張 鵬，滕彩玲，管俊嬌，黃清梅，劉艷芳，楊曉洪，毛 進(jìn)，張建華

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，云南 昆明 650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，云南 昆明 650205）

0 引言

玉米（Zea mays L.）是我國(guó)的主要糧食作物之一，其作為重要的糧、經(jīng)、飼兼用的作物，對(duì)整個(gè)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著巨大的影響［1］。種子是作物生產(chǎn)的基礎(chǔ)，種子水分是保持和控制種子生命活動(dòng)的重要介質(zhì)，其含量直接影響種子適時(shí)收獲、安全加工、安全貯藏、安全運(yùn)輸、種子活力的正確測(cè)定等方面，也是種子能否正常萌動(dòng)、發(fā)芽、出苗的重要依據(jù)［2］。深入開(kāi)展種子成熟度、水分含量的研究，有助于控制種子的質(zhì)量，提高種子的發(fā)芽率和壯苗率。有學(xué)者認(rèn)為多數(shù)雜交品種馬齒型的種子生理成熟可作為適宜收獲期的標(biāo)準(zhǔn)［3-4］。由于玉米籽粒的成熟時(shí)間和成熟度不同，因此在相同時(shí)間收獲玉米無(wú)法保證其水分含量達(dá)到統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，收獲后玉米種子的活力也不盡相同。余志江等［5］研究認(rèn)為，授粉后35 d收獲的玉米雜交種子已具備正?；盍拓S產(chǎn)能力。有研究證明，玉米高活力種子的適宜采收期開(kāi)始于授粉后47~60 d，此時(shí)籽粒水分含量在40%左右［6］。相關(guān)報(bào)道指出具有生命力的干種子的生理活動(dòng)是十分微弱的，但通過(guò)水分以及一系列代謝作用可以打破種子的休眠狀態(tài)，促使種子萌發(fā)，可見(jiàn)水是種子萌發(fā)不可缺少的先決條件［7-8］。對(duì)種子質(zhì)量的傳統(tǒng)檢測(cè)方法大多需要對(duì)種子進(jìn)行破壞性分析，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，過(guò)程復(fù)雜，難以滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對(duì)種子無(wú)損檢測(cè)、快速生產(chǎn)的要求［9-10］。

有研究報(bào)道認(rèn)為利用核磁共振弛豫譜技術(shù)可以對(duì)種子內(nèi)部水分分布和含量變化進(jìn)行有效的活體檢測(cè)［11］。Vashisth等［12］利用NMR光譜研究了鷹嘴豆在萌發(fā)過(guò)程中的吸水特性，觀測(cè)到種子吸水具有先快后慢再轉(zhuǎn)快的特點(diǎn)。Manz等［13］利用核磁共振成像技術(shù)研究了煙草種子在萌發(fā)過(guò)程中水分分布的變化，并發(fā)現(xiàn)脫落酸對(duì)種子水分吸收具有抑制作用。但上述2種技術(shù)也存在成本高的缺點(diǎn)，普通的課題組因設(shè)備成本高昂而無(wú)法開(kāi)展相關(guān)研究。近年來(lái)，很多學(xué)者針對(duì)種子水分含量的無(wú)損快速檢測(cè)，利用高光譜技術(shù)做了很多嘗試［14-15］，并取得了一定的進(jìn)展。蘆兵等［16］利用高光譜技術(shù)對(duì)水稻種子含水量采用模擬退火算法-支持向量回歸建立了定量檢測(cè)模型，預(yù)測(cè)集測(cè)定系數(shù)為0.9286。張伏等［17］研究表明利用高光譜技術(shù)可以在紫外波段、可見(jiàn)光波段、近紅外波段獲取大量連續(xù)的光譜圖像數(shù)據(jù)，其包含的圖像信息和光譜信息不僅能從外觀上反映被測(cè)樣本的形態(tài)學(xué)特征，而且能從內(nèi)部反映被測(cè)樣本的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分，進(jìn)而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)被測(cè)物內(nèi)外部的綜合評(píng)價(jià)。

