劉曉藝 金 琴 王可品 賴良學(xué)**

（1）中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣州 510530；2）三亞豬種質(zhì)資源創(chuàng)新研究院，三亞 572000；3）海南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，三亞 572000）

家豬（Sus scrofa domesticus），不僅在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也是生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的大動(dòng)物模型以及潛在的異種器官移植供體來(lái)源。

動(dòng)物模型是研究人類基因功能、疾病發(fā)展機(jī)理及開發(fā)新治療手段的重要工具，在生命科學(xué)研究的發(fā)展過(guò)程中，小鼠是應(yīng)用最為廣泛的哺乳動(dòng)物模型。但小鼠并不適合所有生命科學(xué)研究，在腫瘤模型的檢測(cè)中常用的X光、超聲檢查，受限于小鼠的體型難以應(yīng)用；在腫瘤藥物試驗(yàn)中，約95%在小鼠上有非常明顯作用的藥物，在臨床療效甚微，甚至無(wú)效［1］；在基因功能的研究中，有些基因突變可導(dǎo)致人出現(xiàn)嚴(yán)重的疾病癥狀［2］，但在小鼠上表型不明顯，甚至沒有表型［3］。具有傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的豬，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，由于其體型、解剖結(jié)構(gòu)、器官大小、生理代謝、免疫系統(tǒng)都與人類更加相似，使其在異種器官移植［4］、疾病模型［5］、腦科學(xué)［6］、生物反應(yīng)器［7］、代謝模型［8］上的研究發(fā)展迅速。2012 年完成了豬的全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)豬全基因組與人有很大的相似性，不僅有112個(gè)位點(diǎn)的氨基酸序列完全相同，并且這些位點(diǎn)中大部分異常都會(huì)導(dǎo)致人相應(yīng)的疾?。?］。此外，在蛋白質(zhì)表達(dá)類型上，與小鼠相比，豬與人有更多的相似性，例如人胰腺α和β細(xì)胞表達(dá)MAF亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄 因 子B （MAF bZIP transcription factor B，MAFB），豬也表達(dá)，而小鼠卻不表達(dá)［10］。憑借以上優(yōu)勢(shì)，豬不僅非常適合作為由于基因突變導(dǎo)致的人類疾病的動(dòng)物模型［11-12］，在異種器官移植領(lǐng)域也具有潛在的應(yīng)用前景。2022 年1 月10 日，世界首例成功植入基因編輯豬心臟的手術(shù)完成，并延長(zhǎng)了患者2個(gè)月的壽命，開辟了基因編輯豬在異種器官移植領(lǐng)域的新時(shí)代［13］。

基因修飾通常是在基因組中插入或刪除某些基因，從而獲得理想的表型特征。在技術(shù)層面，基因修飾豬最開始主要依賴顯微注射來(lái)獲得，通過(guò)將多拷貝的DNA 注入到受精卵的核中，至少有一個(gè)拷貝的DNA 整合到受精卵的基因組中，才能成功獲得轉(zhuǎn)基因豬［14］。而后，隨著體細(xì)胞核移植技術(shù)（somatic cell nuclear transfer，SCNT）的興起，可以將發(fā)生了基因修飾的體細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，再移植到代孕動(dòng)物的輸卵管中，分娩后即可獲得基因修飾動(dòng)物［15］，顯著提高了培育基因修飾豬的效率。其中，獲得基因修飾體細(xì)胞是該技術(shù)關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，早期主要依賴轉(zhuǎn)基因和自然發(fā)生的低概率同源重組［16］分別建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和基因打靶細(xì)胞系，但由于體細(xì)胞在體外的增殖能力有限，基因修飾效率極低；隨著慢病毒轉(zhuǎn)染［17］、轉(zhuǎn)座子［18］、RNA 干擾［19］、位點(diǎn)特異性重組酶［20］的出現(xiàn)，在一定程度上提高了獲得基因修飾細(xì)胞的效率；直到ZFN［21］、TALEN［22］、CRISPR/Cas9［23］等人工核酸酶的出現(xiàn)，基因編輯領(lǐng)域發(fā)生了革命性的變化，這些核酸酶不僅能在基因組特定位置切割，極大地提高了同源重組的頻率和精確性，還將基因編輯的類型從敲除和敲入拓展到無(wú)痕編輯、多基因同時(shí)突變、條件性基因編輯（圖1）。

Fig.1 Schematic of the methods on generating genetically modified pigs圖1 制備基因修飾豬的方法示意圖

