驟（1）的方法制備蛋白質(zhì)溶液，并用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（C）。

3）巰基含量的測定 在1 mL 蛋白質(zhì)溶液中加入4 mL Tris-Gly 緩沖液和0.05 mL Ellman's試劑（4 mg/mL，用Tris-Gly 緩沖溶液配制），漩渦振蕩混勻后在25 ℃下保溫反應(yīng)10 min，用分光光度計測定波長為412 nm 處的吸光值（A412nm）。根據(jù)公式（1）計算游離巰基的含量。

式中，μSH——游離巰基含量（μmol/g）；C——蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）；D2——稀釋系數(shù)。

4）二硫鍵含量的測定 在1 mL 蛋白質(zhì)溶液中加入4 mL Tris-Gly 緩沖液和0.05 mL 巰基乙醇，漩渦振蕩混勻后在室溫（25 ℃）下保溫1 h，再加入10 mL 12%的TCA 溶液，漩渦振蕩混勻后繼續(xù)保溫1 h，8 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，沉淀加5 mL 12%TCA 溶液洗滌，磁力攪拌后再離心，重復(fù)2 次除去巰基乙醇。取沉淀物加10 mL Tris-Gly 緩沖液溶解，混合均勻后取4 mL，加0.04 mL Ellman's 試劑，漩渦振蕩混勻后在25 ℃下保溫反應(yīng)10 min，用分光光度計測定在412 nm 下吸光度值（A412nm）。按照公式（2）計算總巰基含量，按公式（3）計算二硫鍵含量。

式中，μ′SH——總巰基含量 （μmol/g）；μSS——二硫鍵含量（μmol/g）；C——蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）；D2——稀釋系數(shù)。

1.3.5 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 取30 g 左右的外殼，用正己烷脫油。將脫油后的外殼冷凍干燥48 h，再用高速粉碎機(jī)粉碎，過100 目篩，備用。取適量外殼粉末與溴化鉀（光譜純）按1∶100 質(zhì)量比于瑪瑙研缽中混合研磨至粉末狀，裝樣并壓制成透明薄片，放入傅里葉紅外光譜儀，做全波段掃描測定，純溴化鉀為空白對照。參數(shù)設(shè)置：掃描波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)16 次，分辨率4.0 cm-1，主要測量1 700～1 600 cm-1內(nèi)酰胺Ⅰ譜帶，采用Peakfit 軟件對酰胺I 帶進(jìn)行擬合（R2＞0.99）[20]。

1.3.6 小麥淀粉的晶體結(jié)構(gòu) 取30 g 左右的外殼，用正己烷脫油，用研缽研磨后過100 目篩，備用。取適量外殼粉末置于帶矩形凹槽的專用玻璃片中，放入Bruker D8 X-射線衍射儀中測定，特征射線選擇Cu 靶，參數(shù)設(shè)置：電壓40 kV，電流40 mA，測量角度范圍2θ 為3°～60°，步長0.02°，發(fā)散和防發(fā)散狹縫均為1 mm，接受狹縫0.1 mm，掃描速度為4°/min。每個樣品約掃描15 min，利用MDI Jade 6 軟件計算淀粉的相對結(jié)晶度，見公式（4）[21]。

