王松華 李東風 孟 瑋**

（1）江西科技師范大學，有機功能分子研究所，南昌 330013；2）華南師范大學生命科學學院，廣州 510631）

斑胸草雀（Taeniopygia guttata），成年雄鳥善鳴，可用作開展發(fā)育生物學、神經(jīng)生物學、語言機理、醫(yī)學等領域研究的模型動物。

以模式動物進行科學研究是生物學的一個傳統(tǒng)。從線蟲到果蠅，從小鼠到鳴禽，模式動物功不可沒。將斑胸草雀（zebra finch）等鳴禽用作模型動物，得到全球同行的認可，并在發(fā)育生物學、神經(jīng)生物學、語言機理、醫(yī)學等領域取得重要進展。

鳴禽是鳥類中數(shù)量最為龐大的一支，屬于雀形目，體態(tài)小巧玲瓏，鳴唱婉轉(zhuǎn)動聽（附件Movie S1，附件Audio S1）。鳴禽的發(fā)聲出自鳴管，位于氣管與支氣管交界處，由一組鳴肌環(huán)繞，在腦神經(jīng)支配下收縮引起氣道內(nèi)氣體震蕩產(chǎn)生優(yōu)美的旋律（附件Movie S1）。更重要的是，鳴禽被認為是自然界中除人類外具有最為復雜發(fā)聲行為的動物。鳴禽鳴唱與人類語言相似，是一種發(fā)聲學習行為［1-2］。人類和鳴禽都是在生命早期的關鍵階段學習發(fā)聲，也都需通過聽覺反饋來糾正并完善自身發(fā)聲［3］。在進化上，鳴禽某些鳴唱控制核團與人類語言發(fā)聲腦區(qū)共享類似的轉(zhuǎn)錄譜，且具有和人類相似的發(fā)聲調(diào)控神經(jīng)通路，包括對發(fā)聲學習至關重要的皮層-紋狀體-丘腦-皮層環(huán)路和前腦發(fā)聲運動控制區(qū)域投射至腦干發(fā)聲運動神經(jīng)元的運動通路［4］。此外，鳴禽鳴唱可以通過聲學軟件進行量化分析，更加準確地評估行為與神經(jīng)活動之間的關系。因此，鳴禽為發(fā)聲學習行為研究提供了理想的動物模型［5-6］，并對理解人類語言學習機制具有重要意義［7］。

1 國內(nèi)外鳥鳴研究歷史回顧

鳴禽鳴唱研究已有近百年歷史，但將鳴禽作為模式動物只有幾十年。在國內(nèi)，東北師范大學藍書成教授是中國鳥鳴生理學的開拓者和奠基人，率先開展鳥類（家禽）及鳴禽發(fā)聲行為機制研究并形成“具有特色和獨創(chuàng)性”的比較生理學研究領域［8］。1958 年首次發(fā)現(xiàn)刺激鳥類中腦可以引起鳴叫反應及植物性反應［9］。1962 年在清醒狀態(tài)下刺激鳥類中腦可以引起鳴叫反應及軀體運動反應［10］。1980年后，左明雪及其團隊、李東風及其團隊、張信文課題組分別在東北師范大學、北京師范大學、華南師范大學、海南師范大學接續(xù)傳承，繼續(xù)開展鳴禽鳴唱行為機制的研究。2016 年，孟瑋和王松華博士在江西科技師范大學組成團隊繼續(xù)堅持鳥鳴研究，并嘗試探索鳴禽模型對語言障礙治療的意義。

