黃春麗，馮光維，汪 巍，余躍生

(黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州都勻558013)

糖尿病( diabetesmellitus，DM)是一種胰島素分泌不足或胰島功能受損引發(fā)的以高血糖為特征并伴有多種并發(fā)癥的的代謝性疾病[1]。近年來隨著人們生活結(jié)構(gòu)的改變以及人口老齡化的影響，糖尿病的發(fā)病率迅速增長，預(yù)計2040年全球糖尿病患者將達(dá)到6.42億[2]，嚴(yán)重威脅到人類身體健康。肝臟作為機(jī)體糖代謝的主要場所，也是胰島素的主要靶器官，臨床研究發(fā)現(xiàn)約有70%糖尿病患者伴有不同程度的肝臟病變，如肝纖維化、肝硬化甚至肝衰竭等[3]。近年來對由2型糖尿病引起的肝損傷研究逐漸增多，糖尿病肝損傷越來越受到人們的重視[4]。澤瀉為澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉Alismaorientalis( Samuel.) JuzeP. 的干燥塊莖，具有利尿、降血糖、降血脂、抗氧化及保肝等作用[5-7]。澤瀉對糖尿病的研究多停留在調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂方面，關(guān)于澤瀉治療糖尿病引起的肝損傷方面的研究較少。本研究利用谷氨酸鈉(monosodiumglutamate，MSG)聯(lián)合高脂飼料誘導(dǎo)的MSG肥胖大鼠模型，模擬糖尿病早期糖脂代謝紊亂的癥狀，通過觀察澤瀉對MSG肥胖大鼠肝臟的保護(hù)作用并探討可能的作用機(jī)制，為澤瀉的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動物 SD孕鼠，體重(300～400) g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物合格證編號：SCXK(湘 )2014-0011。實(shí)驗(yàn)前 1周飼養(yǎng)于黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動物中心，自由飲食，溫度 18～22℃。

1.2 藥品 澤瀉藥材(產(chǎn)自中國廣西，符合2015年藥典標(biāo)準(zhǔn))，非諾貝特(江蘇瑞年前進(jìn)制藥有限公司，批號：1803241)，羅格列酮(成都瑞恒有限公司，批號：190512)。

1.3 試劑與儀器 超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20200309)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20200304)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20200306)，ME203E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀( 上海亞榮生化儀器廠) ，KZ-II高速組織研磨儀(Servicebio公司)，D3024R臺式高速冷凍離心機(jī)(大龍公司)，EPoch酶標(biāo)檢測儀(BioTeK公司)，BMJ-1生物組織包埋機(jī)(天津航空機(jī)電公司)，ASP300S全自動封閉脫水機(jī) (LEICA公司)，RM2135病理切片機(jī)(LEICA公司)，CX顯微鏡(OLYMPuS公司)。

2 方法

2.1 藥物制備 先將澤瀉藥材粉粹成粗粉，取粗粉1 kg加80%乙醇回流提取3次，每次2 h，減壓回收溶劑既得澤瀉醇提取物，灌胃時用5%阿拉伯膠水溶液配制成所需濃度。高脂飼料配方：2%膽固醇，0.2%豬膽鹽，15%蛋黃粉，22%豬油，10%蔗糖另加高營養(yǎng)飼料攪拌混勻，經(jīng)過高壓、熟化滅菌制得。

2.2 模型建立 SD大鼠新生乳鼠從第2天開始皮下注射L-谷氨酸鈉，劑量為4 g/(kg·d)連續(xù)注射7 d，正常對照組給予等量生理鹽水。21 d后離乳飼養(yǎng)，MSG組給予高脂飼料喂養(yǎng)，正常對照組普通飼料，每周記錄體重觀察體型變化，8周后眼眶采血檢測空腹血糖及血脂變化，以空腹血糖及血脂水平顯著高于正常組為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 分組及給藥 篩選符合模型標(biāo)準(zhǔn)的大鼠48只大鼠，雌雄各半，按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，分別為模型組、羅格列酮組、非洛貝特組、澤瀉高、中、低劑量組，每組8只，另取8只空白大鼠作為正常對照組。羅格列酮組按5 mg/kg灌胃，非諾貝特組100 mg/kg，澤瀉醇提取物高、中、低劑量組分別為(生藥4、2、1 g/kg)，各組每日灌胃1次，連續(xù) 8周，用藥體積按每100 g體重灌胃1 ml，模型組及正常組灌胃同體積5%的阿拉伯膠水溶液。每周稱重1次，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。

