曾 磊, 姜利娟, 姚興東, 王 婷, 史伯安,2, 雷福厚*

(1.廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,林產(chǎn)化學(xué)與工程國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心,廣西 南寧 530006;2.湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 恩施 445000)

高效液相色譜因其分析效率高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)化工、食品檢測(cè)、藥物測(cè)試、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域[1-3]。隨著分析和檢測(cè)樣品的多樣化和復(fù)雜化,具有不同分離特性的色譜固定相應(yīng)運(yùn)而生并得到應(yīng)用,其中化學(xué)鍵合固定相因其穩(wěn)定性好、柱效高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。硅膠由于具有機(jī)械強(qiáng)度高、比表面積大、孔結(jié)構(gòu)豐富和易于修飾的優(yōu)點(diǎn),常作為鍵合固定相的基質(zhì)。作為各種分離模式建立和發(fā)展的基礎(chǔ),新型色譜固定相的制備與應(yīng)用已成為色譜研究工作的前沿和熱點(diǎn)[4-6]。

天然可再生資源作為一種綠色環(huán)保、來源廣泛的原料已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和工業(yè)化生產(chǎn)[7],這對(duì)替代化石能源和實(shí)現(xiàn)“零碳排放”具有重要意義。天然化合物獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性能,使其在色譜固定相研制與開發(fā)方面也展現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛能[8-10]。腰果酚作為一種從腰果殼油中提取的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品,具有來源豐富、可再生和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)[11,12]。腰果酚是一種帶有15個(gè)碳原子烷基鏈的間烷基苯酚混合物,其烷基鏈的不飽和度為0～3[13,14]。腰果酚兼具苯環(huán)的剛性、烷基鏈的柔性及酚羥基的反應(yīng)活性,其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其成為近年來生物基材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,被廣泛用于生物基樹脂[15,16]、表面活性劑[17]和合成涂料[18]的制備。目前將腰果酚直接應(yīng)用于色譜分離材料并對(duì)其分離性能進(jìn)行評(píng)價(jià)的報(bào)道較少[19]。

本文以腰果酚為配體,γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH-560)為偶聯(lián)劑,通過化學(xué)鍵合法制備得到腰果酚鍵合硅膠色譜固定相(CBS)。以烷基苯、多環(huán)芳烴、苯酚類物質(zhì)和Tanaka實(shí)驗(yàn)試劑為探針,對(duì)其色譜性能進(jìn)行評(píng)價(jià),探討其保留機(jī)制,并發(fā)掘該固定相在中藥活性成分分離純化研究中的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

NicoletiS10傅里葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司);Z0050716裝柱機(jī)(美國Scientific Systems公司);不銹鋼色譜柱(250 mm×4.6 mm,大連依利特分析儀器有限公司);Mettler Toledo TGA/DSC3+同步熱分析儀(瑞士梅特勒-托利多公司);ASAP 2020比表面積及氮?dú)馕絻x(美國Micromeritics公司);HS3120超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司);LC-20AD型高效液相色譜儀和SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器(日本島津);C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,日本島津);超純水機(jī)(Sartorius arium pro,德國)。

腰果酚(純度98%,廣西梧州日成林產(chǎn)化工有限公司);硅膠(5 μm,蘇州納微科技公司);γ-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(純度98%,阿拉丁試劑公司);甲醇和乙腈(HPLC純,賽默飛試劑公司);烷基苯、多環(huán)芳烴和苯酚衍生物均為分析純(國藥試劑公司);喜樹堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿均為標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%,阿拉丁試劑公司);苯胺、尿嘧啶、咖啡因均為分析純(麥克林試劑公司);吳茱萸果和喜樹果干樣(采自廣西南寧)。

1.2 腰果酚鍵合硅膠色譜柱的制備

1.2.1腰果酚鍵合硅膠固定相的制備

腰果酚鍵合硅膠固定相的制備過程如圖1所示,先用體積分?jǐn)?shù)為30%的鹽酸溶液對(duì)硅膠進(jìn)行活化,在N2保護(hù)下80 ℃反應(yīng)12 h,反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫,用去離子水洗滌至中性后,再用無水乙醇洗滌。放入真空干燥箱80 ℃干燥12 h,制得活化硅膠。將15 g活化硅膠置于單口燒瓶中加入150 mL無水甲苯,攪拌條件下加入3 mL無水三乙胺及15 mL KH-560。在N2保護(hù)下110 ℃反應(yīng)24 h,冷卻至室溫并依次用丙酮、甲醇、無水乙醇洗滌,最后真空干燥12 h,制備得到環(huán)氧硅膠。稱取環(huán)氧硅膠5.0 g置于單口燒瓶中,加入50 mL無水甲苯,攪拌條件下加入1.0 g腰果酚和3滴高氯酸,在N2保護(hù)下90 ℃反應(yīng)24 h,反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫,依次用丙酮、無水乙醇和去離子水洗滌,并用無水乙醇進(jìn)行索氏提取12 h,在80 ℃下真空干燥12 h,得到腰果酚鍵合硅膠固定相。