1948年，英國劍橋大學Willams Thorpe率先開始了鳥鳴研究，發(fā)現(xiàn)蒼頭燕雀可以通過學習獲得鳴唱行為，開創(chuàng)性運用聲譜儀記錄了鳴禽的發(fā)聲行為。隨后他的學生Peter Marler［11］在美國加利福尼亞大學伯克利分校以白冠雀為研究對象，發(fā)現(xiàn)幼年關鍵學習期對鳴禽鳴唱學習的重要性。此后，Marler的學生們發(fā)表了一系列關于鳴禽鳴唱行為及機制研究的論文。其中，1969 年麻省理工學院Masakazuk Konish［12］闡述了聽覺反饋對鳴禽發(fā)聲學習及產(chǎn)生的重要意義。1976 年洛克菲勒大學Fernando Nottebohm［13］探明了金絲雀鳴唱神經(jīng)通路，包括發(fā)聲運動通路和前端腦通路，這為后續(xù)鳴禽鳴唱神經(jīng)生物學研究奠定了解剖學基礎。同年，Nottebohm 和加州大學洛杉磯分校Arthur P Arnold［14］發(fā)現(xiàn)鳴禽鳴唱控制系統(tǒng)存在性別二態(tài)性，開啟了探索性激素對鳴禽鳴唱行為調(diào)控作用的研究方向。1985 年，Nottebohm 實驗室［15-17］發(fā)現(xiàn)成年鳴禽高級發(fā)聲中樞（high vocal center，HVC）存在新生神經(jīng)元，并替換舊神經(jīng)元加入已有的發(fā)聲通路，這是首次在哺乳動物外發(fā)現(xiàn)成年新生神經(jīng)元。1998 年至今，洛克菲勒大學Erich D Jarvis［18］深入研究了鳴禽發(fā)聲學習的分子和遺傳機制，參照人腦結(jié)構(gòu)對鳴禽腦結(jié)構(gòu)重新命名［19］，將鳥類紋狀體與人類皮層相對應，進而探究人類復雜語言行為的進化 歷 程［5，20］。2000 年，加 州 大 學 舊 金 山 分 校Michael S Brainard 和Allison Doupe［21］發(fā)現(xiàn)鳴禽基底神經(jīng)節(jié)X區(qū)調(diào)控鳴唱可塑性的機制，從此啟動大量關于鳴禽基底神經(jīng)節(jié)對發(fā)聲行為調(diào)控的研究。同年，芝加哥大學Daniel Margoliash 實驗室［22］首次發(fā)現(xiàn)睡眠在鳴禽鳴唱感覺運動學習過程中的重要作用，為支持睡眠參與學習記憶的假設提供了重要例證。2001 年，Doupe 實驗室［23］在與鳴唱學習相關前端腦通路中的巢型皮質(zhì)前部巨細胞核外側(cè)部（lateral portion of the magnocellular nucleus of the anterior neostriatum，LMAN） 發(fā)現(xiàn)長時程增強（long term potential，LTP）現(xiàn)象對鳴唱學習是必須的，這是首次證實鳴唱控制系統(tǒng)內(nèi)存在長時程突觸可塑性。2012 年，杜克大學Richard Mooney 實驗室［24］首次將光遺傳技術(shù)應用在鳴禽腦操縱鳴唱行為，為鳴禽鳴唱行為研究帶來了新的視角。2021年，Brainard 與Todd F Roberts 等［25］合作，運用單細胞RNA 測序技術(shù)檢測鳴禽鳴唱運動通路的神經(jīng)元特性，首次提供了鳴禽鳴唱核團神經(jīng)元的RNA表達譜，并揭示鳴禽鳴唱通路和哺乳動物發(fā)聲通路具有不同的發(fā)育起源但具有相似的轉(zhuǎn)錄神經(jīng)元。

