張 權, 畢 珊, 吳玉田, 李 磊, 周貽兵, 劉利亞, 劉文政, 陳慶園, 周 雪, 郭 華*

(1.貴州省疾病預防控制中心實驗中心,貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學藥學院,貴州 貴陽 550025)

蘭科(Orchidaceae)石斛屬(DendrobiumSw.)植物為多年生草本[1]。石斛屬在全世界大約有150種,劃分為40個組,主要分布于亞洲及大洋洲的熱帶和亞熱帶區(qū)域,部分種類也分布于亞高山地區(qū)[2]。在中國石斛種屬有78種,主要分布于華南、華東及西南等地[3]。貴州省有25種屬,常見的主要以鐵皮石斛、金釵石斛為主,其中鐵皮石斛被譽為“九大仙草之首”,為歷年版《中華人民共和國藥典》收載的珍稀名貴中藥材[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明,石斛中含有多糖、生物堿、氨基酸等多種活性成分,具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫等諸多作用[5-8]。近些年石斛不僅作為傳統(tǒng)中藥使用,更作為原料廣泛用于食品、保健品等行業(yè)[9,10]。由于過度采挖,野生石斛資源已瀕臨枯竭,目前主要以大面積人工仿野生栽培來滿足市場需求,但在種植過程中常用農(nóng)藥來防治各種害蟲,而過量使用農(nóng)藥不僅會造成環(huán)境污染,還會殘留在藥材內(nèi),危害人類健康[11]。因此,為保障石斛原材料的用藥安全,建立多種農(nóng)藥殘留快速篩查的方法就顯得非常重要。

農(nóng)藥殘留分析是一項復雜的痕量分析技術,隨著檢測樣品基質的復雜化現(xiàn)象越來越突出,傳統(tǒng)的提取凈化技術已遠遠滿足不了現(xiàn)代農(nóng)藥殘留分析的要求[12,13],如何應對日益復雜的樣品基質前處理及其痕量分析已成為業(yè)內(nèi)一大挑戰(zhàn)[14]。通常樣品前處理是農(nóng)藥殘留檢測的關鍵,占整個分析過程2/3的時間[15]。方法主要有固相萃取法(SPE)[16]、凝膠滲透色譜法(GPC)[17]、QuEChERS[18]、分散固相萃取法(dSPE)[19]等,其中QuEChERS方法問世后目前已逐步成為多組分農(nóng)藥殘留測定最流行的前處理方法[20]。原理是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用,吸附雜質,從而達到除雜凈化的目的。常用的凈化劑填料主要有N-丙基乙二胺(PSA)[21]、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)[22]及石墨化炭黑(GCB)[23]等。而Sin-QuEChERS Nano疏水型凈化柱、MPFC-QuEChERS超濾型凈化柱[24]是通過QuEChERS法進行技術改良后的產(chǎn)品,它是將一種具備強度高、韌性大及比表面積大等多種優(yōu)點的新型多壁碳納米管凈化填料(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)與其他凈化填料結合[25],巧妙地將底部為漏斗狀的柱體與實驗室常用的50 mL離心管組成密封體系,將傳統(tǒng)QuEChERS方法中萃取、凈化兩步“化簡唯一”,從而避免因溶劑轉移所帶來的結果損失,真正實現(xiàn)一步凈化。

目前Sin-QuEChERS Nano法在蔬菜及水果基質中有少數(shù)的應用[26,27],但是在石斛等復雜基質中的應用還未見報道。所以本研究以石斛基質為代表,通過比較本實驗室所建立的幾種經(jīng)典樣品前處理方法(SPE、dSPE、QuEChERS)的凈化效果及回收率差異,突出Sin-QuEChERS Nano法在石斛基質凈化過程中的優(yōu)勢性。以目前實際用于石斛種植中的農(nóng)藥種類,選擇涵蓋有機氯類、有機磷類、菊酯類、氨基甲酸酯類等84種代表性農(nóng)藥作為目標物,通過對質譜、色譜條件、基質效應、提取方式及凈化方法的考察與優(yōu)化,建立了Sin-QuEChERS Nano結合GC-MS/MS對石斛中多種農(nóng)藥殘留的快速篩查方法,對不同產(chǎn)地、不同部位的80份金釵石斛和鐵皮石斛開展監(jiān)測,為后續(xù)中國國家標準修訂石斛中農(nóng)藥最大殘留限量提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Scion-TQ三重四極桿質譜聯(lián)用儀(美國BRUKER公司);FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);GL-22MS型高速冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)。

