許躍奇，閻海濤，常 棟，王曉強，何曉冰，馬文輝，賈方方

（1.河南省煙草公司 平頂山市公司，河南 平頂山 467000；2.商丘師范學院 生物與食品學院, 河南 商丘 476000）

煙草花葉?。═obacco Mosaic Virus）是一種在世界各植煙國普遍發(fā)生、局部地區(qū)嚴重流行的煙草病毒病害［1］，也是我國各產(chǎn)煙區(qū)的主要病害，嚴重限制了煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量的提高。煙株感病初期葉片會出現(xiàn)深綠相間的斑駁和雜斑，后期則形成深綠色泡斑，葉片卷曲變形，色澤不均，厚薄不一，葉密不開片［2］。若在煙草伸根期之前發(fā)病，損失可達50%~70%，甚至絕收；旺長期發(fā)病，損失達30%~50%［3］。因此，在煙草生長的早期實現(xiàn)花葉病的定期監(jiān)測和病害預測至關重要。

葉綠素是植物光合作用中主要的光能吸收物質(zhì)［4］，其含量高低是植物營養(yǎng)脅迫［5-6］、衰老進程［7］和病害脅迫［8］的良好指示劑。葉片綠色度（SPAD值）可表征作物葉片中葉綠素的相對含量［9-10］，其變化會導致作物相應光譜的改變，這為利用遙感技術對煙草花葉病進行實時監(jiān)測提供了可能。謝傳奇等［11］對灰霉病脅迫下番茄葉片中SPAD值的高光譜圖像信息進行了研究，建立了PLSR、PCR、BPNN和LS-SVM模型，結(jié)果表明：LS-SVM模型用于檢測SPAD值效果最好。謝靜等［12］研究認為利用高光譜成像技術結(jié)合偏最小二乘法建立的預測模型可反演水稻葉片上任意像素的SPAD值，可為水稻的病害預警提供方法。李梅等［13］對晚疫病病害脅迫下馬鈴薯葉片中的SPAD值與高光譜特性進行了關聯(lián)研究，比較了SPAD值的基于全光譜的PLSR模型、基于特征波長的LS-SVM模型和基于植被指數(shù)的二次多項式模型，認為三者在預測效果和簡化應用方面各有優(yōu)劣。前人在作物的病害監(jiān)測方面已取得了較大進展［14-16］，促進了病害早識別、早防控的實現(xiàn)，降低了作物產(chǎn)量損失和品質(zhì)劣變，減少了農(nóng)藥錯施、濫施引起的環(huán)境污染。然而，上述研究多是基于前人經(jīng)驗，利用已有的光譜參數(shù)對作物病害進行估測，鮮有針對煙草病害的敏感光譜波段篩選和參數(shù)提取，而關于煙草花葉病冠層尺度SPAD值的定量估算則尚未見報道。

因此，本研究通過人工誘發(fā)煙草花葉病（TMV）并測量感病和健康煙株的冠層光譜和冠層SPAD值 ，綜合分析二者之間的相關性，探索構建檢測煙草花葉病SPAD值的最佳波段、光譜參數(shù)及模型，預測煙草的花葉病病害脅迫，為生產(chǎn)中TMV的精準診斷及高效管理提供理論基礎與技術途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2019年和2020年連續(xù)2年在河南省平頂山市郟縣李口鎮(zhèn)進行，采用大田試驗。供試土壤為褐土，前茬作物紅薯，試驗土壤的pH值為 7.77、有機質(zhì)含量為9.53 g/kg、堿解氮含量為69.74 mg/kg、速效磷含量為2.74 mg/kg、速效鉀含量為106.61 mg/kg。供試煙草品種為中煙100，分別于2019年4月28日和2020年4月25日移栽，按行株距120 cm×60 cm種植。小區(qū)面積共667 m2，試驗田其他栽培管理措施按當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術規(guī)范進行。