式中，S0——XRD 衍射圖中結(jié)晶區(qū)面積；S1——XRD 衍射圖中無定形區(qū)面積。

1.3.7 表面油脂和表面滲透油脂

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在大豆油中添加蘇丹紅B 配制成不同質(zhì)量濃度（0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 g/L）的蘇丹紅油液，在30 ℃磁力加熱攪拌器上加熱攪拌24 h，使蘇丹紅B 完全溶解。用石油醚以體積比將每個濃度的蘇丹紅油液稀釋40 倍，然后用可見分光光度計在波長510 nm 處測其吸光值（A510nm）。以吸光值為橫坐標(biāo)，蘇丹紅油溶液濃度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2）表面油脂含量的測定 采用質(zhì)量濃度為0.4 g/L 蘇丹紅油液制作油炸外裹糊魚塊，炸制后質(zhì)量為m0。在250 mL 的干凈燒杯中加入100 mL的石油醚，將油炸外裹糊魚塊放入石油醚中浸泡10 s 立即取出，再將石油醚轉(zhuǎn)移到恒重的抽提瓶中（恒重質(zhì)量：m1），采用脂肪測定儀回收石油醚，然后將抽提瓶放入105 ℃的烘箱中干燥至恒重（m2），表面油脂的質(zhì)量m=m2-m1。根據(jù)公式（5）計算表面油脂含量。

3）表面滲透油脂含量的測定 將已經(jīng)除去表面油脂的油炸外裹糊魚塊粉碎至直徑不超過3 mm 的顆粒，用脂肪測定儀提取油脂，得到除去表面油脂的油炸外裹糊魚塊所含的油脂質(zhì)量m3。將提取的油脂用石油醚以體積比稀釋40 倍（V/V），在波長510 nm 處測吸光值（A510nm）。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出對應(yīng)的蘇丹紅油液的質(zhì)量濃度C1，根據(jù)公式（6）計算表面滲透油脂的含量[22]。

式中，C0——油炸外裹糊魚塊時蘇丹紅B 油溶液的質(zhì)量濃度（g/L）。

1.3.8 油脂分布 采用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）定性分析油炸外裹糊魚塊中油脂的分布[23]。首先將1 mg 尼羅紅溶解在10 mL 丙酮中，配制成0.01%的丙酮染液。在-20 ℃下，用冷凍切片機(jī)從油炸外裹糊魚塊表面切下完整的薄片（1 cm×1 cm×8 μm），固定在顯微鏡載玻片上，取適量染液滴在試樣薄片上，并放入4 ℃冰箱里避光染色3 h。染色結(jié)束后立即在試樣薄片上滴1 滴抗熒光猝滅劑封片，蓋上蓋玻片，將載玻片倒放在CLSM 的載物臺上觀察。參數(shù)設(shè)置：掃描模式像素800×800，拍照模式像素1 024×1 024；掃描速度為400 Hz；線頻為0.14 Hz；尼羅紅激發(fā)波長543 nm；發(fā)射波長638～768 nm，放大倍數(shù)10×。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel、Origin 和SPSS 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差“表示。其中方差分析采用ANOVA，顯著性分析采用Duncan 檢驗，P＞0.05 判定為差異不顯著，P＜0.05判定為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面疏水性和熒光強(qiáng)度

天然蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)緊密，疏水氨基酸側(cè)鏈位于分子內(nèi)部，H0的大小取決于疏水性基團(tuán)暴露程度[24]。熒光強(qiáng)度主要是色氨酸（Trp）殘基的熒光發(fā)射光譜，反映蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)變化，即蛋白質(zhì)之間以及其它成分與蛋白質(zhì)相互作用的構(gòu)象變化[25]。蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射峰的最大吸收波長（λmax）增大或減小表示最大吸收波長紅移或藍(lán)移，紅移表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，藍(lán)移表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊湊[26]。外殼中蛋白質(zhì)的H0和熒光強(qiáng)度見圖1。

圖1 外殼中蛋白質(zhì)的H0 和熒光強(qiáng)度Fig.1 H0 and tryptophan fluorescence emission spectra of protein in the crust

與對照相比，大豆蛋白組、蛋清蛋白組和乳清蛋白組的H0較高，而大米蛋白組的H0較低。大豆蛋白的結(jié)合水能力較強(qiáng)，外裹糊魚塊在深度油炸過程中抑制了淀粉的吸水膨脹，使大豆蛋白與小麥面筋蛋白接觸幾率增加。由于外殼中蛋白質(zhì)受熱變性展開，內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，使得H0增加[27]。蛋清蛋白、乳清蛋白結(jié)合水的能力弱于大豆蛋白，蛋白質(zhì)之間接觸幾率減小，蛋白質(zhì)展開程度較低；大米蛋白結(jié)合水的能力最差，蛋白質(zhì)展開程度最低，H0最小。小麥淀粉與5 種蛋白質(zhì)的水分吸附等溫線見圖2。