33種藥典中農(nóng)藥定制標準溶液(溶液丙酮,天津阿爾塔科技有限公司);10種氨基甲酸酯標準溶液(溶液丙酮,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所);16種有機磷標準溶液(溶液丙酮,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所);7種菊酯標準溶液(溶液正己烷,100 μg/mL,美國O2si公司),其余26種農(nóng)藥標準品均購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所(溶液丙酮,100 μg/mL);乙腈、正己烷、丙酮(色譜純,美國TEDIA公司);CNW dSPE萃取包及純化管(萃取包內(nèi)填料為6 g硫酸鎂及1.5 g醋酸鈉,純化管內(nèi)含150 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg GCB、50 mg C18)、緩沖鹽萃取包(含4 g MgSO4、1 g NaCl、0.5 g檸檬酸氫二鈉、1.5 g檸檬酸鈉)(上海安譜實驗科技股份有限公司);Cleanert PC/NH2固相萃取柱(1 000 mg/6 mL,天津博納艾杰爾公司);LUMTECH M-PFC復雜基質超濾柱(3 mL)、LUMTECH Sin-QuEChERS Nano-Herb中藥農(nóng)殘凈化柱(內(nèi)含MWCNTs、PSA及GCB填料)(北京綠綿科技有限公司)。金釵石斛、鐵皮石斛樣品采集于中國貴州省安龍縣、荔波縣、獨山縣、沿河縣。

1.2 標準儲備液的配制

分別用1 mL胖度移液管吸取上述4種混合標準溶液及26種單標準溶液各1 mL后混勻,合并后的農(nóng)藥混合標準儲備液總體積為30 mL,于-4 ℃冷藏保存?zhèn)溆?其中84種目標組分中甲萘威、滅多威及甲胺磷等8個組分在混合標準儲備液中重復,所以在后續(xù)計算時已把濃度做加和處理。臨用前使用倍比稀釋法經(jīng)1.3節(jié)中Sin-QuEChERS Nano法處理的空白提取液稀釋成基質匹配混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理過程

選取500 g以上代表性樣品,利用高速粉碎機粉碎后置于自封袋中,標注樣品編號,備用。

dSPE法:準確稱取2.00 g試樣于50 mL離心管中,加入10 mL 1%乙酸乙腈渦旋振蕩2 min,超聲提取15 min,然后加入萃取包(填料為6.0 g硫酸鎂及1.5 g乙酸鈉),渦旋振蕩1 min,以10 000 r/min離心5 min,準確吸取上清液1 mL加入到純化管中(150 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg GCB、50 mg C18),然后加入30 μg/mL環(huán)氧七氯內(nèi)標40 μL,渦旋振蕩1 min,以10 000 r/min離心5 min,上清液過0.22 μm濾膜后待GC-MS/MS分析。

M-PFC法:準確稱取2.00 g試樣于5 mL離心管中,加入3 mL乙腈,超聲提取10 min,以10 000 r/min離心5 min。移取上述提取液2 mL置于5 mL離心管中,向上緩慢抽動M-PFC柱的注射桿,使2 mL提取液全部經(jīng)過填料層,往復過柱兩次,M-PFC柱注射器端連接0.22 μm濾膜,置于進樣小瓶上方,然后緩慢推動注射桿,即得待測液,待GC-MS/MS分析。