上述技術(shù)的發(fā)展使研究人員能夠高效快速地制備表達(dá)外源基因或敲除內(nèi)源基因的基因修飾豬模型。然而，在生命體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，有相當(dāng)一部分基因只在特定時(shí)期或特定組織中起功能，還有一部分基因敲除致死［24］。此外，即使是廣泛表達(dá)的基因，根據(jù)研究目的，也需要在特定時(shí)期調(diào)控其表達(dá)。因此，為了更加全面深入地研究基因的功能，條件性基因修飾系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。

條件性基因修飾系統(tǒng)在小鼠［25］、果蠅［26］、斑馬魚［27］等模式動(dòng)物中發(fā)展成熟且應(yīng)用廣泛，尤其是小鼠胚胎干細(xì)胞體系非常成熟，使小鼠成為條件性基因修飾系統(tǒng)首選的哺乳動(dòng)物模型。然而，部分小鼠基因的表達(dá)位置與時(shí)間和人存在差異，導(dǎo)致基因突變小鼠無(wú)法模擬人出現(xiàn)的表型。人類亨廷頓舞蹈癥是由于HTT基因1 號(hào)外顯子CAG 重復(fù)導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集，在基因修飾豬上出現(xiàn)了與人類似的神經(jīng)退行性特征［28］，在小鼠模型上則沒有明顯癥狀［29］；cftr基因突變小鼠肺部沒有明顯病理變化［30］，但CFTR突變的豬出現(xiàn)了典型的肺部缺陷［31］?；蛐揎椮i是不可或缺的動(dòng)物疾病模型。由于很多致病基因直接敲除致死，因此構(gòu)建能在特定時(shí)間、特定空間調(diào)控基因表達(dá)的基因修飾豬模型，將為研究人類基因功能、疾病發(fā)展機(jī)理及開發(fā)新的治療手段提供更加理想的大動(dòng)物模型。

條件性基因修飾是相對(duì)于直接基因修飾的一個(gè)概念，本文按照條件性基因修飾導(dǎo)致的結(jié)果以及研究中的主要應(yīng)用，簡(jiǎn)單地將其分為條件性基因缺失系統(tǒng)和條件性基因過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。

1 條件性基因缺失系統(tǒng)

1.1 Cre/loxP系統(tǒng)

自1998 年冷泉港會(huì)議上宣布“Cre works.”，Cre/loxP重組酶系統(tǒng)成為基因功能研究中廣泛應(yīng)用的工具。其不僅能實(shí)現(xiàn)基因的刪除、倒置，更重要的是突破了時(shí)間和空間的限制，加速了基因功能研究與基因修飾動(dòng)物模型的建立［32］。 Cre（cyclization recombinase）重組酶來(lái)源于P1噬菌體，屬于酪氨酸位點(diǎn)特異性重組酶的整合酶家族［33］，能夠特異性識(shí)別兩個(gè)長(zhǎng)度為34 bp的DNA序列并介導(dǎo)兩個(gè)位點(diǎn)之間的序列重組，被識(shí)別的特異性序列稱為loxP（locus of x-over，P1），這34 bp的序列中包含8 bp 的核心序列以及兩側(cè)倒置和回文13 bp，單個(gè)Cre重組酶分子與loxP位點(diǎn)每個(gè)回文的一半結(jié)合，形成四聚體，使兩個(gè)loxP位點(diǎn)結(jié)合在一起，目的基因兩側(cè)插有兩個(gè)同向的loxP，通過(guò)在特定時(shí)期給予Cre，就能實(shí)現(xiàn)特定階段目的基因的精確刪除［34］；當(dāng)目的基因兩側(cè)插有兩個(gè)反向的loxP，Cre能夠介導(dǎo)二者之間基因的倒置。此外，將Cre置于組織特異性啟動(dòng)子下，待基因開始表達(dá)可實(shí)現(xiàn)Cre的組織特異性表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)特定組織中目的基因特異性敲除，為研究早期胚胎發(fā)育中的重要基因尤其是一些致死基因提供了可能。小鼠憑借成熟的體外胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系，已經(jīng)產(chǎn)生多種Cre/loxP的品系［35-37］。在小鼠上利用Cre/loxP通過(guò)控制不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的敲除來(lái)研究基因功能時(shí)，需要將目的基因兩側(cè)插有l(wèi)oxP位點(diǎn)的DNA注入小鼠的胚胎干細(xì)胞，通過(guò)控制其后代與能表達(dá)Cre的小鼠交配時(shí)間即可實(shí)現(xiàn)時(shí)間性特異敲除；當(dāng)需要在特定組織或器官中特異性敲除目的基因時(shí)，只需要將控制Cre表達(dá)的組成型啟動(dòng)子換成組織特異性啟動(dòng)子，就能獲得特定組織器官敲除目的基因的小鼠。然而，條件性基因敲除小鼠的制備路線在豬上很難實(shí)現(xiàn)。首先，豬沒有成熟的體外胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系，無(wú)法通過(guò)向胚胎干細(xì)胞注射DNA 制作嵌合體來(lái)獲得后代，其次豬的妊娠期大約114 d，周期相對(duì)較長(zhǎng)，成本高昂，此外有研究發(fā)現(xiàn)Cre對(duì)于豬早期胚胎發(fā)育有一定的毒性［38］，因此，利用Cre/loxP 制備條件性基因敲除豬非常困難（圖2）。