圖2 小麥淀粉和5 種蛋白質(zhì)的水分吸附等溫線Fig.2 Moisture adsorption isotherms for wheat starch and five proteins

對照的λmax為349 nm，大豆蛋白組和蛋清蛋白組的λmax從349 nm 增至351 nm，發(fā)生了紅移；乳清蛋白組和大米蛋白組的λmax從349 nm 減至341 nm，發(fā)生了藍(lán)移，說明添加大豆蛋白和蛋清蛋白，使外殼中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得松散，而乳清蛋白和大米蛋白使結(jié)構(gòu)緊湊。乳清蛋白組、蛋清蛋白組、大豆蛋白組的熒光強(qiáng)度小于對照，而大米蛋白組的熒光強(qiáng)度大于對照，這是由于大米蛋白結(jié)合水的能力最差，降低了蛋白質(zhì)分子之間接觸幾率，使得蛋白質(zhì)分子聚集較少，色氨酸被包埋的程度減小，因此熒光發(fā)射增強(qiáng)。

2.2 巰基和二硫鍵

巰基和二硫鍵是蛋白質(zhì)中重要的功能基團(tuán)，兩者含量的變化影響蛋白質(zhì)分子間的相互作用。巰基和二硫鍵之間的相互轉(zhuǎn)化及疏水相互作用，可以使蛋白質(zhì)聚集形成凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[27]。外殼中蛋白質(zhì)的巰基和二硫鍵含量見表1。

表1 外殼中蛋白質(zhì)的巰基和二硫鍵含量（μmol/g）Table 1 Free-SH and S-S contents of protein in the crust （μmol/g）

5 種天然蛋白質(zhì)的巰基和二硫鍵含量依次為：大豆蛋白＞乳清蛋白＞小麥面筋蛋白＞蛋清蛋白＞大米蛋白；小麥面筋蛋白＞乳清蛋白＞蛋清蛋白＞大米蛋白＞大豆蛋白。而外殼中蛋白質(zhì)的巰基和二硫鍵含量依次為：大米蛋白組＞大豆蛋白組＞對照＞乳清蛋白組＞蛋清蛋白組；乳清蛋白組＞大豆蛋白組＞蛋清蛋白組＞大米蛋白組＞對照。天然大豆蛋白的巰基含量最高，二硫鍵含量最低，而外殼中蛋白質(zhì)的巰基含量增加幅度較小，二硫鍵含量增加幅度較大；與大豆蛋白相比，天然蛋清蛋白的巰基含量較低，二硫鍵含量較高，而蛋清蛋白組外殼中二硫鍵含量低于大豆蛋白組，說明外裹糊魚塊在油炸過程中，添加蛋白質(zhì)與小麥面筋蛋白相互交聯(lián)，促進(jìn)了蛋白質(zhì)中的巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)化，且添加蛋白質(zhì)的結(jié)合水的能力越強(qiáng)，巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)化程度越高。這與表面疏水性和熒光強(qiáng)度的結(jié)果一致。在4 種添加蛋白質(zhì)中，天然乳清蛋白和外殼中蛋白質(zhì)的二硫鍵含量均最高，說明添加蛋白質(zhì)自身的凝膠性能也影響了外殼中蛋白質(zhì)的凝膠強(qiáng)度。大米蛋白組外殼中蛋白質(zhì)的巰基含量高于對照，且二硫鍵含量增加幅度較小，說明大米蛋白與小麥淀粉、小麥面筋蛋白相互作用對巰基和二硫鍵的影響小于大米蛋白自身。