煙草TMV病毒從煙草普通花葉病中分離得到，由商丘師范學院植物與微生物互作河南省高校重點實驗室提供并保存。在移栽后15 d，于煙草第5片葉上常規(guī)摩擦接種。接種后第5 d開始進行調(diào)查，按照接種后煙株的顯癥情況，選取單一TMV侵染脅迫所致的花葉病對煙株進行病害分級。于移栽后30 d開始采集并測定發(fā)病煙株，每個病害等級處理設置3個重復。病害分級標準參照中華人民共和國煙草行業(yè)標準煙草病害分級及調(diào)查方法分級：0級（全株無病）、1級（心葉脈明或輕微花葉，或上部1/3葉片花葉但不變形，植株無明顯矮化）、2級（1/3至1/2葉片花葉，或少數(shù)葉片變形，或主脈變黑，植株矮化為正常株高的2/3以上）、3級（1/2至2/3葉片花葉，變形或主側(cè)脈壞死，或植株矮化為正常株高的2/3至1/2）、4級（全株葉片花葉，嚴重變形或壞死，病株矮化為正常植株高度的1/2以上至1/3）。

1.2 測定方法

1.2.1 光譜測定 采用美國ASD公司生產(chǎn)的Field Spec3野外光譜測定儀， 光譜范圍為350~ 2500 nm，區(qū)間為350~1000 nm的光譜分辨率為14 nm，1000~2500 nm 區(qū)間內(nèi)的分辨率為2 nm，光譜采樣間隔1.6 nm，視場角25°。選擇晴朗、無風、無云的天氣，于北京時間10：00～14：00進行光譜測定。分別于移栽后第30、45、60、75、90和115 d，按照病害等級， 每個病級選3株長勢一致，能反映病害水平的大田煙株測量光譜。測量時傳感器探頭垂直向下，據(jù)冠層垂直高度為1.5 m，每株煙光譜值重復采集10次，取其平均數(shù)為該株煙的光譜反射率。各處理測定之前均進行白板校正。

1.2.2 煙草葉片SPAD值 日本Minolta Camera公司生產(chǎn)的SPAD-502葉綠素儀，利用650 nm紅光波段和940 nm近紅外光波段的透射光比值測量葉綠素的相對含量，其SPAD值無量綱，同葉綠素含量具有較高的相關性，常用于表征葉綠素含量［17］。待冠層光譜測定之后，取同株煙草的下（第6片葉）、中（第11片葉）、上部（第18片葉）同一部位煙葉，測定每片煙葉的葉尖及葉片兩側(cè)的近葉尖、葉中、近葉基、葉基這5個部位的SPAD值，取其平均數(shù)為該片煙葉的SPAD值，將不同葉位的SPAD值通過加權，求得整株煙草的SPAD值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用光譜數(shù)據(jù)處理軟件ViewSpec Programs對原始光譜數(shù)據(jù)進行異常值剔除、平均、數(shù)據(jù)導出等處理，利用Matlab 12.0、SPSS 18.0和Excel 2003等軟件對數(shù)據(jù)進行處理及計算。

通過構造光譜植被指數(shù)，可同時將植被反射率最大和外部影響因素最小化。本文構造了400~1300 nm波長范圍內(nèi)任意2個波段組合而成的差值（DVI）［18］、比值（RVI）［19］和歸一化（NDVI）［20］植被指數(shù)，分析它們與花葉病脅迫下煙草冠層SPAD值的關系。

1.4 模型評價指標

模型預測性能的評價指標包括決定系數(shù)（R2）和均方根誤差（RMSE），其計算公式如下。

2 結(jié)果與分析

2.1 TMV脅迫下煙草SPAD值動態(tài)變化

由圖1可見，除第30天外，其余時期感病煙株的SPAD值均明顯小于健康植株的，隨著發(fā)病等級的加重而降低，且隨著生育時期推移，此規(guī)律愈加明顯。這是由于煙草植株感染TMV后，葉片顏色變淺，呈淡綠色，導致SPAD值減小；而移栽后30 d煙株尚處于伸根期，早期發(fā)病的煙株除了葉片皺縮，嚴重矮化外，葉片的厚度及顏色也不均勻，可能導致發(fā)病植株的SPAD值高于健康植株。