2.4 標(biāo)本采集 給藥8周后，腹主動脈采血，剖取肝臟組織，摘取1片液氮速凍后，迅速轉(zhuǎn)入-80℃冰箱冷貯備用。另取1片浸泡于10%福爾馬林溶液，用于肝臟組織形態(tài)變化的觀察。

2.5 指標(biāo)檢測

2.5.1 肝臟系數(shù)的計算 將剖取的所有肝臟組織，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后，稱重，計算肝臟系數(shù)。肝臟系數(shù)=肝臟重量(mg)/大鼠體重(g)×100%。

2.5.2 肝臟病理的檢測 取出福爾馬林中固定好的肝臟組織，進(jìn)行常規(guī)的洗滌、改刀、脫水、石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下200倍觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化并拍照。

2.5.3 肝臟SOD、MDA及GSH-Px水平檢測 稱取肝臟適量，用9倍勻漿介質(zhì)研磨，然后將研磨液3 500 r/min，離心10 min，取上清制備成10%的組織勻漿，嚴(yán)格按試劑盒的要求進(jìn)行檢測。

3 結(jié)果

3.1 澤瀉對MSG大鼠肝臟重量及肝臟系數(shù)的影響 給藥8周后，與正常對照組相比，模型對照組肝臟重量及肝臟系數(shù)顯著升高(P<0.01)；與模型對照組相比，羅格利酮、非諾貝特組肝臟重量及肝臟系數(shù)顯著降低(P<0.01，P<0.05)；澤瀉高、中劑量組肝臟重量及肝臟系數(shù)顯著降低(P<0.01，P<0.05)。澤瀉低劑量組對肝臟重量及肝臟系數(shù)沒有明顯影響，見表1。

表1 澤瀉對MSG大鼠肝臟重量及肝臟系數(shù)的影響

3.2 澤瀉對MSG大鼠肝臟組織變化的影響 正常對照組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞排列整齊，圍繞中央靜脈呈放射狀，未見明顯病理變化(圖1-A)；模型對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞腫大，脂肪變性明顯，胞漿充滿空泡脂肪，細(xì)胞核偏離正常位置，細(xì)胞排列紊亂條索狀排列基本消失(圖1-B)。與模型組相比各治療組除澤瀉低劑量組外其余各組細(xì)胞腫脹程度均有減輕，胞漿空泡脂肪減少，脂肪變性程度有所改善，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本趨于正常(圖1-C～G)。

A正常對照組(H.E×200) B 模型對照組(H.E×200) C羅格列酮組(H.E×200) D非諾貝特組(H.E×200)

3.3 澤瀉對MSG大鼠肝臟SOD、MDA及GSH-Px含量的影響 給藥8周后，與正常對照組相比，模型對照組SOD、GSH-Px含量顯著降低(P<0.01)；MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型對照組相比，羅格利酮、非諾貝特組SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)；澤瀉高、中劑量組SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.01，P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.01，P<0.05)。澤瀉低劑量組對肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量沒有明顯影響，見表2。

表2 澤瀉對MSG大鼠肝臟SOD、GSH-Px及MDA的影響

4 討論

糖尿病長期高血糖導(dǎo)致機(jī)體不能很好利用的葡萄糖和脂肪酸在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橹?，脂肪在肝臟沉積后容易引起肝損傷[8]。反過來，肝損傷后又會影響糖原對葡萄糖的轉(zhuǎn)化，最終影響血糖[9]。因此改善糖尿病引起的肝損傷在糖尿病的治療過程中意義重大。肝臟作為糖脂代謝的主要場所，血糖血脂升高后，肝臟過氧化應(yīng)激水平升高[10]，產(chǎn)生大量氧自由基與體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生大量丙二醛(MDA)，與蛋白結(jié)合后能使細(xì)胞功能失調(diào)甚至破壞細(xì)胞活性。而超氧化物歧化酶(SOD)能防止脂質(zhì)過氧化，但血脂上升后損傷肝臟抗氧化能力，致使SOD、GSH-Px活性降低，自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡受到破壞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示采用MSG加高脂飼料復(fù)制的MSG肥胖大鼠肝臟有一定程度的受損，并且肝臟中SOD、GSH-Px活性顯著降低，MDA含量明顯上升，經(jīng)過澤瀉治療后，各組大鼠肝臟SOD、GSH-Px活性顯著升高，MDA含量顯著降低，肝臟組織受損情況也有所改善，說明澤瀉對MSG大鼠肝臟有一定的保護(hù)作用，并且其作用機(jī)制可能與其增加肝臟抗氧化能力有關(guān)，是否是多靶點(diǎn)多途徑還需進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。