2 鳴禽模型在發(fā)聲行為學與神經(jīng)生物學跨學科研究中的應用

2.1 鳴曲可塑性機制

鳴禽為揭示動物行為和神經(jīng)可塑性的關系提供了一個有趣的研究系統(tǒng)［26］。在鳴禽鳴唱的習得過程中，鳴曲從高度變化的可塑期逐漸進入穩(wěn)定的固化期。即使在成年鳴曲完全固化之后，鳴曲也具有一定的可塑性。近些年研究發(fā)現(xiàn)，鳴曲可塑性的產(chǎn)生機制主要受控于基底神經(jīng)節(jié)及相關聯(lián)區(qū)域。Woolley等［27］首次發(fā)現(xiàn)，X區(qū)的蒼白球神經(jīng)元電活動編碼鳴禽鳴唱類型。Mooney 實驗室［28］利用光遺傳技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，抑制X區(qū)棘神經(jīng)元的活動可調(diào)控鳴禽鳴唱學習過程中的鳴曲可塑性。另外還發(fā)現(xiàn)，激活腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）-X 區(qū)通路足以引起幼鳥鳴唱學習［29-30］，其中VTA是神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）的重要來源之一，提示VTA 投射至X 區(qū)的多巴胺能神經(jīng)纖維在對鳴唱學習行為的調(diào)控中起重要作用。同時有研究表明，X 區(qū)的下游核團LMAN 電活動調(diào)控鳴曲音節(jié)基頻的波動［31］。此外，研究證實投射到X 區(qū)的HVC神經(jīng)元（HVCX）活動對幼鳥鳴唱學習行為是必需的，但與成年期鳴曲可塑性無關［32］。且近年有研究表明，鳴禽連接小腦和基底神經(jīng)節(jié)的皮層下回路，參與了鳴唱學習過程［33］，提示小腦在調(diào)控鳴唱學習中的作用。

2.2 神經(jīng)遞質(zhì)及性激素等生物活性物質(zhì)對鳴禽鳴唱行為的調(diào)控

DA 系統(tǒng)是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)之一，在神經(jīng)調(diào)節(jié)中起關鍵作用，因此一直是國內(nèi)外研究的熱點。在哺乳動物中，DA 參與運動、認知、動機、獎賞、成癮、學習等活動，并與人類的帕金森病、精神分裂癥和亨廷頓病等密切相關［1，34］。研究表明，DA 可通過調(diào)控鳴唱相關核團及聽覺區(qū)域，促進鳴禽幼年期鳴曲學習以及成年期鳴曲保持［1］。近年發(fā)現(xiàn)，DA可通過作用于X區(qū)參于調(diào)控鳴禽幼年期鳴曲學習，以及成年鳴禽的鳴唱維持和求偶性鳴唱行為［30，35-36］。對X 區(qū)的上游核團HVC研究發(fā)現(xiàn)，中腦投射至HVC 的DA 能神經(jīng)纖維有助于教習曲的習得和正常鳴唱行為的形成［37］。同時，DA還作用于聽覺皮層調(diào)控鳴禽聽覺區(qū)域可塑性［38-39］。本課題組近年對鳴唱前運動核團弓狀皮質(zhì)櫟核（robust nucleus of the arcopallium，RA）的研究發(fā)現(xiàn)，DA 可經(jīng)D1 樣DA 受體（D1-like dopamine receptor，D1R）提高成年鳴禽RA投射神經(jīng)元的興奮性［40］，同時DA 通過突觸前機制經(jīng)D1R 降低RA 投射神經(jīng)元接受的興奮性突觸傳遞［41］。由于RA投射神經(jīng)元活動變化決定了鳴曲特征的變化［42］，基于該結(jié)果有理由推測，生理條件下，DA 可通過改變RA 投射神經(jīng)元興奮性影響其活動，進而調(diào)控鳴唱行為。

另一種兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）在調(diào)控鳴禽鳴唱習得的過程中也發(fā)揮重要作用。研究表明，幼年期減少NE合成可抑制鳴禽鳴曲學習［43］，其中可能的原因是NE通過調(diào)控聽覺皮層，提升幼鳥習得鳴曲與教習曲的相似性［44］。在成年期，NE可增強復雜聽覺刺激的信號檢測［45］和聽覺前腦的編碼功能［46］，提升鳴曲穩(wěn)定性。