1.2.2色譜柱的裝填

采用勻漿法裝柱,以異丙醇作為勻漿液,乙醇為頂替液。將4.5 g固定相加入到勻漿液中超聲5 min使其混勻分散。在60 MPa的壓力下將固定相裝填到色譜柱中(250 mm×4.6 mm),保持壓力25 min。裝填完畢,以甲醇為流動(dòng)相沖洗色譜柱,備用。

1.3 樣品制備

1.3.1色譜測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品的制備

烷基苯、多環(huán)芳烴、咖啡因、苯酚、酚類化合物、苯胺、尿嘧啶均用甲醇超聲溶解;喜樹堿、吳茱萸堿和吳茱萸次堿均用乙腈超聲溶解,過膜備用。

1.3.2吳茱萸粗提物與喜樹果粗提物的制備

采用連續(xù)回流提取法制備喜樹果粗提物[10]。將喜樹果干燥,粉碎,過100目篩。稱取50 g喜樹果粉末,用紗布包好置于索氏提取器中,用75%(v/v)乙醇水溶液提取3次,每次1 h,合并3次粗提液,抽濾,除去喜樹果濾渣。再用氯仿對(duì)醇提液進(jìn)行萃取,收集氯仿層溶液并濃縮,制得喜樹果浸膏。取喜樹果浸膏5.0 mg,用乙腈定容至25 mL,用微孔濾膜過濾后得到喜樹果粗提物溶液。吳茱萸粗提物采用同樣方法制得。

2 結(jié)果與討論

2.1 腰果酚鍵合硅膠固定相的表征

分別采用傅里葉紅外光譜、元素分析、N2吸附脫附實(shí)驗(yàn)和熱失重分析對(duì)CBS固定相進(jìn)行表征。采用Vario EL cube元素分析儀分別對(duì)裸硅膠、環(huán)氧硅膠和腰果酚鍵合固定相中的C、H元素含量進(jìn)行測(cè)定(見表1)。相較于裸硅膠而言,環(huán)氧硅膠中C和H元素的含量分別增加至8.465%和1.564%,表明成功制得環(huán)氧硅膠。腰果酚鍵合固定相的C和H元素的含量分別增至15.130%和2.181%,表明成功制得腰果酚鍵合硅膠固定相。

通過N2吸附-脫附實(shí)驗(yàn),對(duì)裸硅膠、環(huán)氧硅膠和固定相的BET比表面積和孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,結(jié)果如表2所示。隨著對(duì)裸硅膠進(jìn)一步的化學(xué)修飾,BET比表面積的數(shù)值逐漸下降,表明已成功地將硅烷偶聯(lián)劑和腰果酚鍵合到硅膠上。此外,經(jīng)修飾后環(huán)氧硅膠和固定相的孔體積和孔徑均減小,說明在修飾過程中硅烷偶聯(lián)劑和腰果酚不僅鍵合在硅膠表面,而且還進(jìn)入硅膠的孔道中。

表2 BET比表面積和孔徑數(shù)據(jù)Table 2 BET surface area,pore volume,and pore size data

傅里葉紅外光譜表征見圖2。由圖2a可以明顯觀察到裸硅膠在3 454 cm-1處和972 cm-1處有明顯的吸收峰,分別歸屬為Si-OH的伸縮振動(dòng)峰和彎曲振動(dòng)峰。由圖2b可以明顯地觀察到,與裸硅膠相比,環(huán)氧硅膠在3 454 cm-1處Si-OH的伸縮振動(dòng)峰明顯減弱,972 cm-1處Si-OH的彎曲振動(dòng)峰明顯消失,并在2 941 cm-1和2 864 cm-1處出現(xiàn)C-H的伸縮振動(dòng)峰,表明成功將偶聯(lián)劑KH-560修飾到裸硅膠上。由圖2c可以觀察到,2 941和2 864 cm-1處的吸收峰明顯增強(qiáng),在1 626和1 460 cm-1處出現(xiàn)芳環(huán)骨架C=C的伸縮振動(dòng)峰;1 093 cm-1處的Si-O和C-O重疊吸收峰變寬,表明成功將腰果酚鍵合到環(huán)氧硅膠上。