Fig.2 Principles of Cre/loxP system and application in gene-editing pigs圖2 Cre/loxP條件性系統(tǒng)原理圖及在基因修飾豬中應(yīng)用

目前鮮有先通過(guò)制備目的基因兩側(cè)含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的基因修飾豬，再通過(guò)與表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因豬交配來(lái)獲得條件性基因修飾豬模型的報(bào)道。作為經(jīng)典且應(yīng)用廣泛的條件性基因修飾系統(tǒng)，研究人員探索了在豬上應(yīng)用Cre/loxP系統(tǒng)的可能。在豬上應(yīng)用Cre/loxP 的前提是驗(yàn)證Cre 在轉(zhuǎn)基因豬體內(nèi)的活性及功能。2009 年，Li 等［39］通過(guò)構(gòu)建loxP-stoploxP-CMV-EGFP 的豬成纖維細(xì)胞系并利用體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得了Cre功能驗(yàn)證的報(bào)告豬品系，利用表達(dá)Cre的腺病毒感染報(bào)告豬成纖維細(xì)胞后表達(dá)綠色熒光證明了Cre在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的活性。2010年，Chen等［40］通過(guò)控制給poly I/C的劑量和時(shí)間，來(lái)啟動(dòng)Mx1，構(gòu)建Mx1特異性啟動(dòng)Cre表達(dá)的基因修飾豬，推動(dòng)了以豬為模型研究發(fā)育和疾病機(jī)制的發(fā)展。TP53抑癌基因突變?cè)谂R床腫瘤患者中占比很高，為了更好地研究TP53在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，迫切需要建立TP53突變的大動(dòng)物模型。2012 年，Leuchs 等［41］構(gòu)建了Cre 介導(dǎo)重組后失活TP53和表達(dá)人TP53R175H同源的TP53R167H突變的基因修飾豬，很好地模擬Li Fraumeni 綜合癥和人群中偶發(fā)的TP53特定突變導(dǎo)致的癌癥，TP53基因修飾豬的出現(xiàn)促進(jìn)了以大動(dòng)物為模型研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展。2014 年，Li 等［42］借助TALEN 首次在豬的開放性位點(diǎn)Rosa26進(jìn)行打靶，敲入了Cre介導(dǎo)表達(dá)的報(bào)告基因EGFP，并且通過(guò)盒式置換實(shí)現(xiàn)綠色熒光變紅色熒光，同樣利用盒式置換可以實(shí)現(xiàn)任意基因的異位過(guò)表達(dá)獲得多種轉(zhuǎn)基因豬，不僅為研究大動(dòng)物譜系示蹤提供了重要工具豬模型，也為家畜育種提供了一種新的思路。

上述關(guān)于在豬上應(yīng)用Cre/loxP的研究，為了避開通過(guò)交配傳遞Cre的時(shí)間成本，大都利用病毒傳遞Cre。為了降低實(shí)驗(yàn)成本，規(guī)避早期Cre 表達(dá)帶來(lái)的毒性，研究人員嘗試在豬體內(nèi)實(shí)現(xiàn)Cre的條件性表達(dá)，例如利用Tamxifen 與雌激素受體結(jié)合的特性［43-44］，將Cre和表達(dá)含有突變配體結(jié)合的雌激素受體基因放在同一個(gè)啟動(dòng)子下，翻譯出來(lái)的Cre-ETR2 融合蛋白與細(xì)胞質(zhì)中的熱休克蛋白HSP90 形成復(fù)合物，只有外源藥物Tamxifen 存在時(shí)，才能破壞二者的結(jié)合，形成的Cre-ER-T2復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核識(shí)別loxP 位點(diǎn)，介導(dǎo)目的基因的刪除、倒置，形成了受外源藥物誘導(dǎo)的Cre-ERT2系統(tǒng)［45］，降低了實(shí)驗(yàn)成本。