圖1 TMV脅迫下煙草冠層SPAD值動態(tài)變化

2.2 TMV脅迫下煙草冠層反射光譜的動態(tài)變化

圖2展示了TMV脅迫下煙草冠層反射光譜的變化趨勢，光譜測定時期和測定植株均同煙草SPAD值的測定（圖1）相對應。TMV脅迫下煙株冠層光譜變化的整體趨勢為：從移栽后30~75 d，冠層光譜穩(wěn)中有升；移栽后75~115 d，由于煙株凋萎，葉片發(fā)黃，下部葉和中部葉采收，冠層結(jié)構發(fā)生變化，進而導致冠層光譜呈現(xiàn)降低趨勢。不同時期處理間差異明顯，且在可見光，近紅外，短波紅外光區(qū)規(guī)律一致，但不同時期處理間的動態(tài)變化則無一致規(guī)律，具體表現(xiàn)如下：移栽后30 d：3級＞1級＞0級＞4級≥2級；移栽后45 d：1級≥3級＞2級＞0級＞4級；移栽后60 d：3級＞0級≥1級＞2級＞4級；移栽后75 d：0級＞1級＞2級＞3級＞4級；移栽后90 d：2級＞4級＞0級＞3級＞1級；移栽后115 d：4級＞3級＞2級＞1級＞0級。

圖2 TMV脅迫下煙草冠層光譜曲線動態(tài)變化

由此可見，高光譜遙感波段多，信息量大，僅從表觀反射光譜中，難以提取有用信息。同時，由于冠層光譜受植物冠層結(jié)構、土壤背景、大氣狀況等的干擾，難以準確提取植被信息。通過構造光譜指數(shù)，可以使植被反射信息最大化，外部因素影響最小化。

2.3 煙草SPAD值光譜指數(shù)模型構建

2.3.1 TMV脅迫下煙草SPAD值與光譜指數(shù)的定量關系 植物葉片在可見光區(qū)（400～700 nm） 、紅邊區(qū)（680～760 nm）和近紅外光區(qū)（780～1300 nm） 的光譜反射率和葉片光合色素含量之間有較高的相關性，加之350~400 nm噪音較大，因此本文主要選擇400~1300 nm之間的波段進行分析。

植被指數(shù)是由光譜數(shù)據(jù)經(jīng)過線性和非線性組合構成的對植被有一定指示意義的各種光譜參數(shù)。為了探尋估算冠層SPAD值的最佳光譜指數(shù)，本文采用減量精細采樣法，系統(tǒng)分析了400~1300 nm范圍內(nèi)任意2個波段組合的差值（DVI）、比值（RVI）和歸一化（NDVI）植被指數(shù)與冠層SPAD值的相關性。圖3為400~1300 nm內(nèi)不同波段的光譜指數(shù)組合估算冠層SPAD值的線性擬合決定系數(shù)R2等勢圖，圖3a顯示SPAD值同差值植被指數(shù)（DVI）相關性較好的波段主要集中在796~1110 nm的近紅外波段，而比值植被指數(shù)（RVI）（圖3b）和歸一化植被指數(shù)（NDVI）（圖3c）具有很強的一致性，主要集中在719~760 nm的近紅外波段。

圖3 光譜指數(shù)與煙草SPAD值的決定系數(shù)（R2）等勢圖（n=82）

2.3.2 光譜指數(shù)模型 TMV脅迫下煙草冠層反射光譜構成的3種光譜指數(shù)中，與SPAD值相關性最好的指數(shù)分別為 DVI（R835，R910），RVI（R731，R741）和NDVI（R731，R741）。分別利用這3個最優(yōu)光譜指數(shù)與SPAD值建立線性回歸模型（圖4a-圖4c），模型的決定系數(shù)R2分別為0.62、0.60和0.61，均大于0.5，說明模型的預測準確度較好。

圖4 煙草SPAD值的DVI（835，910）、RVI（731，741）、NDVI（731，741）和BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測模型（n=82）