圖2 (a)硅膠、(b)環(huán)氧硅膠和(c)腰果酚鍵合硅膠固定相的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of (a)BS,(b)KBS,and (c)CBS

通過熱失重分析評(píng)價(jià)CBS固定相的熱穩(wěn)定性,如圖3所示。3種測(cè)試物在25～150 ℃處出現(xiàn)一個(gè)較小的失重現(xiàn)象,這是由于測(cè)試物脫水造成的。環(huán)氧硅膠在400 ℃處出現(xiàn)明顯的失重現(xiàn)象,CBS固定相分別在330 ℃和415 ℃出現(xiàn)明顯的失重現(xiàn)象,表明330 ℃處的失重現(xiàn)象是由于腰果酚熱分解造成的。在800 ℃時(shí),相較于裸硅膠而言,CBS固定相與環(huán)氧硅膠分別存在15.51%和10.48%的質(zhì)量損失。上述結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)成功地將腰果酚鍵合到硅膠上,并且制備出的固定相具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖3 硅膠、環(huán)氧硅膠和腰果酚鍵合硅膠固定相的熱失重曲線圖Fig.3 Thermogravimetric analysis curves of BS,KBS,and CBS

2.2 CBS柱的保留機(jī)制

以6種烷基苯為探針,考察CBS色譜柱的保留機(jī)制。各探針保留因子的對(duì)數(shù)(logk)與流動(dòng)相中甲醇含量的變化關(guān)系如圖4所示,隨著流動(dòng)相中甲醇比例從60%增加到85%,烷基苯在色譜柱上的保留能力呈現(xiàn)逐漸減弱的趨勢(shì),符合反相色譜保留特征,表明CBS柱具有反相色譜保留機(jī)制。

圖4 CBS柱上烷基苯保留因子的對(duì)數(shù)(log k)與甲醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系Fig.4 Relationship between log k of alkylbenzenes and methanol volume fraction on CBS columnMobile phase:methanol/water;flow rate:1.0 mL/min.

基于CBS色譜柱的反相保留特征,為一步評(píng)價(jià)疏水作用在溶質(zhì)保留中的作用,以烷基苯保留因子的對(duì)數(shù)logk與烷基苯所含烷基鏈長(zhǎng)度進(jìn)行線性擬合,評(píng)價(jià)其疏水性[20],并與C18柱對(duì)比,結(jié)果如圖5所示。在相同色譜條件下CBS柱和C18柱上的logk與其烷基鏈長(zhǎng)度之間具有良好的線性關(guān)系,符合碳數(shù)變化規(guī)律。線性回歸方程的斜率可以反映固定相和溶質(zhì)之間疏水相互作用的強(qiáng)度,CBS柱的斜率(0.13)小于C18柱(0.18),這表明CBS柱的疏水性弱于C18柱。這主要是由于腰果酚的鍵合量較低,其烷基鏈較短,并且在開環(huán)反應(yīng)中引入了極性官能團(tuán)羥基。

圖5 CBS柱和C18柱上烷基苯側(cè)鏈長(zhǎng)度與log k關(guān)系Fig.5 Relationship between log k and alkyl chain length of alkylbenzenes on CBS and C18 columns Mobile phase:methanol/water (80∶20,v/v);flow rate:1.0 mL/min.

2.3 CBS柱的色譜性能考察

2.3.1Tanaka實(shí)驗(yàn)