上述研究表明，Cre 在成體豬體內(nèi)有活性并且可以發(fā)揮功能，并且在豬上可以利用Cre/loxP系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)單一基因的條件性表達(dá)，如果同時(shí)條件性刪除幾個(gè)基因，一種方法是可以通過(guò)對(duì)豬體細(xì)胞進(jìn)行多輪編輯，使其成為含有多個(gè)目的基因兩側(cè)插有l(wèi)oxP位點(diǎn)的細(xì)胞，再通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得成體。然而，一方面多個(gè)基因同時(shí)編輯效率及其低下，另一方面由于豬的體細(xì)胞增殖能力有限，難以承受多輪編輯和篩選。另一種方法需要分別制備不同的基因修飾豬品系，通過(guò)多次交配來(lái)獲得含有多個(gè)位點(diǎn)插有l(wèi)oxP的基因修飾豬，但是由于豬的繁殖周期長(zhǎng)，多次交配耗時(shí)費(fèi)力也不一定能獲得目的基因修飾豬（圖3）。2017 年，本課題組Wang 等［46］利用TALEN 在豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行編輯，在Rosa26位點(diǎn)利用同源重組敲入了SA-loxP-NEOPolyA-loxP2272-PolyA-tdTomato-2A-SpCas9-loxPloxP2272。當(dāng)Cre 存在時(shí)，方向相反的loxP 對(duì)發(fā)生兩次置換，最后在Rosa26位點(diǎn)只留下不成對(duì)的SAloxP-SpCas9-T2A-tdTomato-PolyA-loxP2272，通過(guò)SCNT成功獲得了Cre介導(dǎo)表達(dá)SpCas9的基因修飾豬，不僅在細(xì)胞水平驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因的SpCas9 活性和功能，還通過(guò)滴鼻慢病毒傳遞Cre 和gRNA，成功制備了第一只條件性、原發(fā)性肺癌豬模型，加速了利用大動(dòng)物模型開展癌癥診療、藥物篩選、臨床研究的進(jìn)程。

Fig.3 Combination Cre/loxP with Flp/FRT to eliminate resistance markers圖3 Cre/loxP與Flp/FRT聯(lián)合應(yīng)用去除抗性標(biāo)記

1.2 Flp/FRT系統(tǒng)

Flp 整合酶來(lái)源于釀酒酵母，與Cre 同屬一個(gè)整合酶家族，有著與Cre 類似的DNA 序列識(shí)別和重組機(jī)制，F(xiàn)lp 識(shí)別的DNA 序列與Cre 識(shí)別的loxP序列結(jié)構(gòu)相同，也是兩側(cè)13 bp 的回文序列和8 bp的核心序列，但是具體的堿基組成不同，靶序列兩側(cè)FRT 的方向相同時(shí)介導(dǎo)靶序列的刪除，方向相反時(shí)介導(dǎo)靶序列倒置［47-48］。最開始發(fā)現(xiàn)Flp發(fā)揮作用的最適溫度是30℃，在一定程度上限制了其在動(dòng)物模型中的應(yīng)用，后面經(jīng)過(guò)優(yōu)化后其最適溫度為37℃［49］。由于Cre/loxP 系統(tǒng)制備基因修飾動(dòng)物效率高，應(yīng)用成熟且廣泛，目前在基因修飾豬上，F(xiàn)lp/FRT能實(shí)現(xiàn)的，經(jīng)典的Cre/loxP系統(tǒng)都能實(shí)現(xiàn)，因此很少有單獨(dú)應(yīng)用Flp/FRT建立的基因修飾豬報(bào)道，但是在篩選基因修飾細(xì)胞時(shí)，常常與Cre/loxP系統(tǒng)聯(lián)用，在獲得陽(yáng)性細(xì)胞后刪除抗性篩選標(biāo)記，提高了基因修飾動(dòng)物的安全性（圖3）。2021 年，本課題組聯(lián)用Cre/loxP 和Flp/FRT，創(chuàng)建出精巧的條件性基因表達(dá)關(guān)-開-關(guān)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)，將此系統(tǒng)插入到靶基因的編碼外顯子中，在Cre介導(dǎo)下，插在倒置的轉(zhuǎn)錄終止序列兩側(cè)的反向loxP 對(duì)發(fā)生置換，倒置的轉(zhuǎn)錄終止序列正置，靶基因表達(dá)關(guān)閉；然后在Flp 介導(dǎo)下，兩側(cè)loxP 外圍同向的Frt 對(duì)發(fā)生刪除，轉(zhuǎn)錄終止序列被刪除，靶基因恢復(fù)表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)的可逆調(diào)控。這兩種重組酶系統(tǒng)的聯(lián)用應(yīng)用到研究腫瘤、發(fā)育等相關(guān)基因的功能，將更加全面的闡釋基因功能，促進(jìn)靶向藥物研發(fā)，加速臨床轉(zhuǎn)化（相關(guān)結(jié)果投稿中）。