2.3 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

傅里葉紅外光譜普遍用于分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。由于酰胺Ⅰ（1 700～1 600 cm-1）帶有強(qiáng)烈的吸收，因此酰胺Ⅰ帶常被用來分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。在酰胺I 帶中，1 615～1 637 cm-1、1 700～1 682 cm-1范圍內(nèi)為β-折疊，1 637～1 645 cm-1范圍內(nèi)為無規(guī)卷曲，1 646～1 664 cm-1范圍內(nèi)為α-螺旋，1 664～1 681 cm-1范圍內(nèi)為β-轉(zhuǎn)角[28]。α-螺旋和β-折疊比β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的排列更有序，因此可以用α-螺旋和β-折疊的相對含量來判斷蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[29]。外殼中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的相對含量見表2。

表2 外殼中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的相對含量Table 2 The relative content of secondary structure of protein in the crust

與對照相比，添加蛋白質(zhì)的外殼中蛋白質(zhì)的β-折疊的相對含量明顯降低，β-轉(zhuǎn)角的相對含量明顯增加，α-螺旋和無規(guī)卷曲的相對含量輕微降低，其中大米蛋白組的β-折疊的相對含量和乳清蛋白組的α-螺旋的相對含量高于對照。這可能是添加蛋白質(zhì)后，蛋白質(zhì)結(jié)合一部分水分，抑制了淀粉的吸水膨脹，增加了蛋白質(zhì)與小麥面筋蛋白的相互交聯(lián)，促使蛋白質(zhì)發(fā)生熱聚集反應(yīng)，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)之間相互轉(zhuǎn)化。孫佳悅等[30]研究發(fā)現(xiàn)，熱處理使乳清蛋白變性、展開并發(fā)生相互作用，α-螺旋的相對含量降低，β-轉(zhuǎn)角的相對含量升高，促進(jìn)了乳清蛋白熱聚集體的形成，且β-轉(zhuǎn)角在熱聚集體的形成過程中具有重要作用。Bock 等[31]研究麥麩對模式谷蛋白面團(tuán)中水分狀態(tài)和谷蛋白構(gòu)象的影響時，發(fā)現(xiàn)添加麥麩引起了谷蛋白面團(tuán)中結(jié)合水和單分子層水?dāng)?shù)量的變化，面團(tuán)中水的重新分布使谷蛋白的二級結(jié)構(gòu)由β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變成β-折疊和無規(guī)卷曲，破壞了谷蛋白的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致添加麥麩的面包品質(zhì)劣化。

在5 種蛋白質(zhì)中，大豆蛋白的β-折疊相對含量最高，其次是小麥面筋蛋白、大米蛋白和乳清蛋白，蛋清蛋白的β-折疊相對含量最低（輕微低于乳清蛋白）；而蛋清蛋白的β-轉(zhuǎn)角相對含量最高，其次是小麥面筋蛋白、大豆蛋白和乳清蛋白，大米蛋白的β-轉(zhuǎn)角相對含量最低 （輕微低于乳清蛋白）。添加蛋白質(zhì)后，大豆蛋白組、蛋清蛋白組和乳清蛋白組的β-折疊的相對含量均低于對照，而β-轉(zhuǎn)角含量高于對照；而大米蛋白組的β-折疊的相對含量高于對照，且β-轉(zhuǎn)角含量明顯增加，進(jìn)一步說明添加蛋白質(zhì)的結(jié)合水能力和自身凝膠性能影響了外殼中蛋白質(zhì)的凝膠強(qiáng)度，且添加蛋白質(zhì)的結(jié)合水的能力越弱，穩(wěn)定結(jié)構(gòu)向不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化越多，生成的凝膠結(jié)構(gòu)越不穩(wěn)定。

2.4 小麥淀粉晶體結(jié)構(gòu)