Tanaka實(shí)驗(yàn)常用于評(píng)估反相色譜的疏水性、形狀選擇性(區(qū)分平面和非平面溶質(zhì)的能力)和硅羥基活性[21,22]。實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果如圖6所示,分離色譜圖如圖7所示,戊苯在色譜柱上的保留因子(kn-pentylbenzene,kPB)取決于固定相中碳含量或配體鍵合密度,CBS柱的kPB值(3.43)小于C18柱(13.18),表明CBS固定相的表面碳覆蓋率少于C18。戊基苯與丁基苯的保留因子之比(αCH2=kn-pentylbenzene/kn-butylbenzene),稱為疏水選擇性,通常用于評(píng)估色譜柱分離相差一個(gè)亞甲基的烷基苯的能力。CBS柱的αCH2值(1.42)小于C18柱(1.63),這可能是腰果酚鍵合量較低所致。通過苯并菲與鄰三聯(lián)苯保留因子的比值(αT/O=ktriphenylene/ko-terphenyl)來評(píng)價(jià)色譜柱的形狀選擇性,CBS柱的αT/O值(2.99)大于C18柱(1.44),這表明CBS柱對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量和大小相似的平面型與非平面型的分析物具有較好的分離性能[23]。這也為我們的應(yīng)用提供了一個(gè)新的思路,即可將其用于分析分離具有不同空間構(gòu)型的化合物。通過咖啡因和苯酚保留因子的比值來評(píng)價(jià)固定相的氫鍵作用(αC/P=kcaffeine/kphenol)。CBS柱的αC/P值(1.00)高于C18柱(0.52),表明固定相對(duì)咖啡因具有更強(qiáng)的保留能力,這是由于KH-560偶聯(lián)劑開環(huán)反應(yīng)時(shí)形成的羥基能與咖啡因之間形成氫鍵作用。戊基苯和鄰三聯(lián)苯的保留因子之比用來評(píng)價(jià)固定相對(duì)芳香族化合物的選擇性(αPB/O=kn-pentylbenzene/ko-terphenyl)[24],C18柱的αPB/O值(1.12)大于CBS柱(0.57),且C18柱的αPB/O值大于1,表明在C18柱上鄰三聯(lián)苯在戊基苯之前被洗脫出來。相反CBS柱的αPB/O<1,表明具有更多芳環(huán)結(jié)構(gòu)的鄰三聯(lián)苯在CBS柱上的保留能力更強(qiáng),這主要是由于腰果酚中所帶的苯環(huán)與溶質(zhì)中的苯環(huán)結(jié)構(gòu)具有π-π相互作用,從而增強(qiáng)了色譜柱對(duì)溶質(zhì)的保留能力[25]。利用苯胺和苯酚的保留因子之比(αB/P=kbenzenamine/kphenol),來評(píng)估固定相表面硅羥基活性。盡管CBS固定相的表面鍵合量較低,并且引入了羥基,但CBS柱的αB/P值(0.54)小于C18柱(1.32)。這主要是由于CBS固定相除疏水作用外還具有氫鍵作用和π-π作用,從而增強(qiáng)了固定相對(duì)苯酚的保留作用,此外配體的空間位阻也會(huì)對(duì)硅羥基活性起到屏蔽作用[24,26],因此CBS固定相的αB/P值較小。

圖6 CBS柱與C18柱的Tanaka參數(shù)雷達(dá)圖Fig.6 Radar plots of the Tanaka parameters of CBS and C18 columns kPB:retention factor of n-pentylbenzene,kn-pentylbenzene,used to evaluate the carbon content or density of ligands in the stationary phases;αCH2:kn-pentylbenzene,used to evaluate the hydrophobicity of the stationary phase;αT/O :ktriphenylene/ko-terphenyl,used to evaluate the shape selectivity of the stationary phase;αC/P:kcaffeine/kphenol,used to evaluate the hydrogen-bonding interaction of the stationary phase;αB/P:kbenzenamine/kphenol,used to evaluate the apparent silanol activity of the stationary phase;αPB/O:kn-pentylbenzene/ko-terphenyl,used to describes the aromatic selectivity of the stationary phase.

圖7 CBS柱與C18柱的Tanaka色譜圖Fig.7 Chromatograms of Tanaka standard test mixture on CBS and C18 columns Mobile phase:methanol/water (75∶25,v/v);flow rate:1.0 mL/min. Tanaka standard test mixture:1.uracil;2.benzenamine;3.phenol;4.caffeine;5.n-butylbenzene;6.n-pentylbenzene;7.o-terphenyl;8.triphenylene.

