劉 震

(南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,生命分析化學(xué)國家重點實驗室,江蘇 南京 210023)

蛋白質(zhì)糖基化與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),臨床上使用的大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物是糖基化蛋白質(zhì)。在組學(xué)層次上進(jìn)行位點特異性糖型的分析對發(fā)現(xiàn)新型疾病標(biāo)志物、提高基于蛋白質(zhì)糖基化的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究水平等具有重要作用。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在糖蛋白的分離分析研究中得到了廣泛的應(yīng)用?；谝合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的完整糖肽鑒定已成為研究蛋白質(zhì)上位點特異性糖鏈修飾的主要手段,其主要優(yōu)勢在于分析過程中可以同時揭示蛋白位點與糖鏈修飾的信息,從而在組學(xué)層次實現(xiàn)規(guī)模化的蛋白糖基化分析。但是，與其他翻譯后修飾相比,糖基化具有組成復(fù)雜、相對分子質(zhì)量分布范圍廣的特點,因此完整糖肽的數(shù)據(jù)庫檢索空間較大。同時完整糖肽的質(zhì)譜譜圖較為復(fù)雜。在碰撞誘導(dǎo)碎裂的完整糖肽質(zhì)譜譜圖中,糖鏈產(chǎn)生的碎片離子強度較高,而肽段骨架碎裂不完全,產(chǎn)生的碎片離子強度較低,給完整糖肽的譜圖解析帶來了困難。因此,發(fā)展具有高靈敏度與可信度的質(zhì)譜譜圖鑒定方法是深度解析蛋白糖基化修飾的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

針對上述問題,近日,中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所的葉明亮課題組開發(fā)了一款非糖庫依賴的N-糖肽譜圖鑒定軟件Glyco-Decipher用于位點特異性糖型的深度解析[1]。該方法首先匹配N-連接糖鏈的五糖核心結(jié)構(gòu)，確定肽段的相對分子質(zhì)量,通過理論去糖峰實現(xiàn)肽段骨架的初步鑒定。之后利用肽段骨架的碎裂規(guī)律,基于碎裂特征的模式識別,發(fā)展了譜圖拓展策略進(jìn)一步提高完整糖肽的鑒定靈敏度。該方法不僅顯著提高了完整糖肽譜圖的解析效率,而且實現(xiàn)了肽段骨架碎裂不完全的完整糖肽的鑒定,在理論去糖峰方法的基礎(chǔ)上將完整糖肽的鑒定數(shù)目提升了31%,提高了揭示糖基化修飾微觀不均一性的能力。與糖肽譜圖解析的其他方法相比，完整糖肽的譜圖解析率提升了34%～179%。該方法在譜圖解析過程中不依賴于已有的糖鏈數(shù)據(jù)庫信息，大大減小了完整糖肽的檢索空間。同時可以全面系統(tǒng)地揭示樣品中糖鏈修飾的相對分子質(zhì)量分布,發(fā)現(xiàn)未收錄在數(shù)據(jù)庫的新型糖鏈。發(fā)展的單糖步進(jìn)策略利用連續(xù)碎裂的糖鏈離子,確定未知糖鏈的組成及其上所帶有的化學(xué)修飾或生物修飾。在鑒定可信度方面,綜合考慮糖鏈的相對分子質(zhì)量以及碎片離子信息,在譜圖層次將完整糖肽的鑒定假陽性率控制在1%以內(nèi)。此外,基于一級譜的流出曲線信息,實現(xiàn)糖肽的無標(biāo)記定量,可在樣品層次或具體蛋白位點層次方面考察糖鏈修飾的豐度分布,為后續(xù)的生物學(xué)研究提供了有力工具。

該方法的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在5個方面:(1)通過N-糖鏈的五糖核心特征結(jié)構(gòu)確定肽段骨架的相對分子質(zhì)量,采取非糖庫依賴的肽段優(yōu)先鑒定策略,大大減小了完整糖肽的檢索空間;(2)利用肽段骨架的碎裂特征規(guī)律,發(fā)展了譜圖拓展策略,實現(xiàn)了低豐度或肽段碎裂不完全糖肽的鑒定;(3)非糖庫依賴譜圖解析實現(xiàn)了數(shù)據(jù)庫之外未知糖鏈(如帶修飾糖鏈)的發(fā)現(xiàn)與鑒定;(4)鑒定過程中該方法能夠系統(tǒng)全面地考慮肽段與糖鏈的碎片離子,保證了完整糖肽的鑒定可信度;(5)位點特異性糖型的深度解析提高了糖基化修飾的位點占有率等定量分析考察的準(zhǔn)確度。

上述工作通過利用肽段骨架碎裂規(guī)律的非糖庫依賴檢索策略,在N-糖肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理方面獲得了目前最高的譜圖解析效率,實現(xiàn)了深度準(zhǔn)確的位點特異性糖型分析,為糖生物學(xué)功能研究提供了新工具。