Sin-QuEChERS Nano法:準確稱取2.00 g試樣,加入5 mL水混勻后浸泡20 min,再加入10 mL 1%乙酸乙腈和緩沖鹽萃取包,超聲提取10 min,以10 000 r/min離心5 min,將Sin-QuEChERS Nano柱插入50 mL離心管內(nèi),緩慢按壓至刻度處(儲液管內(nèi)凈化液約4 mL),用注射器吸取上清液過0.22 μm濾膜,待GC-MS/MS分析。具體Sin-QuEChERS Nano結構示意圖如圖1所示。

圖1 Sin-QuEChERS Nano凈化柱的示意圖Fig.1 Schematic of the Sin-QuEChERS Nano purification column

SPE法:準確稱取2.00 g試樣,加入5 mL水混勻后浸泡20 min,再加入10 mL乙腈和3 g氯化鈉,超聲提取10 min,振蕩0.5 min,待液液分層后加入4 g無水硫酸鎂,迅速旋上瓶蓋,渦旋振蕩1 min,以10 000 r/min離心5 min,取上清液5 mL,濃縮至1 mL。先用5 mL淋洗液活化PC/NH2柱,然后用3 mL淋洗液溶解平底燒瓶中的蒸發(fā)殘留物,合并洗滌液并轉移到PC/NH2柱上,當液面降低到固相萃取柱篩板表面后加入淋洗液10 mL,收集淋洗液于15 mL離心管中,濃縮液用氮氣吹至近干后用加入1.0 mL丙酮,過0.22 μm濾膜,待GC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Agilent DB-1701MS石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣:高純氦氣,純度≥99.999%;碰撞氣(CID):氬氣,分流模式:不分流進樣,進樣口溫度:250 ℃,程序升溫條件:起始溫度60 ℃,保持1 min,以40 ℃/min升至120 ℃,再以5 ℃/min升至280 ℃，保持8.5 min,共43 min。流速:1 mL/min;進樣量:1.0 μL。

1.4.2質譜條件

電離模式:電子轟擊電離(EI);電離能量:70 eV;離子監(jiān)測模式:多反應監(jiān)測(MRM);離子源溫度:220 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延遲:5.0 min。目標物的質譜參數(shù)見表1。石斛加標樣品的總離子流圖見圖2。

圖2 石斛加標樣品的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of spiked dendrobium sample

表1 84種農(nóng)藥的保留時間及質譜參數(shù)Table 1 Retention times and MS parameters of the 84 pesticides

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

2 結果與討論

2.1 凈化方式的比較與優(yōu)化

石斛類基質中含有色素、糖類、生物堿和有機酸等物質,這些干擾物在提取過程中會和目標物一起浸提出[28]。如果不進行后續(xù)的凈化處理,不僅會對目標物的定性定量結果造成干擾,而且還會減少襯管的使用壽命和加重離子源的污染程度[29]。目前比較常用的凈化方法主要有SPE法、QuEChERS法、dSPE法等。首先將石斛樣品在全掃描(Full Scan)模式下進樣分析比較，4種凈化方式的凈化效果,具體如圖3所示;將石斛加標樣品在MRM模式下進樣分析，比較4種凈化方式的平均回收率差異。

圖3 經(jīng)不同凈化方式處理后石斛提取液在全掃描模式下的總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatograms in full scan mode of the dendrobium extracts cleaned-up by different purification methods

