范俐，徐曉斌，許禎毅，陳珊珊

（武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 南平 354300）

山茶油具有抗氧化活性作用，預(yù)防心血管硬化、降血壓、降血脂、抗菌，抗紫外線，防止曬斑及減輕皺紋等功效[1]。

油茶多酚是油茶籽中最重要的次生代謝產(chǎn)物之一，與油茶籽油的品質(zhì)、色澤和氧化穩(wěn)定性等緊密相關(guān)，具有抗氧化活性，也與保健功效密切相關(guān)[2-3]。山茶油中多酚物質(zhì)種類、含量與其種質(zhì)資源[4]、氣候條件[5]、制油工藝[6]、精制步驟[7]等密切相關(guān)。多酚物質(zhì)由于極性較強(qiáng)，大部分殘留在餅粕中，僅部分溶解或分散在油脂中，籍一定的分配系數(shù)存在于油脂中，或以極性較弱的復(fù)雜酚類溶解于油脂中[8]。近年來，由于大眾認(rèn)同山茶油保健功能，市售的山茶油品牌越來越多，經(jīng)過精練加工的商品油，多酚含量及抗氧化性是否降低，針對(duì)這一問題國內(nèi)外均未見報(bào)道。

選取超市中金龍魚油茶籽油、沈郎鄉(xiāng)山茶籽油為樣品，采用固相萃取提取和福林酚法測定多酚含量；采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率、羥自由基清除率和還原力試驗(yàn)測定山茶油多酚提取物的抗氧化活性；建立LC-MS/MS同時(shí)檢測23種酚類化合物方法，檢測山茶油中酚類化合物組分，為山茶油摻偽鑒別技術(shù)研究，開發(fā)更高品質(zhì)的山茶油產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金龍魚油茶籽油、沈郎鄉(xiāng)山茶籽油：永輝超市選購；壓榨山茶毛油：浙江省龍泉下圩山茶油種植場提供；二醇基（diol）固相萃取柱。

甲醇：色譜純，上海展云化工有限公司；正己烷：色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸：分析純AR，三明市三圓化學(xué)試劑有限公司；Trolox：生化試劑BR，上海展云化工有限公司；三氯化鐵：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；福林酚、無水碳酸鈉、DPPH、沒食子酸、硫酸亞鐵銨、過氧化氫、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、三氯乙酸、鄰二氮菲、鐵氰化鉀：分析純，上海展云化工有限公司；表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、兒茶酸、表兒茶素、蘆丁、3,4-亞甲二氧基苯酚、異鼠李素、酪醇、高藜蘆酸、鄰苯二甲酸、綠原酸、槲皮素、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、羥基酪醇、羥基酪醇醋酸酯、肉桂酸、阿魏酸、芥子酸、松脂酚、芹菜素、木犀草素等標(biāo)準(zhǔn)品：HPLC級(jí)，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIEX QTRAP?4500液質(zhì)聯(lián)用儀：美國AB Sciex公司；可見分光光度計(jì)：MAPADA V-1100D，上海美普達(dá)儀器有限公司；固相萃取裝置：OVP-30，冠森生物科技有限公司；氮吹儀：UGC-12M，中國優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：Microfuge 20R，Beckman Coulter公司；渦旋振蕩器：Vortex-Genie 2，美國Scientific Industries公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZHWY-103D，上海智城分析儀器制造有限公司；高速離心機(jī)：HC-2514，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；超級(jí)恒溫水浴鍋：HH-601，寶曼科學(xué)儀器設(shè)備有限公司；電子天平：BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 山茶油中多酚的萃取 山茶油中多酚的萃取采用二醇基固柱萃取法。

1.3.2 山茶油中多酚含量的測定 采用福林酚法測定山茶油中多酚含量。以沒食子酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1mL樣品溶液，在750 nm波長條件下測定吸光度，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總多酚含量，取平均值。計(jì)算公式如下

式中：X為每千克植物油中多酚的含量（mg）；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得多酚濃度（μg/mL）；D為樣品定容后的稀釋倍數(shù)；2為洗脫液蒸干后定容體積（mL）；m為試樣質(zhì)量（g）。