2 條件性基因過(guò)表達(dá)系統(tǒng)

2.1 組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

TALEN、ZFN、Cas9 等核酸酶出現(xiàn)之前，自然發(fā)生DNA 雙鏈斷裂和定點(diǎn)敲入的效率極低，為了在豬上實(shí)現(xiàn)組織特異性基因表達(dá)，通常采用的技術(shù)路線是將組織特異性表達(dá)基因的啟動(dòng)子利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增下來(lái)和需要表達(dá)的外源基因放在一起，或者人工設(shè)計(jì)啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)組織特異性外源基因的表達(dá)。核酸酶出現(xiàn)之后，不僅大大提高了DNA 雙鏈斷裂發(fā)生的概率，而且還能實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因敲入。利用人工核酸酶實(shí)現(xiàn)組織特異性表達(dá)，只需要打靶組織特異性表達(dá)基因的終止密碼子附近，使其發(fā)生DNA 雙鏈斷裂，同時(shí)提供含有斷裂位點(diǎn)上下游同源臂、外源基因的同源重組模板，這樣就能真正實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因啟動(dòng)子介導(dǎo)的外源基因過(guò)表達(dá)。2016 年，Lai 等［50］利 用CRISPR/Cas9 在 豬Oct4最后一個(gè)外顯子的終止密碼子進(jìn)行打靶，同時(shí)提供含有5'同源臂、2A-Tdtomato 和3'同源臂的外源模板，利用同源重組成功獲得了紅色熒光指示Oct4表達(dá)的豬成纖維細(xì)胞，并通過(guò)SCNT獲得了健康的仔豬，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞多能性狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。2021 年，Du 等［51］利用CRISPR/Cas9 在豬ACE2的內(nèi)源性啟動(dòng)子到1號(hào)外顯子前進(jìn)行打靶，同時(shí)提供含有5'同源臂-人ACE2-3'同源臂的外源模板，利用同源重組得到了表達(dá)人ACE2受體的豬成纖維細(xì)胞，并通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)成功獲得了基因修飾豬，為新型冠狀病毒檢測(cè)、治療、藥物研發(fā)提供了一種新的大動(dòng)物模型。目前，大都采用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的定點(diǎn)同源重組來(lái)獲得基因修飾細(xì)胞，再通過(guò)體細(xì)胞核移植技術(shù)得到基因修飾豬的技術(shù)路線。

2.2 Tet-off/on調(diào)控系統(tǒng)

四環(huán)素（tetracyclines）與細(xì)菌30S核糖體亞基結(jié)合，是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成和生長(zhǎng)的抗生素，在革蘭氏陰性菌的耐藥性研究中發(fā)現(xiàn)，膜蛋白TetA介導(dǎo)的四環(huán)素流出是造成耐藥的主要原因，而TetA 的表達(dá)受四環(huán)素反應(yīng)抑制蛋白TetR 的調(diào)控，然而在Tn10編碼的Tet操縱子中，tetA和tetR基因的位置相反，它們的表達(dá)受同一調(diào)控區(qū)域但相互獨(dú)立的啟動(dòng)子PA 和PR 調(diào)控，TetR 蛋白形成二聚體，識(shí)別和結(jié)合tetO元件，從而抑制PA和PR啟動(dòng)子的活性，使tetA和tetR不表達(dá)［52-54］。1992年，Gossen等［55］描述了利用Tet操縱子的tetR和tetO的特性來(lái)開發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中控制基因表達(dá)的Tet-off調(diào)控機(jī)制：?jiǎn)渭冃园捳畈《綱P16蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域與tetR融合表達(dá)，使其成為受四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活因子（tTA），7 個(gè)tetO 融合進(jìn)真核啟動(dòng)子的TATA 盒；在沒有四環(huán)素時(shí)，TATA 盒與tetO 結(jié)合，激活下游基因表達(dá)；四環(huán)素存在時(shí)，tTA 中的tetR構(gòu)象改變，阻止tetO 結(jié)合，基因表達(dá)關(guān)閉［56-57］（圖4a）。利用這一系統(tǒng)研究目的基因功能時(shí)需要持續(xù)加藥，而激活基因表達(dá)時(shí)又需要完全移除四環(huán)素，雖然這在細(xì)胞水平很容易操作，但在成體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中難以控制，因此Tet-off系統(tǒng)不適合制備動(dòng)物模型。