Sin-QuEChERS Nano法、M-PFC法、dSPE法及SPE法的平均回收率分別為90.5%、82.8%、71.2%和65.3%。從圖3可以看出,石斛基質經(jīng)Sin-QuEChERS Nano法及dSPE法凈化后的效果較好,但dSPE法的平均回收率遠低于Sin-QuEChERS Nano法,而且前處理操作中dSPE法比Sin-QuEChERS Nano法多了一步純化管凈化步驟,單個樣品前處理時間需多耗時10 min,不適于批量樣品的“萃取凈化一體式”檢測。其次,dSPE中的萃取管內(nèi)含有高含量石墨化炭黑,對平面結構農(nóng)藥有一定的吸附[30],導致菊酯類目標農(nóng)藥的回收率偏低,而Sin-QuEChERS Nano凈化柱中PSA等固相吸附材料與MWCNTs有效聚合,比石墨化炭黑具有更強的吸附和凈化能力[31]。同時,Sin-QuEChERS Nano法加入的緩沖鹽萃取包也能有效控制有機相的酸堿度,改善對酸敏感農(nóng)藥的回收率,提取效果也優(yōu)于普通鹽包。

另外本研究分別比較了3款市售Sin-QuEChERS Nano商品化柱,分別是簡單基質凈化柱、復雜基質凈化柱及中藥凈化柱,從凈化效果及回收率結果來看,只有中藥凈化柱(Sin-QuEChERS Nano柱)可以滿足石斛類基質的凈化。其次，為了突出本凈化方法的適用范圍廣，研究中分別選取不同部位(莖、葉、花)的金釵石斛樣品，經(jīng)提取后過Sin-QuEChERS Nano柱凈化，觀察其凈化效果,具體如圖4所示。

圖4 采用Sin-QuEChERS Nano柱凈化后石斛樣品的凈化效果圖Fig.4 Purification effect maps of the dendrobium samples cleaned-up by Sin-QuEChERS Nano column a.dendrobium stem;b.dendrobium leaves;c.dendrobium flowers.

從圖4可以看出,Sin-QuEChERS Nano柱儲液管內(nèi)凈化液均為澄清透明液體,對金釵石斛的莖、葉、花凈化效果都較為顯著,所以后續(xù)實驗將Sin-QuEChERS Nano柱作為首選石斛樣品凈化柱。

2.2 提取方式及提取溶劑的選擇

Sin-QuEChERS Nano法是在QuEChERS法基礎上改良出的一種全新的樣品前處理方法,常應用于含水量較大的蔬菜和水果,當基質的含水量小于20%時,該法會影響細胞間的通透性,不利于農(nóng)藥組分的析出。但是加入水量過多會導致后續(xù)液液分層不明顯,加入水量過少又達不到改變通透性的效果,在本研究中只有加入5 mL水浸泡20 min后才能全部浸沒不同性狀及部位的石斛樣品(粉狀、葉、花、鮮莖等)。其次,本研究石斛樣品前處理過程中以加5 mL水及未加水兩種操作方式下的平均回收率作為考察指標,進一步考察了目標組分的提取效率。結果顯示:樣品加入5 mL水浸泡20 min再進行后續(xù)操作后,19種水溶性農(nóng)藥回收率有所提高,其回收率范圍由62.6%～107.6%提高至68.7%～115.5%,其平均回收率提高了11.3%。所以本研究稱量樣品后需加入5 mL水浸泡20 min后再進行后續(xù)的前處理操作。

此外,提取農(nóng)藥的有機溶劑選擇性很多,根據(jù)目標組分極性的不同及基質的影響使用較多的試劑主要有1%乙酸乙腈、丙酮等,本研究考察Sin-QuEChERS Nano法中這兩種不同提取溶劑的提取效果,結合提取液顏色及提取率作為考察指標。結果如圖5所示:當用1%乙酸乙腈、丙酮作為提取溶劑時,各目標組分的提取率均大于68.7%,但用丙酮作為提取溶劑時,提取液的顏色較深且體積較少,不利于后續(xù)的凈化操作,所以后續(xù)的實驗操作均以1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

圖5 不同提取溶劑對提取率的影響及提取液顏色的比較Fig.5 Effect of different extraction solvents on the extraction rates and comparison of the color of the extractsCompound Nos.were the same as those in Table 1.