鳴唱運動核團HVC 和RA 還接受中樞膽堿能系統(tǒng)的投射和調(diào)控［47］。研究證實，非選擇性乙酰膽堿受體激動劑卡巴可（carbachol）滲透到HVC中，可以提高鳴曲的音調(diào)、振幅、節(jié)奏和穩(wěn)定性，并增加HVC神經(jīng)元的活動［48］。本課題組近年研究了膽堿能信號對成年鳴禽RA投射神經(jīng)元興奮性和內(nèi)在膜特性的影響。結(jié)果表明，膽堿能信號可通過引起膜電位超極化，增大后超極化電位和膜電導，降低RA投射神經(jīng)元興奮性，減少其活動。進一步研究證實，膽堿能信號主要通過毒蕈堿型乙酰膽堿受體影響RA 投射神經(jīng)元的興奮性和內(nèi)在膜特性，而尼古丁型乙酰膽堿受體不參與該作用［49-50］。膽堿能信號調(diào)控鳴禽鳴唱行為的機制仍有待揭示。

除神經(jīng)遞質(zhì)外，鳴禽腦內(nèi)的性激素在調(diào)節(jié)鳴唱穩(wěn)定性方面發(fā)揮關鍵作用。其中雄激素已被證實可以通過調(diào)控細胞增殖［51］、神經(jīng)元電生理特性［52］及突觸傳遞［53］來影響鳴唱控制核團，進而導致鳴唱行為改變［54-55］。而鳴禽腦內(nèi)的雌激素主要是雌二醇，由腦內(nèi)睪酮通過芳香化酶的作用轉(zhuǎn)化而來?，F(xiàn)有研究表明，雌激素對鳴禽聽覺編碼［56］、腦損傷修復［57］、空間記憶［58］及鳴唱行為等方面［59］具有重要影響［60］。

研究提示，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）在鳴禽鳴唱運動通路HVC-RA對鳴唱行為的調(diào)控中起重要作用。Dittrich等［61］研究發(fā)現(xiàn)，短暫提升斑胸草雀雄性幼鳥HVC 中BDNF 表達，可顯著提高感覺運動期鳴曲與教習曲的匹配度，促進鳴曲習得。而Kittelberger 等［62］研究發(fā)現(xiàn)，在鳴曲結(jié)構(gòu)已固化的成年雄性斑胸草雀RA 內(nèi)注入BDNF，可使已高度穩(wěn)定的鳴曲序列發(fā)生可逆性改變，并伴隨HVC-RA突觸數(shù)量顯著增加。近期，Miller等［63］研究表明，在成年雄性季節(jié)性繁殖鳴禽白冠雀RA 附近注射BDNF，可使RA 神經(jīng)元自發(fā)動作電位發(fā)放頻率增加，并提示BDNF 該作用經(jīng)HVC-RA 跨突觸起效。而最近本課題組在成年雄性斑胸草雀離體腦片上發(fā)現(xiàn)，BDNF 可提升RA 投射神經(jīng)元的興奮性，與此同時，BDNF 還可增強RA 投射神經(jīng)元接受的興奮性突觸傳遞（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

叉頭框P（fork head box P transcription factor，F(xiàn)oxP）基因是與人類語言及言語障礙相關的基因，亦稱語言基因。在鳴禽腦中，F(xiàn)oxP蛋白大量表達。研究證實，F(xiàn)oxP 蛋白對幼年鳴禽神經(jīng)環(huán)路發(fā)育和鳴唱學習，以及成年鳴禽的鳴曲穩(wěn)定都有重要作用［64］。幼年鳴禽X 區(qū)缺失FoxP1、FoxP2或FoxP4基因，將導致鳴唱學習能力受損，最終鳴曲不能發(fā)育完善［65-66］。最新研究發(fā)現(xiàn)，若敲除HVC 的FoxP1基因，可阻止幼鳥鳴曲的習得［64］，提示FoxP蛋白在鳴唱學習過程中起關鍵作用。