1.3.3 DPPH自由基清除能力測定

將樣品多酚萃取液稀釋至不同濃度，分別取1mL溶液依次添加甲醇、DPPH溶液1mL，充分混勻后避光反應(yīng)0.5 h，于517 nm波長處檢測OD值，橫坐標(biāo)為多酚濃度、縱坐標(biāo)為DPPH清除率（%），平行測定3次，計(jì)算DPPH自由基清除率，以維生素E（VE）作為對(duì)照。

式中：S為DPPH自由基清除率；Ai為樣品吸光值；Aj為甲醇水代替DPPH溶液的吸光值；A0為甲醇水代替樣品的吸光值。

1.3.4 羥自由基清除能力測定

分別配制同濃度的山茶油多酚溶液。取0.3 mL 7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液于試管中，依次加入1 mL pH值為8.2的Tris-HCL溶液和1mL蒸餾水，充分混勻后，加入0.3 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵銨溶液，混勻后，加入1 mL 7.5 mmol/L H2O2溶液，于37℃恒溫水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)60 min后，在510 nm快速測其吸光值，所得的數(shù)據(jù)為損傷管的吸光值A(chǔ)2。未損傷管以1 mL蒸餾水代替損傷管中1 mL 7.5 mmol/L H2O2溶液，操作方法同損傷管，可測得510 nm未損傷管的吸光值A(chǔ)1。樣品管以1 mL樣品代替損傷管中的1 mL蒸餾水，操作方法同損傷管，可測得510 nm樣品管的吸光值A(chǔ)3，平行測定3次，以維生素E(VE)溶液為對(duì)照組計(jì)算羥自由基的清除率。

式中：M為羥自由基的清除率；A1為未損傷管的吸光值；A2為損傷管的吸光值；A3為樣品管的吸光值。

1.3.5 還原能力測定

采用普魯士蘭法測定還原能力[15]。在700 nm測定吸光值，平行測定3次，取平均值，吸光值越大則還原能力越強(qiáng)。

1.3.6 多酚化合物L(fēng)C-MS/MS定量分析

1.3.6.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODSⅢ2.0 mm×75 mm；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）；柱溫箱：40℃；流速：0.300mL/min；進(jìn)樣量：5.00μL；梯度洗脫，流動(dòng)相A的比例：0～0.3 min，80%；0.3～2.0 min，80%；2.0～4.0min，10%；4.0～4.2 min，10%；4.2～6.0 min，80%；6.0min，80%。

1.3.6.2 質(zhì)譜條件

掃描模式：負(fù)離子；氣簾氣（CUR）：30 psi（1 psi=6.895 kpa）；碰撞氣（CAD）：Medium；離子噴霧電壓（IS）：-4500 V（負(fù)離子）；離子源溫度（TEM）：550℃。

1.3.6.3 酚類化合物的線性關(guān)系

取標(biāo)準(zhǔn)品先配制儲(chǔ)備液適量，再用甲醇稀釋配制系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.3.6.1與1.3.6.2”項(xiàng)條件進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 23種多酚組分的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationship of 23 polyphenols components

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 山茶油中總多酚含量的測定

2.1.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

多酚含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.016 19x+0.008 71，R2=0.995 4，具有較好的線性關(guān)系。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線（沒食子酸當(dāng)量計(jì)）Fig.1 Polyphenol standard curve(gallic acid equivalent meter)

2.1.2 兩種商品山茶油中總多酚含量

由表2可知，兩種商品山茶油中，每千克金龍魚茶籽油總多酚（以沒食子酸當(dāng)量計(jì)）含量為（6.88±0.13）mg，每千克沈郎鄉(xiāng)山茶籽油為（8.60±0.06）mg，沈郎鄉(xiāng)高于金龍魚的25%，兩者均低于壓榨山茶毛油（26.07±0.47）mg，說明兩種商品山茶油多酚含量仍有提高空間，需要進(jìn)一步改進(jìn)加工工藝。

表2 兩種市售山茶油中總多酚含量Tab.2 Total polyphenols content in two kinds of commercial camellia oils