1995年，Gossen等［58］篩選到以相反方式發(fā)揮作用的rTetR，從而得到了四環(huán)素存在時(shí)，目的基因表達(dá)；撤藥后，基因表達(dá)逐漸關(guān)閉的Tet-on 系統(tǒng)，最初的Tet-on系統(tǒng)對(duì)四環(huán)素不敏感，需要較高劑量的誘導(dǎo)，通過(guò)不斷地突變篩選才得到正常劑量就能實(shí)現(xiàn)調(diào)控目的基因表達(dá)（圖4b）。2012 年，Klymiuk 等［59］首次將Tet-on 系統(tǒng)應(yīng)用到大動(dòng)物模型豬上，通過(guò)第一輪細(xì)胞篩選獲得了表達(dá)rtTA 的陽(yáng)性克隆并獲得了基因修飾豬，分離出的細(xì)胞進(jìn)行二次篩選，經(jīng)過(guò)兩輪篩選分別建立了受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)RANKL、CTLA-4Ig的基因修飾豬模型，解決了異種器官移植中組成型表達(dá)某些基因?qū)е鹿w過(guò)度免疫缺陷難以存活的情況，為異種器官移植和再生醫(yī)學(xué)中供體的基因修飾提供了一種新思路。2012年，Jiang等［60］通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染Tet-on元件構(gòu)建了受四環(huán)素誘導(dǎo)穩(wěn)定表達(dá)豬生長(zhǎng)激素蛋白的豬成纖維細(xì)胞系，與組成型表達(dá)生長(zhǎng)激素的細(xì)胞系相比，pGH mRNA 水平提高了10 倍，利用該系統(tǒng)結(jié)合體細(xì)胞核移植技術(shù)對(duì)產(chǎn)生健康高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因豬具有重要指導(dǎo)意義。2014 年，Ruan 等［61］先獲得rtTA 置于豬內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子Icam-2下游的細(xì)胞，在此細(xì)胞基礎(chǔ)上再轉(zhuǎn)染Tre 啟動(dòng)pp65RHD-IRESEGFP 表達(dá)的質(zhì)粒，同樣經(jīng)過(guò)兩輪篩選獲得了條件性表達(dá)pp65RHD 的豬成纖維細(xì)胞系，解決了豬異種器官移植中內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的問題，進(jìn)一步推動(dòng)了條件性基因表達(dá)系統(tǒng)在異種器官移植領(lǐng)域的應(yīng)用。同年，以Tet-on 為基礎(chǔ)，受四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因豬誕生［62］。2021年，本課題組借助Cpf1 分別在豬的開放性位點(diǎn)Rosa26和Hipp11定點(diǎn)敲 除rtTA 和Tre-attP-Tdtomato-attP 等Tet-on 系統(tǒng)的元件，并將篩選到的陽(yáng)性細(xì)胞作為供體通過(guò)SCNT成功獲得受Dox誘導(dǎo)表達(dá)紅色熒光豬模型；在此基礎(chǔ)上，利用僅在Rosa26位點(diǎn)含有rtTA 元件的豬胎兒成纖維細(xì)胞再分別將原癌基因KRASG12D和基因編輯所需要的核酸酶Cas9 定點(diǎn)敲入Hipp11位點(diǎn)，通過(guò)SCNT 也分別獲得了Dox 誘導(dǎo)表達(dá)KRASG12D和Cas9的模型豬，并且在誘導(dǎo)KRASG12D表達(dá)后，模型豬上出現(xiàn)腫瘤表型［63］。

Fig.4 Schematic of inducible system Tet-off and Tet-on圖4 Tet/off與Tet/on可誘導(dǎo)系統(tǒng)原理圖