2.3 聽覺反饋與鳴禽鳴唱行為

鳴禽需要通過聽覺反饋來學習和維持鳴唱［67］。鳴禽腦中的聽覺系統(tǒng)主要包括與哺乳動物聽皮質(zhì)同源的L 區(qū)（field L complex）、巢狀皮質(zhì)尾內(nèi)側(cè)區(qū)（caudomedial nidopallium，NCM）和舊皮質(zhì)尾部（caudal mesopallium，CM）等結(jié)構(gòu)［67］。鳴唱系統(tǒng)和聽覺系統(tǒng)之間的聯(lián)系相對有限，大多數(shù)聽覺核團投射至HVC周圍的HVC殼（HVC shelf）和RA周圍的杯區(qū)（RA cup），只有界面核（nucleus interfacialis nidopallii，NIf）能把來自丘腦葡萄形核（uvaeformis，Uva）的聽覺和感覺信息直接上傳至HVC［68］。在鳴禽聽覺系統(tǒng)中研究比較多的是NCM 區(qū)域，其與雄性鳴唱學習有關［69］。研究提示，早期的聽覺經(jīng)驗可形成NCM 神經(jīng)元回路，通過招募γ-氨基丁酸抑制回路來形成對教習曲的記憶［70］。而在雌鳥中，NCM主要作用是對雄鳥鳴曲的識別［71］，短暫致NCM失活可導致雌鳥對雄鳥鳴曲偏好的特異性降低［71］。

致聾可破壞聽覺反饋，導致鳴曲快速退化。研究表明，致聾后HVCX神經(jīng)元樹突棘體積下降［67，72］，并導致HVCX神經(jīng)元的興奮性和抑制性突觸傳遞下降［72-73］。孫穎郁等［6，74］近年研究發(fā)現(xiàn)，致聾可導致斑胸草雀鳴唱控制核團X區(qū)和RA內(nèi)樹突棘數(shù)目增多，提示X區(qū)和RA的神經(jīng)可塑性與致聾引起鳴唱行為的改變相關。

2.4 光遺傳技術(shù)和基因組學在鳴禽鳴唱行為研究中的應用

Mooney 實驗室［24］首次將光遺傳技術(shù)應用在鳴禽鳴唱行為研究中，發(fā)現(xiàn)通過光遺傳抑制幼年期HVC 的神經(jīng)活動會導致幼鳥鳴唱學習能力下降。更有趣的是，Roberts團隊［75］利用光遺傳技術(shù)通過控制斑胸草雀與聽覺經(jīng)驗學習有關的兩個區(qū)域，成功對其大腦植入了一段記憶編碼，讓受試斑胸草雀產(chǎn)生了一段之前沒有學習過的鳴曲。另外，Ausra等［76］最近開發(fā)了一種無線無電池的輕攜光遺傳平臺，可以實現(xiàn)記錄自由活動狀態(tài)下的鳴禽鳴唱行為，為鳴禽鳴唱行為學研究提供了更有利的工具。

近幾十年來，基因組學取得了長足的發(fā)展，廣泛應用于生命科學各個領域。近年，Mello團隊［77］應用微陣列及原位雜交技術(shù)對斑胸草雀鳴唱控制系統(tǒng)中的380個基因進行了測序，為解析鳴唱控制通路功能特性的可能分子決定因素提供了新的見解。同時進一步利用比較基因組學技術(shù)檢測了鳴唱控制系統(tǒng)內(nèi)鈉、鉀、鈣和氯離子通道及其調(diào)節(jié)亞基，發(fā)現(xiàn)這些基因家族在鳥類和哺乳動物譜系之間高度保守，為深入探索離子通道如何促進鳴唱控制系統(tǒng)的神經(jīng)元興奮性等特性奠定了基礎［78-79］。近年發(fā)展起來的單細胞基因組學是理解神經(jīng)元多樣性的最有力工具之一。Colquitt 等［25］利用單細胞RNA 測序技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)，鳴禽鳴唱前運動核團HVC和RA與功能上具有相似性的哺乳動物新皮層進化起源并非一致。而Ivana 等［80］首次利用鳴禽原始生殖細胞，通過慢病毒載體轉(zhuǎn)導成功獲得轉(zhuǎn)基因斑胸草雀。這些研究進展將為后續(xù)深入研究鳴禽的功能基因組學奠定了堅實的基礎。