2.3.3 SMLR模型 根據(jù)煙草SPAD值的DVI、RVI和NDVI決定系數(shù)等勢圖（圖3），分別選取決定系數(shù)R2最高的前20個DVI參數(shù)、RVI參數(shù)和NDVI參數(shù)，以這60個參數(shù)作為自變量，以對應的煙草SPAD值為因變量，建立逐步回歸方程（Stepwise multiple linear regression， SMLR）：y=17.88+202.38×DVI（R1077-R1107）-43.80×NDVI［（R719-R733）/ （R719+R733）］。方程的決定系數(shù)R2達到0.69，其預測穩(wěn)定性要稍優(yōu)于3個線性模型。

2.3.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型 BP神經(jīng)網(wǎng)絡在非線性映射功能方面具有無可比擬的優(yōu)勢，其神經(jīng)元傳輸函數(shù)為非線性函數(shù)，映射方式為“點對點”映射［18-21］。本文采用了三層BP神經(jīng)網(wǎng)絡，包括輸入層，單隱含層和輸出層。以逐步回歸方程中的自變量作為輸入層，煙草SPAD值作為輸出層。采用“試錯法”來確定隱含層節(jié)點數(shù)，該模型的隱含層節(jié)點數(shù)為45。輸入層的傳遞函數(shù)為正切函數(shù)tansig，輸出層的傳遞函數(shù)為線性函數(shù)purelin。以2020年的試驗數(shù)據(jù)作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型的預測樣本，預測效果的R2為0.89，預測效果最好（圖4d）。

2.4 模型驗證

利用2019年的試驗數(shù)據(jù)對已建立的DVI、RVI、NDVI、SMLR和BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型進行驗證，分別構建了5個模型的實測值與預測值的1∶1關系圖，采用預測精度（P-R2）和均方根誤差（RMSE）進行定量評價（圖5）。結(jié)果顯示：5種模型的精度（P-R2）分別為0.49、0.52、0.52、0.51和0.79，均方根誤差RMSE分別為5.33、5.22、5.23、17.13和3.40。其中以BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型的驗證效果最好，P-R2最大，RMSE最小，擬合值曲線最接近1∶1關系線，說明模型的預測值和實測值符合度較高。

圖5 煙草SPAD值的預測值和實測值1∶1關系圖（n=87）

3 討論

應用遙感技術構建植被指數(shù)對作物色素含量進行反演，進而評價其光合能力和健康狀況是目前植被遙感領域的研究熱點［22］。盡管生物脅迫和非生物脅迫均可降低作物的葉綠素含量，但導致其葉綠素變化的機制卻是不同的。水分脅迫、營養(yǎng)脅迫等非生物脅迫主要是因為植物本身養(yǎng)分供應不足限制了葉綠素合成［23-24］；而諸如TMV等病害脅迫則是由于病菌的大量繁殖及有毒物質(zhì)的積累，堵塞了導管并破壞植株的內(nèi)部結(jié)構，從而造成葉綠素的降解加速。因此，應首先明確引起葉綠素變化的內(nèi)在機理；此外，不同病害脅迫所導致的植株形態(tài)結(jié)構及生理變化具有“內(nèi)在性”和“專一性”等特點，而高光譜遙感則主要提取作物表觀性特征，因此早期病害植株在原始光譜反射率上差異較小，若是僅對原始光譜進行分析，將很難及時識別病害的發(fā)生。同時，冠層光譜又受大氣、植株背景等因素的影響，且隨著病害程度加重、生育時期推進，影響冠層光譜的主要因素也會發(fā)生變化，因此，若用原始光譜指數(shù)，難以準確估算病害狀況。本研究采用減量精細采樣法，系統(tǒng)分析了TMV脅迫下煙草冠層400~1300 nm波段范圍內(nèi)任意2個波段結(jié)合組成的差值、比值和歸一化植被指數(shù)等相對植被指數(shù)，不僅加強了生物脅迫下植株“內(nèi)在性”與遙感的“表觀性”特征相結(jié)合，同時也弱化了病害時期、植株背景等的影響，克服了“異病同譜”的缺陷，對煙草花葉病的實時監(jiān)測更具針對性和適用性。