2.3.2分離多環(huán)芳烴

多環(huán)芳烴作為日常生活中常見的有機(jī)污染物,對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確分離和測(cè)定至關(guān)重要。為考察CBS柱對(duì)多環(huán)芳烴的分離性能,選用了7種多環(huán)芳烴測(cè)試其分離性能,并與C18柱對(duì)比。分離結(jié)果如圖8所示,多環(huán)芳烴的洗脫順序與其疏水性一致,色譜峰形良好。值得注意的是,盡管CBS柱的疏水作用弱于C18柱,但在相同的色譜條件下,CBS柱對(duì)多環(huán)芳烴的保留性能與C18柱相差較小,且芘和苯并[a]蒽在CBS柱上的保留時(shí)間大于C18柱。這主要是由于芘和苯并[a]蒽中存在較多的苯環(huán)結(jié)構(gòu),能與固定相上的苯環(huán)形成更強(qiáng)的π-π作用,從而使CBS柱對(duì)其具有更強(qiáng)的保留能力。

為進(jìn)一步研究芳香選擇性對(duì)烷基苯和多環(huán)芳烴保留性能的影響,以烷基苯和多環(huán)芳烴保留因子的對(duì)數(shù)logk與其油水分配系數(shù)的對(duì)數(shù) logP進(jìn)行線性擬合,對(duì)其芳香選擇性進(jìn)行評(píng)價(jià)[27,28]。結(jié)果如圖9所示,在C18上擬合得到的兩條直線斜率相差較小且?guī)缀跸嗤?且烷基苯直線位于多環(huán)芳烴直線的上方,表明這兩類溶質(zhì)在C18柱上保留機(jī)制僅與其疏水作用有關(guān)。但在CBS柱上擬合得到的兩條直線斜率不僅相差較大,并且烷基苯直線位于多環(huán)芳烴直線的下方,說明CBS柱對(duì)多環(huán)芳烴具有更強(qiáng)的保留能力。例如,萘的logP值小于丙苯,但其在CBS柱上的logk值卻大于丙苯,表明多環(huán)芳烴在CBS柱上的保留性能是疏水和π-π作用協(xié)同作用的結(jié)果。

圖9 溶質(zhì)在CBS和C18柱上log k與log P之間的關(guān)系Fig.9 Relationships between log k and log P of solutes on CBS column and C18 columns Mobile phase and flow rate are the same as those in Fig.8. Solutes:1.benzene;2.toluene;3.ethylbenzene;4.n-propylbenzene;5.n-butylbenzene;6.n-pentylbenzene;7.naphthalene;8.fluorine;9.anthracene;10.benz(a)anthracene.

此外,另一類多環(huán)芳烴鄰三聯(lián)苯、間三聯(lián)苯和苯并菲也被用于評(píng)價(jià)CBS柱的保留性能,并與C18柱進(jìn)行對(duì)比。從圖10可以看出在相同色譜條件下,3種多環(huán)芳烴在CBS柱上成功實(shí)現(xiàn)了基線分離,但在C18柱上間三聯(lián)苯和苯并菲的色譜峰完全重疊在一起。與非共平面構(gòu)型的間三聯(lián)苯相比,共平面構(gòu)型的苯并菲能夠形成更強(qiáng)的π-π作用,從而增強(qiáng)了CBS柱對(duì)鄰三聯(lián)苯、間三聯(lián)苯和苯并菲的分離選擇性,這也與Tanaka實(shí)驗(yàn)中αT/O的評(píng)價(jià)結(jié)果相符。

圖10 多環(huán)芳烴異構(gòu)體在CBS柱和C18柱上的色譜圖Fig.10 Chromatograms of aromatic positional isomers on CBS and C18 columns Mobile phase and flow rate are the same as those in Fig.8.

2.3.3分離酚類化合物

CBS固定相表面存在的大量-OH基團(tuán)是良好的氫鍵作用位點(diǎn)。以間苯三酚、間苯二酚、苯酚、2-甲酚、3-硝基苯酚和2-萘酚為探針研究了氫鍵作用對(duì)CBS柱分離性能的影響。由圖11可以觀察到,CBS柱和C18柱對(duì)6種酚類化合物均表現(xiàn)出良好的分離性能,但酚類化合物在兩根色譜柱上的保留性能存在明顯的差異,除了2-甲酚和3-硝基苯酚,各探針的出峰順序與物質(zhì)的疏水性一致。CBS柱對(duì)3-硝基苯酚表現(xiàn)出更強(qiáng)的保留性能,除了π-π作用外,固定相表面的-OH基團(tuán)和3-硝基苯酚的-NO2基團(tuán)形成氫鍵相互作用。盡管C18柱的疏水作用強(qiáng)于CBS柱,但CBS柱對(duì)間三苯酚、間苯二酚和2-萘酚的保留性能均強(qiáng)于C18柱,表明π-π作用和氫鍵作用在一定程度上可以彌補(bǔ)CBS柱疏水作用較弱的缺陷,另一方面也表明CBS柱對(duì)苯酚類化合物的成功分離是疏水、π-π和氫鍵作用協(xié)同作用的結(jié)果。

圖11 苯酚類化合物在CBS柱和C18柱上的色譜圖Fig.11 Chromatograms of phenols on CBS and C18 columns Mobile phase:methanol/water (60∶40,v/v);flow rate:0.8 mL/min. Peaks:1.phloroglucinol;2.resorcinol;3.phenol;4.2-cresol;5.3-nitrophenol;6.2-naphthol.