2.3 基質效應

本研究為考察84種農(nóng)藥的基質效應,分別采用凈化效果較好的dSPE法和Sin-QuEChERS Nano法進行前處理操作,石斛中目標農(nóng)藥的基質效果如圖6所示。結果顯示:Sin-QuEChERS Nano法的ME為101%～158%,其中40種農(nóng)藥的ME>120%,而dSPE法的ME范圍為109%～189%,其中54種農(nóng)藥的ME>120%。由此可見,與液相色譜-質譜法不同的是,氣相色譜-串聯(lián)質譜法的基質效應大多數(shù)以增強為主,Sin-QuEChERS Nano法比dSPE法更有效減小了基質效應。所以本研究為了減少基質效應對定量的影響而采用基質匹配工作曲線外標法定量[32]。

圖6 使用不同凈化方法時石斛中目標農(nóng)藥的基質效應Fig.6 MEs of the target pesticides in dendrobium using different purification methods

2.4 線性范圍、檢出限、定量限及加標回收率

在GC-MS/MS確證的實驗條件下,取石斛空白樣品按樣品制備處理后得到空白基質,分別加入6個不同濃度的混合標準溶液,在上述的質譜條件下進行測定。以目標農(nóng)藥的峰面積Y為縱坐標,相對應的質量濃度X(μg/L)為橫坐標繪制標準曲線。同時,采用空白石斛樣品中添加目標物的方法,以3倍和10倍信噪比(S/N)對應的含量確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。取數(shù)份經(jīng)GC-MS/MS驗證無目標物的石斛空白樣品,分別添加50 μL和250 μL不同質量濃度的混合標準使用液,按照上述優(yōu)化后的方法進行樣品前處理,并上機分析,平行測定6次。

84種化合物的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)(r2)、檢出限、定量限、加標回收率及相對標準偏差如表2所示。84種目標物線性關系良好(r2>0.99)。采用加標回收的方法確定方法的檢出限及定量限分別為1.5～5.8 μg/kg和5.0～15.0 μg/kg;84種化合物加標回收率為68.7%～116.2%,RSD(n=6)為5.2%～14.8%。表明本方法重復性良好,可滿足實際檢測的需要。

表2 84種化合物的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限、定量限、加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients (r2),LODs,LOQs,spiked recoveries and RSDs of the 84 pesticides (n=6)

表2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2.5 實際樣品測試

采用本研究建立的方法對貴州省安龍縣、荔波縣、獨山縣、沿河縣采集的共80份樣品進行監(jiān)測,樣品類別包含石斛楓斗、金釵石斛(花、莖、葉)及鐵皮石斛(花、莖、葉、粉、片)。

結果表明，其中12份樣品中檢出農(nóng)藥殘留,檢出率為15%,檢出的農(nóng)藥頻次較高的有毒死蜱(0.08～0.5 mg/kg)、百菌清(0.06～3.2 mg/kg)、腐霉利(0.03～0.15 mg/kg)、甲基對硫磷(0.04～0.23 mg/kg)、氯氟氰菊酯(0.10～2.68 mg/kg)、克百威(0.015～0.02 mg/kg),同時檢出農(nóng)藥的殘留量均未超過國家標準GB 2763-2021《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》及地方標準DBS 52/048-2020《食品安全地方標準鐵皮石斛莖》規(guī)定的最大殘留限量值。圖7為陽性樣品中典型目標物的總離子流圖。

圖7 陽性樣品中典型目標物的總離子流圖Fig.7 Total ion chromatograms of typical targets in positive samples

3 結論

本研究基于Sin-QuEChERS Nano柱開發(fā)了一種快速篩查石斛中多種農(nóng)藥殘留的方法。通過對Sin-QuEChERS Nano與經(jīng)典dSPE、SPE、QuEChERS法的凈化效果、提取回收率進行比較及方法學參數(shù)驗證,表明Sin-QuEChERS Nano柱在凈化效果方面表現(xiàn)更好。該法充分簡化了樣品的凈化過程,同時提高了檢測效率和準確性,更加適合批量樣品中多組分農(nóng)藥殘留的篩查及確證工作。