筆者利用高光譜技術(shù)［18］對(duì)不同成熟度玉米種子的內(nèi)部特征進(jìn)行了快速無(wú)損檢測(cè)，并結(jié)合LemnaTec表型平臺(tái)中已經(jīng)成熟的Lemnalauncher圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行種子表型數(shù)據(jù)采集，以及種子內(nèi)相關(guān)特征指標(biāo)的測(cè)定，對(duì)不同類型玉米種子表型指標(biāo)、內(nèi)部特征的變化規(guī)律進(jìn)行了研究，解析了不同成熟度玉米種子的特征變化規(guī)律、水分變化情況，以期為玉米種子質(zhì)量控制的機(jī)理研究提供理論依據(jù)，奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選用云南地區(qū)主栽玉米品種收獲后的種子，8個(gè)品種的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。表型分析系統(tǒng)使用實(shí)驗(yàn)室版高通量表型測(cè)量系統(tǒng)Scanalyzer HTS，該系統(tǒng)是一套具有高通量采集小型植物及其他樣品材料表型數(shù)據(jù)功能的多功能表型系統(tǒng)，可以對(duì)不同品種、不同生命時(shí)期小型植物或者其他樣品材料進(jìn)行深入的表型數(shù)據(jù)采集，此系統(tǒng)可以根據(jù)測(cè)量樣品數(shù)量選擇不同配置版本，有紅外（IR）、近紅外（NIR）等多種傳感器以及光源選擇，以滿足不同領(lǐng)域的表型研究。成像模塊的具體規(guī)格：近紅外（NIR），焦距50 mm，1450 nm帶通濾波器，視野18°×14°，工作距離540 mm；可見(jiàn)光（VIS），焦距50 mm，視野20°×15°，工作距離485 mm。

表1 參試玉米品種的詳細(xì)信息

1.2 試驗(yàn)方法

收集不同品種類型的玉米種子，然后進(jìn)行田間種植，播種方式為穴播，每個(gè)小區(qū)種植40株，行距70 cm，株距30 cm，在5月20日播種。從籽粒初始灌漿期（2020年8月10日）開(kāi)始第1次種子采樣，此后每10 d采樣收獲種子1次，直至果穗期（2020年9月29日）。在不同時(shí)間段收獲的種子的成熟度不同，以此作為不同成熟度梯度。每個(gè)品種每批次選取果穗中部1/3處的種子20粒，使用真空包裝袋密封保存；在采樣次日利用表型測(cè)量系統(tǒng)Scanalyzer HTS，在可見(jiàn)光（VIS）光源條件下測(cè)定種子的表型特征指標(biāo)，包括長(zhǎng)度、寬度、周長(zhǎng)、面積、偏心率、緊密度、圓度等；另外在近紅外（NIR）光源條件下測(cè)定種子的相對(duì)含水量，具體量化指標(biāo)為藍(lán)色均值、綠色均值、紅色均值，藍(lán)色均值越高，表示相對(duì)含水量越高；3個(gè)量化指標(biāo)代表的相對(duì)含水量大小為藍(lán)色＞綠色＞紅色，即顏色越深，相對(duì)含水量越高。

1.3 數(shù)據(jù)處理、圖像分析與統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)中的性狀數(shù)據(jù)均通過(guò)表型測(cè)量系統(tǒng)Scanalyzer HTS獲取。采用SPSS VER 16.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理、相關(guān)性分析和統(tǒng)計(jì)分析；用鄧肯氏檢驗(yàn)法進(jìn)行方差分析（P＜0.05）；使用本課題組自主研發(fā)的植物顏色性狀分析系統(tǒng)進(jìn)行成像圖片顏色的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度玉米種子的表型特征

選擇水平距離（mm）、最遠(yuǎn)兩點(diǎn)距離（mm）、垂直距離（mm）、表面積（mm2）、周長(zhǎng)（mm）、圓度這6個(gè)指標(biāo)來(lái)表征供試種子的表型特征。特征值計(jì)算需由光譜圖片成像后經(jīng)過(guò)像素點(diǎn)數(shù)進(jìn)行復(fù)雜的迭代計(jì)算，Scanalyzer HTS表型分析系統(tǒng)給定的距離/像素轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.0483871，各特征值的計(jì)算公式如下：水平距離=X軸面積（像素?cái)?shù)）×轉(zhuǎn)換系數(shù)；最遠(yuǎn)兩點(diǎn)距離=卡尺長(zhǎng)度（像素?cái)?shù)）×轉(zhuǎn)換系數(shù)；垂直距離=Y軸面積（像素?cái)?shù)）×轉(zhuǎn)換系數(shù)；面積=Area（像素?cái)?shù)）×轉(zhuǎn)換系數(shù)×轉(zhuǎn)換系數(shù)；周長(zhǎng)=Circumference（像素?cái)?shù)）×轉(zhuǎn)換系數(shù)；圓度由系統(tǒng)直接計(jì)算生成。