2.2 抗氧化性活性測定結(jié)果

2.2.1 DPPH自由基清除能力

根據(jù)圖2可知，DPPH自由基清除率隨著山茶油多酚濃度的增大而不斷提高。沈郎鄉(xiāng)山茶油多酚、金龍魚山茶油多酚、維生素E(VE)的DPPH自由基消除率的IC50分別為1.647、1.722、3.195 mg/L，對(duì)DPPH自由基清除能力大小依次為：維生素E(VE)＞沈郎鄉(xiāng)＞金龍魚。

圖2 兩種市售山茶油中多酚的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging rate of polyphenols in two kinds of commercial camellia oils

2.2.2 羥自由基清除能力

根據(jù)圖3可知，羥自由基清除率隨著山茶油多酚濃度的增大而不斷提高，沈郎鄉(xiāng)山茶油中多酚的羥自由基清除率接近于金龍魚山茶油。維生素E(VE)、沈郎鄉(xiāng)山茶油多酚和金龍魚山茶油多酚羥自由基IC50分別為2.347、1.030、1.161 mg/L，對(duì)羥自由基清除能力大小依次為：沈郎鄉(xiāng)＞金龍魚＞維生素E(VE)。

圖3 兩種商品山茶油中多酚的羥自由基消除Fig.3 Hydroxyl radical elimination rates of polyphenols in two commercially available camellia oils

2.2.3 還原力分析

根據(jù)圖4可知，還原力隨著山茶油多酚濃度的增大而不斷提高。維生素E(VE)、沈郎鄉(xiāng)山茶油多酚和金龍魚山茶油多酚的還原力EC0.2（吸光值為0.2時(shí)的多酚有效濃度）分別為3.45、3.27、22.38 mg/L，還原力大小依次為：沈郎鄉(xiāng)＞維生素E(VE)＞金龍魚。

圖4 兩種商品山茶油中多酚的還原力Fig.4 Reducing power of polyphenols in two kinds of commercial camellia oils

2.2.4 多酚組分的分析

根據(jù)表3，兩種商品山茶油共檢測出10種酚類化合物，分別為：表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、蘆丁、3,4-亞甲二氧基苯酚、高藜蘆酸、松脂酚、鄰苯二甲酸、綠原酸、香草、酸酪醇；其中金龍魚山茶油未檢出香草酸，而沈郎鄉(xiāng)山茶油未檢出酪醇。每千克沈郎鄉(xiāng)山茶油中含量較多的酚類化合物分別為：松脂酚（1 888.30±136.13）μg、高藜蘆酸（253.92±1.00）μg、3,4-亞甲二氧基苯酚（115.08±1.47）μg；每千克金龍魚山茶油中含量較多的酚類化合物分別為：高藜蘆酸（186.06±0.28）μg；3,4-亞甲二氧基苯酚（107.14±1.29）μg。

表3 兩種商品山茶油中多酚組分定量分析（n=3）Tab.3 Quantitative analysis of polyphenols components in two kinds of commercial camellia oils(n=3)

兩種山茶油均未檢測出兒茶酸、表兒茶素、異鼠李素、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、羥基酪醇、羥基酪醇醋酸酯、肉桂酸、阿魏酸、芥子酸、芹菜素、木犀草素、槲皮素等13種酚類化合物。

3 結(jié)論

每千克沈郎鄉(xiāng)山茶籽油、每千克金龍魚油茶籽油中總多酚分別為（8.60±0.06）、（6.44±0.31）mg，均低于壓榨毛油（26.07±0.47）mg，商品山茶油多酚含量仍有提高空間。

沈郎鄉(xiāng)山茶油多酚的DPPH自由基IC50、羥自由基IC50、還原力EC0.2高于金龍魚山茶油，兩者羥自由基清除力均高于維生素E，說明兩種山茶油中多酚有較強(qiáng)抗氧化活性，對(duì)油脂氧化穩(wěn)定和貨架期有重要的意義。

LC-MS/MS同時(shí)檢測兩種商品山茶油中23種酚類組分，檢出10種：酚酸類6種（3,4-亞甲二氧基苯酚、高藜蘆酸、鄰苯二甲酸、綠原酸、香草酸、酪醇）兒茶素類2種（表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯）、木脂素類1種（松脂酚）、黃酮類1種（蘆?。?/p>