2.3.4色譜柱穩(wěn)定性考察

在應(yīng)用過程中,色譜柱需要具有良好的穩(wěn)定性。為了評(píng)價(jià)色譜柱的穩(wěn)定性,以烷基苯為探針重復(fù)進(jìn)樣35次,隨機(jī)選取8次分離色譜圖,疊加后如圖12所示,其色譜峰所對(duì)應(yīng)的物質(zhì)分別為苯、甲苯、乙苯、丙苯、丁苯、戊苯,由圖12可知各探針的色譜峰基本重疊。選取前10次分離結(jié)果,對(duì)各烷基苯的保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì),其中各烷基苯保留時(shí)間的RSD≤0.079%,色譜峰峰面積的RSD≤0.847%,色譜峰峰高的RSD≤0.272%。各烷基苯的保留時(shí)間、峰面積和峰高幾乎未發(fā)生改變。此外,重新制備了2批CBS固定相,并將其填充到柱管,3批色譜柱對(duì)6種酚類物質(zhì)保留時(shí)間的RSD為1.41%～9.26%,表明CBS柱具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

圖12 CBS柱的分離重復(fù)性Fig.12 Separation repeatability of the CBS column Mobile phase:methanol/water (80∶20,v/v);flow rate:0.8 mL/min.

2.4 CBS柱分離喜樹果和吳茱萸粗提物

以乙腈/水(40∶60,v/v)為流動(dòng)相,柱溫25 ℃,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,流速為1.0 mL/min,測(cè)試CBS柱對(duì)喜樹果粗提物的分離性能,分離結(jié)果如圖13a所示。CBS柱對(duì)喜樹果粗提物展現(xiàn)出良好的分離性能,其中峰形最高的色譜峰與喜樹堿對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致,且峰形良好。喜樹堿與前后相鄰的兩個(gè)色譜峰的分離度分別為4.23和2.71。

圖13 (a)喜樹果粗提物和(b)吳茱萸粗提物在CBS柱上的色譜圖Fig.13 Chromatograms of (a)Camptotheca acuminate extract and (b)Fructus evodiae extract on the CBS column

以乙腈/水(60∶40,v/v)為流動(dòng)相,柱溫25 ℃,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm,流速為1.0 mL/min,測(cè)試CBS柱對(duì)吳茱萸粗提物的分離性能,分離結(jié)果如圖13b所示,其中峰形最高的兩個(gè)色譜峰分別與吳茱萸堿和吳茱萸次堿對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致,且峰形良好。吳茱萸堿與吳茱萸次堿的分離度為5.43,與前后相鄰的兩個(gè)色譜峰的分離度分別為2.20和1.69。上述結(jié)果表明,CBS柱對(duì)這兩味中藥的主要活性成分分離具有一定的潛能,在后續(xù)工作中會(huì)對(duì)其他的色譜峰進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定。

3 結(jié)論

本文以綠色可再生資源腰果酚為配體,制備得到腰果酚鍵合硅膠色譜固定相并對(duì)其色譜性能進(jìn)行了考察。制備出的腰果酚鍵合硅膠色譜具有典型的反相色譜保留機(jī)制,通過Tanaka實(shí)驗(yàn)對(duì)其色譜性能進(jìn)行評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)該色譜柱除疏水作用外還具有π-π作用和氫鍵作用,并對(duì)烷基苯、多環(huán)芳烴和苯酚類化合物表現(xiàn)出良好的分離選擇性。腰果酚鍵合硅膠色譜柱對(duì)中藥喜樹果和吳茱萸的粗提物表現(xiàn)出良好的分離性能,為喜樹堿和吳茱萸堿的分離純化提供了新的選擇;該固定相制備方法簡(jiǎn)單,配體資源豐富,有望用作工業(yè)色譜分離材料,用于部分中藥的分離純化。