根據(jù)上述公式，計(jì)算獲得各特征值，之后利用SPSS軟件將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，便于在同一數(shù)量級(jí)進(jìn)行不同表型特征值的分析，得到8個(gè)品種在不同時(shí)間段的表型特征雷達(dá)圖譜（圖1）。由圖1可見(jiàn)：品種4、6、71為普通雜交玉米，其籽粒特征值在50 d或60 d時(shí)達(dá)到最大值，變化規(guī)律基本一致，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大；品種47、51、57、60、162為甜玉米或糯玉米，其籽粒表型特征值的變化與普通雜交玉米有所不同，各項(xiàng)特征值的最大值出現(xiàn)在30~40 d，且在60 d時(shí)各項(xiàng)值變小，尤其在甜質(zhì)型玉米籽粒中較為明顯，例如品種60在30 d時(shí)各項(xiàng)值已達(dá)到最大，在60 d收獲時(shí)的各項(xiàng)值小于30、40、50 d時(shí)的各項(xiàng)值；品種162的生育期較短，在30 d時(shí)各項(xiàng)值達(dá)到最大，在40 d收獲時(shí)的各項(xiàng)值小于20 d時(shí)的各項(xiàng)值。

圖1 不同玉米品種種子表型特征的雷達(dá)圖譜

2.2 不同成熟度玉米種子相對(duì)含水量的變化

Scanalyzer HTS表型分析系統(tǒng)通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行可見(jiàn)光（VIS）和近紅外（NIR）成像，得到了不同玉米品種籽粒在10、20、30、40、50、60 d共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的可見(jiàn)光表型分析圖像和相對(duì)含水量成像圖片，最終獲得的4號(hào)品種的VIS和NIR成像圖片如圖2所示（限于篇幅，其他品種的VIS和NIR成像圖片在此省略）。通過(guò)表型系統(tǒng)，可以定性分析不同成熟度種子和同一成熟度種子不同部位的含水量差異。從圖2可以直觀地看出，隨著種子的不斷成熟，種子的顏色基本上呈現(xiàn)由深到淺的變化。就整體變化來(lái)說(shuō)，前20 d基本上以深藍(lán)色為主，表示含水量較高；20~40 d由藍(lán)色向綠色過(guò)渡，表示含水量由高到低發(fā)生變化；40~60 d基本上以淺藍(lán)色或綠色為主，表示含水量處于較低水平。此外，在20~50 d中間階段（品種162為20~30 d）供試品種的部分種子出現(xiàn)了紅色，表示在這一階段這些種子的含水量處于較低水平，具體原因還有待分析。上述結(jié)果基于肉眼觀測(cè)，還無(wú)法得知某種顏色所代表的水分相對(duì)占比情況，因此，還需要使用圖像顏色分析軟件進(jìn)行分析后才能得出更為直觀、準(zhǔn)確的結(jié)果。

圖2 4號(hào)品種在不同時(shí)間點(diǎn)的可見(jiàn)光（VIS）成像和近紅外（NIR）成像

結(jié)合供試種子的近紅外成像圖片，利用本課題組自主研發(fā)的植物顏色性狀分析系統(tǒng)，將10~60 d不同時(shí)間點(diǎn)種子內(nèi)不同顏色面積量化，以4號(hào)品種為例，得到了如圖3所示的種子內(nèi)水分含量變化情況（其余品種在此省略）。由圖3可見(jiàn)：4號(hào)品種在10 d和20 d時(shí)種子內(nèi)水分含量變化不大；在30 d和40 d時(shí)出現(xiàn)了表示水分含量水平較低的顏色分布，占比分別為1.59%和3.94%；進(jìn)入50 d和60 d時(shí)，以淺藍(lán)色為主，占比分別為37.23%和34.33%，但60 d時(shí)的顏色比50 d時(shí)要淺，說(shuō)明水分含量變低。