外殼中小麥淀粉的X-射線衍射圖譜見圖3。小麥淀粉的X-射線衍射圖譜中2θ 為15.22°，17.02°，18.06°，23.05°處有較強(qiáng)衍射峰，且在17.02°和18.06°處的衍射峰為相連雙峰，呈現(xiàn)典型的A 型晶體結(jié)構(gòu)特征，與Lopez-rubio 等[32]的結(jié)果一致。5 組外殼的X-射線衍射圖譜中，小麥淀粉原有的部分衍射峰消失，在2θ 為7°，13°，20°附近出現(xiàn)了新的衍射峰，呈現(xiàn)V 型晶體結(jié)構(gòu)的特征，與Garcia 等[33]的結(jié)果一致。這是因為小麥原淀粉經(jīng)高溫油炸后糊化，A 型晶體的天然雙螺旋結(jié)構(gòu)部分支鏈淀粉發(fā)生降解形成部分直鏈淀粉，直鏈淀粉相對濃度增加，易與煎炸油中脂肪酸的疏水性碳鏈發(fā)生疏水相互作用，使A 型晶體更多的轉(zhuǎn)變?yōu)閂 型晶體的淀粉-脂質(zhì)絡(luò)合物，相對結(jié)晶度降低[34]。

圖3 外殼的X-射線衍射圖譜Fig.3 X-ray diffractogram of the crust

5 組外殼中小麥淀粉的相對結(jié)晶度分別為45.22%（對照）、34.56%（大豆蛋白）、36.08%（蛋清蛋白）、37.08%（乳清蛋白）和40.66%（大米蛋白）。添加蛋白質(zhì)的外殼中淀粉-脂質(zhì)絡(luò)合物的相對結(jié)晶度均小于對照，且大豆蛋白組的相對結(jié)晶度最小。在2θ 為15°和17°附近，對照和大米蛋白組仍然保留有A 型晶體結(jié)構(gòu)的特征峰，且衍射峰強(qiáng)度明顯減弱。這可能由于大米蛋白組中蛋白質(zhì)的熱變性展開程度較輕，表面疏水性基團(tuán)和巰基暴露較少，外殼中蛋白質(zhì)形成的凝膠的強(qiáng)度較低，且大米蛋白結(jié)合水的能力較弱，外裹糊魚塊深度油炸過程中水分迅速蒸發(fā)，部分淀粉未能充分糊化[1-2]。大豆蛋白組的3 個衍射峰7.63°，13.03°，20.18°；蛋清蛋白組的2 個衍射峰7.66°與20.05°和乳清蛋白組的一個衍射峰20.08°均是V 型晶體結(jié)構(gòu)特征峰，說明添加這3 種蛋白質(zhì)后，外殼中小麥淀粉的晶體結(jié)構(gòu)從A 型晶體完全轉(zhuǎn)變?yōu)閂 型晶體。大豆蛋白組的淀粉-脂質(zhì)絡(luò)合物的相對結(jié)晶度最低，可能是外裹糊魚塊經(jīng)油炸，大豆蛋白充分變性展開，支鏈淀粉的雙螺旋結(jié)構(gòu)解螺旋，與蛋白質(zhì)相互作用形成較多的淀粉-蛋白質(zhì)復(fù)合物，且淀粉糊化后較均勻地填充在蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中形成致密的淀粉蛋白質(zhì)凝膠，阻礙了油脂滲入（油脂滲透與分布分析驗證了該假設(shè)）。

2.5 表面油脂和表面滲透油脂

表面油脂是油炸后的外裹糊魚塊在冷卻過程中吸附在魚塊表面的油脂；表面滲透油脂是在冷卻過程中由于溫度降低引起外殼表面孔洞的內(nèi)外壓差，使部分表面油脂滲入外殼內(nèi)部的油脂[35]。油炸外裹糊魚塊的表面油脂和表面滲透油脂含量見表3。

表3 油炸外裹糊魚塊的表面油脂和表面滲透油脂含量（%，濕基）Table 3 Surface oil and penetrated surface oil contents of fried BBFNs （%，wet basis）