3 鳴禽模型對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及人類語言障礙治療的啟示

成年鳴禽鳴唱控制核團HVC 和X 區(qū)中加入的新生神經(jīng)元可與原有鳴唱控制通路整合并行使功能，促進新的鳴曲記憶形成［81-82］。研究表明，鳴唱控制核團損傷導致鳴曲受損后，HVC 新生神經(jīng)元可加速鳴曲恢復［83］。且新生神經(jīng)元可以重建成年鳴禽端腦退化后的功能性神經(jīng)回路，并顯示非損傷誘導的退化和神經(jīng)回路的重建對產(chǎn)生鳴唱習得行為至關重要［84］。這些重要發(fā)現(xiàn)預示著成年神經(jīng)發(fā)生對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及神經(jīng)退行性疾病的潛在治療前景。

可導致語言障礙的疾病主要有自閉癥、亨廷頓病、中風失語癥、運動性失語癥、感覺性失語癥等。由于研究人腦的局限性及醫(yī)學倫理的限制，無法深入探索各類語言障礙的發(fā)生機制，難以對癥治療。研究表明，鳴禽高級發(fā)聲中樞HVC 與人類運動性語言中樞布洛卡區(qū)（Broca’s area）同源，鳴唱前運動核團RA與人類運動皮層第五層同源，基底神經(jīng)節(jié)X 區(qū)與人類紋狀體同源，聽覺系統(tǒng)中的NCM區(qū)則與人類聽覺皮層同源［85］。同時鑒于鳴禽鳴唱行為與人類語言功能的高度相似性，鳴禽可為探索人類語言障礙的發(fā)生機制及治療手段提供有價值的研究模型。以自閉癥為例，其主要表現(xiàn)為社會交往障礙、語言交流障礙、重復刻板的行為等。有研究顯示，鳴禽鳴唱控制系統(tǒng)高度表達與自閉癥相關的接觸蛋白相關蛋白2 （contactin associated protein like protein 2，Cntnap2）［86］、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）［87］、活動依賴神經(jīng)保護蛋白（activitydependent neuroprotective protein，ADNP）［88-89］及FoxP蛋白［64］等。這些蛋白質(zhì)失活將導致鳴禽幼年期鳴曲學習障礙及成年期發(fā)聲障礙，與人類自閉癥語言障礙高度相似。除自閉癥外，Liu等［90-91］開創(chuàng)性利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將亨廷頓病的致病基因轉(zhuǎn)入斑胸草雀胚胎中，孵化后可產(chǎn)生嚴重的鳴曲學習及發(fā)聲障礙，包括發(fā)聲模仿不良、口吃、漸進的鳴曲句法和音節(jié)退化［91］。而Mooney 團隊［92］直接將亨廷頓病的致病基因轉(zhuǎn)入斑胸草雀X區(qū)，可使其鳴唱音節(jié)序列不穩(wěn)定。上述鳴唱行為變化與人類亨廷頓病語言障礙具有一定程度的相似性。這些有益的探索將為揭示人類語言障礙的發(fā)生機制并找到對癥的治療手段帶來借鑒。

4 展望

作為與人類語言功能相似的發(fā)聲學習研究理想動物模型，鳴禽鳴唱行為學從提出到與神經(jīng)生物學跨學科深入研究已有數(shù)十年。現(xiàn)在對鳴禽鳴唱控制系統(tǒng)的解剖結(jié)構(gòu)及其對鳴唱行為的調(diào)控作用有了較為全面的了解［93］（圖1）。光遺傳學、單細胞測序、CRISPR/Cas9 基因編輯［94］等前沿技術(shù)已將鳴禽鳴唱行為研究領域推向更深層次水平。另外，神經(jīng)遞質(zhì)等對鳴禽鳴唱控制核團神經(jīng)元網(wǎng)絡調(diào)控及對鳴唱行為的影響仍有待深入研究。同時新型熒光探針的運用將有助于進一步揭示鳴禽鳴唱過程中神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控作用。鳴禽鳴唱行為的神經(jīng)生物學研究定將為人類語言障礙相關疾病發(fā)生機制和治療手段的探索帶來重要啟示和理論支持。

Fig.1 The song control system of songbirds圖1 鳴禽鳴唱控制系統(tǒng)

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