圖3 4號(hào)品種不同成熟度種子內(nèi)水分含量的變化

2.3 不同成熟度玉米種子表型特征與含水量變化的關(guān)系

基于上述種子表型特征和水分含量變化的分析結(jié)果，利用Scanalyzer HTS表型分析系統(tǒng)測(cè)定的藍(lán)、綠、紅色均值作圖（圖4）。結(jié)合8個(gè)供試品種來(lái)看，隨著種子成熟度的增加，3個(gè)顏色均值均呈下降趨勢(shì)，且表示水分含量較高的藍(lán)色均值處于較低的水平；57號(hào)和60號(hào)品種為甜質(zhì)型品種，在進(jìn)入50~60 d時(shí)，表示水分含量最低的紅色均值高于藍(lán)色和綠色均值，這與甜質(zhì)型玉米品種在收獲后種子皺縮，其各項(xiàng)表型指標(biāo)值明顯小于30~40 d時(shí)的指標(biāo)值相符。

圖4 8個(gè)玉米品種種子藍(lán)、綠、紅色均值的變化

計(jì)算了供試玉米品種表型特征與藍(lán)、綠、紅色均值間的相關(guān)系數(shù)（皮氏積矩相關(guān)系數(shù)），結(jié)果如表2所示：在本研究所選取的5個(gè)表型特征值之間存在顯著的線性相關(guān)，而圓度這一特征值與其他特征值相關(guān)不顯著；在表示種子內(nèi)水分含量的藍(lán)、綠、紅色均值之間也存在顯著的線性相關(guān)；6個(gè)表型特征值與藍(lán)、綠、紅色均值之間均存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性不明顯。

表2 供試玉米品種表型特征與藍(lán)、綠、紅色均值間的相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論與討論

長(zhǎng)期以來(lái)，人們根據(jù)感官評(píng)價(jià)或經(jīng)驗(yàn)來(lái)判斷作物種子的成熟度，而對(duì)種子內(nèi)部特征的具體變化情況知之甚少。近些年來(lái)，表型組學(xué)研究以及圖像分析技術(shù)的快速發(fā)展使得對(duì)作物種子質(zhì)量的無(wú)損檢測(cè)分析成為可能，尤其是光譜分析技術(shù)，其具有無(wú)污染、無(wú)損、成本低、便捷、無(wú)需預(yù)處理樣本等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用到種子質(zhì)量檢測(cè)、農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)、中草藥鑒別、化工成分檢測(cè)等領(lǐng)域中［19］。在玉米種子的發(fā)育過(guò)程中，其外部形態(tài)特征隨成熟度的變化而變化；本研究選取的水平距離、最遠(yuǎn)兩點(diǎn)距離、垂直距離、表面積、周長(zhǎng)、圓度這6個(gè)表型特征值隨著成熟度的增加而增大，變化規(guī)律基本一致，但甜質(zhì)型和糯質(zhì)型玉米有所不同，在30~40 d時(shí)各項(xiàng)值已達(dá)到最大。本研究發(fā)現(xiàn)圓度與其他5個(gè)表型特征值相關(guān)性不高，因此可以考慮用其他相關(guān)性較高的表型特征作為玉米種子的評(píng)價(jià)分析指標(biāo)。通過(guò)分析Scanalyzer HTS表型分析系統(tǒng)測(cè)定的藍(lán)、綠、紅色均值發(fā)現(xiàn)，隨著成熟度增加，3個(gè)均值均呈下降趨勢(shì)，且甜質(zhì)型品種在進(jìn)入50~60 d時(shí)，表示水分含量最低的紅色均值高于藍(lán)色和綠色均值，這符合實(shí)際情況。

作物種子在發(fā)育的過(guò)程中，由胚胎發(fā)生期到種子形成期再到成熟休止期，在整個(gè)過(guò)程中主要是貯藏物質(zhì)的積累，到一定階段后貯藏物質(zhì)的積累逐漸停止，種子含水量降低；在這一過(guò)程中含水量主要會(huì)影響SOD、CAT和MDA等酶的活性，從而影響物質(zhì)積累［20］，但不會(huì)出現(xiàn)水分含量先降低之后再增加的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，在中間階段供試玉米品種（尤其是57號(hào)和60號(hào)品種）的部分種子出現(xiàn)了紅色，這可能是由取樣導(dǎo)致的，可以在今后研究中加以驗(yàn)證。