表面油脂和表面滲透油脂的含量依次為：大米蛋白組＞大豆蛋白組＞蛋清蛋白組＞乳清蛋白組＞對照，對照＞大米蛋白組＞乳清蛋白組＞蛋清蛋白組＞大豆蛋白組，說明添加的4 種蛋白質(zhì)均抑制了外裹糊魚塊在油炸過程中的油脂滲透。大豆蛋白結(jié)合水的能力較強(qiáng)、自身凝膠性能較好。同時，大豆蛋白組外殼中蛋白質(zhì)的H0和二硫鍵含量較高，形成淀粉蛋白質(zhì)復(fù)合凝膠致密，外殼表面孔隙細(xì)小且外殼結(jié)構(gòu)完整，有效抑制了油脂的滲透（CSLM 分析驗證了該假設(shè)）。蛋清蛋白和乳清蛋白結(jié)合水的能力弱于大豆蛋白，H0較低，外裹糊中形成的淀粉蛋白凝膠層致密性和強(qiáng)度弱于大豆蛋白，導(dǎo)致較多的表面油脂滲透到外殼中。大米蛋白結(jié)合水能力最差，且自身凝膠性能弱，大米蛋白組的H0和二硫鍵含量最低，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)向更穩(wěn)定構(gòu)象轉(zhuǎn)化最少，形成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松，水分蒸發(fā)較多使外殼上形成的孔隙較大，外裹糊魚塊在油炸過程中表面黏附較多的油脂，且在冷卻時由于負(fù)壓作用滲入魚塊，導(dǎo)致在4 種添加蛋白質(zhì)組中表面滲透油脂和表面油脂的含量最高。

2.6 油脂分布

油炸外裹糊魚塊外殼的油脂分布見圖4。對照外殼的孔隙和裂紋最多，且裂紋最寬，紅色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，最多的油脂分布在裂紋和孔隙中。大豆蛋白組的外殼結(jié)構(gòu)最致密，孔隙最少，裂痕最淺，紅色熒光強(qiáng)度最弱，油脂分布最少。蛋清蛋白組外殼的孔隙細(xì)小且較多，裂紋較少，油脂分布在孔隙的周圍，紅色熒光強(qiáng)度較弱，油脂分布較少。乳清蛋白組外殼孔隙較小且少，裂紋較多，大部分油脂分布在裂紋中。大米蛋白組外殼孔隙大小不均，裂紋多且深，大量油脂大量分布在裂紋中，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。這與油炸外裹糊魚塊的表面油脂和表面滲透油脂含量分析的結(jié)果一致，進(jìn)一步證明了添加4 種蛋白質(zhì)使外裹糊在油炸過程中形成不同強(qiáng)度的凝膠保護(hù)層，阻礙了水分的蒸發(fā)，抑制了油脂的滲透，從而降低了油炸外裹糊魚塊的油脂含量。

圖4 油炸外裹糊魚塊外殼的激光共聚焦圖Fig.4 Images of confocal laser scanning microscopy of fried BBFNs

3 結(jié)論

添加蛋白質(zhì)的結(jié)合水能力和自身的凝膠性能顯著影響了油炸外裹糊魚塊外殼中蛋白質(zhì)的表面疏水性、巰基和二硫鍵含量、熒光強(qiáng)度和二級結(jié)構(gòu)，以及小麥淀粉的晶體結(jié)構(gòu)，最終影響了外裹糊魚塊深度油炸過程中油脂的滲透。添加蛋白質(zhì)的結(jié)合水能力和自身凝膠性能較強(qiáng)，蛋白質(zhì)的熱變性展開程度較大，表面疏水性基團(tuán)和巰基暴露較多，促使蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與淀粉之間相互作用增強(qiáng)，形成較致密的淀粉蛋白質(zhì)復(fù)合凝膠，較好的抑制了外裹糊魚塊油炸過程中的油脂滲透。該試驗可為低脂油炸外裹糊魚制品的規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。