2.3 PhiC31調(diào)控系統(tǒng)

PhiC31 整合酶是一種位點(diǎn)特異性重組酶，來(lái)源于鏈霉菌屬噬菌體，屬于絲氨酸催化的重組酶家族，通過(guò)識(shí)別宿主基因組上兩個(gè)大約30 bp 的序列——attB 和attP，來(lái)介導(dǎo)兩個(gè)位點(diǎn)之間序列的精確整合，整合后產(chǎn)生兩個(gè)雜交位點(diǎn)，稱為attL 和attR，不能再被PhiC31 識(shí)別，因此PhiC31 介導(dǎo)的整合是單向的［64-66］（圖5）。相比較Cre 介導(dǎo)的整合，重組后識(shí)別位點(diǎn)仍然存在，可能會(huì)發(fā)生二次重組，因此PhiC31更適合基因整合，Cre更適合刪除基因。研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基因組上存在的天然attP與含有attB的質(zhì)粒組合PhiC31才能實(shí)現(xiàn)高效的重組整合；反之，基因組上的天然attB 與含有attP 質(zhì)粒組合，無(wú)法實(shí)現(xiàn)［67］。真核生物基因組中存在的天然attP序列稱為偽attP序列，通過(guò)在外源模板上人為添加attB，在PhiC31 的介導(dǎo)下就能實(shí)現(xiàn)精確地整合，因此PhiC31 整合酶系統(tǒng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的有力工具［68］。2013 年，Bi 等［69］首次在豬的PK15 細(xì)胞中應(yīng)用這一系統(tǒng)，證明了豬基因組中天然存在的偽attP序列功能性，為定向豬基因組工程開辟了一條新途徑。2017 年，Park 等［70］首次利用顯微注射將Cas9 和靶向目的基因的sgRNA 注射到豬的受精卵中以獲得目的基因敲除的動(dòng)物，此外他們還提供含有attP的外源模板，獲得COL1A位點(diǎn)含有attP 的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并在細(xì)胞水平驗(yàn)證在給予含有attB-EGFP-PhiC31 的外源模板時(shí)，能實(shí)現(xiàn)EGFP 的位點(diǎn)特異性整合。2018 年，Nunes Dos Santos 等［71］利用Cas9 和靶向豬血栓調(diào)節(jié)蛋白（pTHBD）外顯子上下游的兩條sgRNA 刪除豬基因組上原有的pTHBD，同時(shí)提供含有sgRNA 切割位置同源臂、attP-hTHBD-attB、抗性篩選標(biāo)記的外源模板，發(fā)生同源重組后的陽(yáng)性細(xì)胞，在PhiC31、同源重組的介導(dǎo)下，在豬基因組上實(shí)現(xiàn)豬內(nèi)源性pTHBD 啟動(dòng)子啟動(dòng)人血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)，由于豬血栓調(diào)節(jié)蛋白無(wú)法調(diào)節(jié)人的血栓凝結(jié)，這一研究結(jié)果將直接促進(jìn)豬作為供體在異種器官移植領(lǐng)域的研究。此外，利用這一策略，可以高效快速構(gòu)建表達(dá)人基因的豬細(xì)胞系，相比較與病毒介導(dǎo)的隨機(jī)整合，PhiC31 整合酶系統(tǒng)精確度更高，對(duì)宿主也更安全，但目前在基因修飾豬中應(yīng)用較少。

Fig.5 Gene recombination is mediated by PhiC31圖5 PhiC31介導(dǎo)基因重組

3 展望

在制備條件性基因修飾動(dòng)物模型時(shí)有很多選擇，但研究表明并不是所有的系統(tǒng)都是完美的。例如，在利用Cre/loxP 或Flp/FRT 時(shí)有一個(gè)預(yù)先的假設(shè)是動(dòng)物體內(nèi)不存在天然的loxP 位點(diǎn)，然而在研究中發(fā)現(xiàn)基因組中存在天然的偽序列［72-73］，這些偽序列在體外實(shí)驗(yàn)中能夠在Cre 介導(dǎo)下發(fā)生重組，盡管小鼠上有大量的Cre/loxP品系沒有顯示出這一問題，但由于Cre/loxP基因修飾豬數(shù)量較少，難以統(tǒng)計(jì)。此外，通過(guò)組織特異性啟動(dòng)子表達(dá)Cre 時(shí)，最常見的問題是啟動(dòng)子不特異，造成Cre的泄漏表達(dá)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)空間特異性表達(dá)。盡管可能存在一些問題，但是仍然是小鼠上主要應(yīng)用的條件性系統(tǒng)，據(jù)此建立了多種小鼠品系。在豬上應(yīng)用條件性系統(tǒng)時(shí)可以適當(dāng)參考小鼠上選用的啟動(dòng)子以及打靶外顯子位置來(lái)獲得高質(zhì)量受調(diào)控的條件性基因修飾豬。同樣的，Tet-on系統(tǒng)在實(shí)際動(dòng)物模型中也存在一些問題。在構(gòu)建的Dox 誘導(dǎo)Cas9 表達(dá)的基因修飾豬模型中發(fā)現(xiàn)，即便是全身表達(dá)的啟動(dòng)子，Cas9 在各個(gè)器官中的表達(dá)量也不盡相同。此外有研究發(fā)現(xiàn)，Tet-on中的rtTA元件能引起猴子中某些個(gè)體的免疫反應(yīng)［74］，這一點(diǎn)在小鼠中未曾報(bào)道［75-76］，也提示大動(dòng)物模型與嚙齒類動(dòng)物之間的差異性。