前人對不同作物的SPAD值進行了光譜研究，發(fā)現(xiàn)玉米、油菜等作物的SPAD值的光譜敏感波段均集中于可見光波段［25-27］。本文篩選出以835 nm、910 nm、731 nm和741 nm為 中 心 的TMV脅迫下煙草SPAD值光譜敏感波段。其中731 nm和741 nm均位于可見光波段的紅光波段，而835 nm和910 nm則位于近紅外波段，相比前人研究，新增了近紅外波段為煙草SPAD值的光譜敏感波段。然而，本研究中獲取煙株冠層光譜信息的方式為將傳感器垂直植株冠層向下，這種垂直觀測模式通常只獲取了植株上層的光譜信息，難以對其中下層葉片的長勢參數(shù)進行遙感反演。而TMV發(fā)病特性為自下而上，因此垂直的冠層光譜探測將具有一定程度的滯后性。同時，大量研究［28-30］表明：非垂直角度所觀測到的反射率與垂直角度所觀測的反射率有明顯差別；太陽—地表—傳感器之間空間位置的不同會導致傳感器觀測視場內(nèi)植被和土壤的光照和陰影成分比例發(fā)生變化，進而影響到植被二向反射率的變化。因此，下一步我們的研究方向?qū)⒗枚嘟嵌冗b感技術對作物生物脅迫下的葉綠素含量及密度進行立體監(jiān)測，綜合分析作物中下層葉片的生長信息對整個冠層光譜信息的影響。

本文分別建立了煙草冠層SPAD值的DVI（R835，R910）、RVI（R731，R741）和 NDVI（R731，R741）的 光 譜指數(shù)線性估測模型、SMLR線性模型及BP神經(jīng)網(wǎng)絡估測模型，這5個模型的預測精準度及穩(wěn)定性均以BP神經(jīng)網(wǎng)絡最佳，SMLR模型的預測精度雖優(yōu)于3個光譜指數(shù)線性模型，但是其驗證效果則表現(xiàn)不甚理想（P-R2=0.51，RMSE=17.13）。SMLR和BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型的輸入?yún)?shù)均是60個與SPAD值相關性最好的光譜參數(shù)，但是二者預測和評估效果相差甚遠，一方面是由于這60個參數(shù)的分布規(guī)律，歸根結(jié)底來自于SPAD值的分布規(guī)律，均不是明顯的線性規(guī)律，所以使得BP神經(jīng)網(wǎng)絡點對點的非線性預測優(yōu)勢得以充分發(fā)揮。

4 結(jié)論

本文在確定煙草TMV脅迫下SPAD值光譜敏感波段的基礎上，又嘗試構建了不同預測模型，有效地對研究區(qū)域的煙草SPAD值進行了反演，進而大致估算煙草的健康狀況，為其長勢監(jiān)測提供理論參考。

（1）TMV脅迫下煙草SPAD值隨著生育期進展均表現(xiàn)為先増后降的趨勢，在移栽后75 d達到最大值。而同一生育期，除了伸根期（移栽后30 d），其余時期均呈現(xiàn)隨TMV病害等級加重SPAD值降低的趨勢。

（2）煙草冠層光譜整體變化規(guī)律以移栽后75 d為轉(zhuǎn)折點，75 d之前是穩(wěn)中有升，隨后則明顯降低。處理間差異明顯，但在不同時期冠層光譜無明顯一致變化規(guī)律。

（3）煙草SPAD值的敏感波段組合位于可見光波段和近紅外波段：796~1078 nm波段和898~1110 nm的差值組合，719~731 nm波段和733~759 nm波段的比值組合和歸一化組合。其中尤以DVI（R835，R910）、RVI（R731，R741）和 NDVI（R731，R741）與SPAD值的相關性最好。

（4）建立的SPAD值的DVI（R835，R910）、RVI（R731，R741）、NDVI（R731，R741）線性預測模型、SMLR模型和BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測模型中，以BP神經(jīng)網(wǎng)絡模型的預測精度最高，R2為0.89，模型的驗證效果也最佳，P-R2最大（0.79），RMSE最?。?.40）。表明BP神經(jīng)網(wǎng)絡能夠?qū)崟r監(jiān)測TMV脅迫下煙草的葉綠素狀況，這為煙草病害的光譜監(jiān)測提供了新的技術思路和方法途徑。