在豬上應(yīng)用條件性基因修飾系統(tǒng)，從最初只是在豬的基因組中放入單一條件性系統(tǒng)所需要的元件來(lái)研究特定基因的功能，發(fā)展到現(xiàn)在，不僅實(shí)現(xiàn)了多個(gè)條件性系統(tǒng)聯(lián)用來(lái)調(diào)控基因表達(dá)“關(guān)-開-關(guān)”，而且將條件性系統(tǒng)與人工核酸酶聯(lián)用，獲得了條件性表達(dá)人工核酸酶的工具豬。為了構(gòu)建一個(gè)適用于多種基因編輯場(chǎng)景的工具豬模型，本實(shí)驗(yàn)室利用人工核酸酶Cpf1 介導(dǎo)的雙鏈斷裂，成功將rtTA 和Tre3G-SpCas9-2A-tdTomato分別與豬基因組上的兩個(gè)開放性位點(diǎn)Rosa26和Hipp11同源重組，利用體細(xì)胞核移植技術(shù)，成功獲得了受四環(huán)素誘導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)SpCas9 并且能穩(wěn)定遺傳的基因修飾豬品系。通過(guò)飼料添加及腹腔注射四環(huán)素，不僅實(shí)現(xiàn)了Cas9 在多個(gè)器官中的穩(wěn)定高效表達(dá)，還在細(xì)胞水平驗(yàn)證了受四環(huán)素調(diào)控的Cas9活性和功能；此外，通過(guò)向該基因修飾豬傳遞靶向抑癌基因TP53、LKB1敲除的sgRNA和過(guò)表達(dá)原癌基因KRASG12D的腺相關(guān)病毒，成功獲得了轉(zhuǎn)移性胰腺癌豬模型。更重要的是，在此模型豬細(xì)胞的基礎(chǔ)上，僅需要一步基因修飾引入靶向不同基因的sgRNA，就能實(shí)現(xiàn)任一基因和多基因的組織特異性敲除，直擊Cre/loxP系統(tǒng)在大動(dòng)物模型應(yīng)用中的痛點(diǎn)，建立一套更適用于大動(dòng)物的模型的時(shí)空調(diào)控系統(tǒng)，將極大地促進(jìn)豬作為一種大動(dòng)物模型在再生醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)中的應(yīng)用，同時(shí)也為非人靈長(zhǎng)類等大動(dòng)物模型條件性系統(tǒng)的建立提示了一種新的路線（相關(guān)結(jié)果在投稿中）。

除了研究基因功能、建立基因突變驅(qū)動(dòng)的疾病模型，條件性基因修飾系統(tǒng)在豬的異種器官移植領(lǐng)域也能解決直接敲除導(dǎo)致的供體豬過(guò)度免疫缺陷難以存活的問題，促進(jìn)異種器官移植領(lǐng)域的發(fā)展。盡管人工核酸酶的發(fā)展極大地提高了獲得含有條件性基因修飾元件的豬體細(xì)胞，但目前，哺乳動(dòng)物克隆胚胎早期發(fā)育仍存在很多缺陷，結(jié)合表觀遺傳修飾敲除XIST 的體細(xì)胞通過(guò)SCNT 獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出生率也只有1%～2%［77］，這些都制約著基因修飾動(dòng)物的制備。因此，條件性基因修飾豬的制備目的不能只局限在研究單一基因功能，而是要致力于建立適用多種基因編輯的通用性工具豬，充分發(fā)揮每一頭基因修飾豬的應(yīng)用價(jià)值，真正實(shí)現(xiàn)一豬多能、一豬多用（圖6）。基因修飾豬將憑借其與人類更多的相似性、飼養(yǎng)成本相對(duì)較低，成為臨床前優(yōu)于嚙齒類動(dòng)物、廉于非人靈長(zhǎng)類的、不可或缺的高性價(jià)比大動(dòng)物模型。

Fig.6 Application of conditional gene modification in pigs圖6 條件性基因修飾豬的應(yīng)用