楊國柱，阮世納，潘翠萍，鐘佳賢，曹祺，李青南

1 廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州 510006；2 廣東安諾藥業(yè)股份有限公司

股骨頭壞死是由于不同的病因破壞股骨頭的血液循環(huán)，造成骨細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞壞死的病理過程，最終導(dǎo)致股骨頭塌陷的一種疾病。長期使用糖皮質(zhì)激素會造成股骨頭供血供氧不足，軟骨下骨明顯變形，股骨頭塌陷和骨細(xì)胞壞死等，形成激素性股骨頭壞死（ONFH）。ONFH 占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)病率的50%以上［1］。ONFH 的主要病理表現(xiàn)為骨量減少、軟骨破壞、全身機(jī)能減退、功能障礙等，致殘率極高。對于ONFH 的治療，目前西醫(yī)尚無特效藥物，中醫(yī)藥治療有其獨特優(yōu)勢。ONFH 的中醫(yī)常見證型有肝腎虧虛證、痰瘀阻絡(luò)證、氣滯血瘀證等，應(yīng)用活血化瘀、補(bǔ)腎健骨、消腫止痛、扶正固本的中藥，能夠有效治療ONFH［2］。護(hù)骨膠囊是從制何首烏、淫羊藿、熟地黃、龜甲、巴戟天、杜仲、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、當(dāng)歸、山藥中提取有效成分，加工而成的中藥復(fù)方制劑，具有補(bǔ)肝腎、益精血、調(diào)理陰陽的功效。動物實驗表明，護(hù)骨膠囊能夠促進(jìn)成骨，改善骨代謝［3-4］。臨床研究表明，護(hù)骨膠囊可以有效防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松和激素性骨質(zhì)疏松癥［5-6］，但在股骨頭壞死的應(yīng)用上尚屬空白。研究顯示，骨質(zhì)疏松與股骨頭壞死不僅具有相同的陽虛血瘀的病機(jī)，而且還具有某些相同的關(guān)鍵靶點和信號通路［7］。因此推測，護(hù)骨膠囊對ONFH 可能具有一定的治療作用。2019年1 月—2021 年6 月，我們采用脂多糖和甲強(qiáng)龍聯(lián)合注射誘導(dǎo)制作ONFH 大鼠模型，觀察護(hù)骨膠囊對壞死股骨頭壞死的改善作用，為開發(fā)護(hù)骨膠囊的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級SD 大鼠56 只，雌雄不限，8 周齡，體質(zhì)量（200 ± 20）g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)動物實驗中心。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜12 h/12 h 循環(huán)照明，環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%。大鼠自由飲水，飼喂普通維持飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周用于實驗。本實驗通過廣東藥科大學(xué)動物實驗倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物及試劑 護(hù)骨膠囊（廣東安諾藥業(yè)股份有限公司），甲潑尼龍琥珀酸鈉（簡稱甲強(qiáng)龍，美國輝瑞），脂多糖（上海碧云天），注射用青霉素鈉（哈藥集團(tuán)）。水合氯醛（國藥集團(tuán)），二甲苯、無水乙醇、氯化鈉、甲酸、甲醛（天津大茂），甲苯胺藍(lán)染液（北京雷根）。

1.1.3 主要儀器 石蠟包埋機(jī)（德國萊卡，型號EG1160）；組織切片機(jī)（德國萊卡，型號RM2255）；Bioquant-Osteo 骨形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（美國BIOQUANT）。

1.2 動物分組與模型制作 將56 只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組4只和模型組52只。模型組于造模第1 周先腹腔注射脂多糖（LPS）20 μg/kg，連續(xù)2次，給藥相隔24 h；完成LPS注射24 h后，經(jīng)臀肌注射大劑量甲強(qiáng)龍40 mg/kg，連續(xù)3 次，給藥間隔24 h。造模第2～6 周，甲強(qiáng)龍用量減至維持劑量20 mg/kg，每周1次，連續(xù)5周。每次注射甲強(qiáng)龍后，臀肌注射青霉素鈉8 萬U。藥物干預(yù)過程中懸吊飲水，即將水瓶懸吊在鼠籠上方，使大鼠飲水時盡可能提起雙前肢，以模擬人的雙下肢負(fù)重?？瞻讓φ战M在此過程中腹腔注射等量生理鹽水。6 周后，從模型組中隨機(jī)抽取4 只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取股骨頭組織脫鈣處理，光鏡下觀察股骨頭形態(tài)，以出現(xiàn)骨壞死、骨小梁斷裂和骨髓細(xì)胞脂肪化為造模成功。

1.3 干預(yù)處理 造模成功后，將模型組剩余48 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成3 組，模型對照組、護(hù)骨膠囊基礎(chǔ)劑量組和護(hù)骨膠囊雙倍劑量組。以體質(zhì)量60 kg 的成年人每日服用護(hù)骨膠囊的劑量進(jìn)行等效換算，護(hù)骨膠囊基礎(chǔ)劑量組給予護(hù)骨膠囊0.486 g/（kg·d）灌胃，雙倍劑量組給予護(hù)骨膠囊0.972 g/（kg·d）灌 胃；模 型 對 照 組 給 予10 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，每天1 次。大鼠均自由進(jìn)食和飲水。

1.4 一般狀況觀察 觀察各組大鼠的皮毛、飲食、活動情況。稱取大鼠體質(zhì)量，造模期間每周1次、藥物干預(yù)期間每天1次，計算大鼠體質(zhì)量增長率。

1.5 血清骨代謝指標(biāo)檢測 空白對照組于藥物干預(yù)前全部處死，其他三組分別于給藥42 d 和給藥60 d 后各取8 只大鼠，空腹12 h 后給予10%水合氯醛10 mL/kg 進(jìn)行腹腔麻醉。心臟取血5 mL，3000 r/min 離心，取上層血清，使用大鼠血清酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測骨形成標(biāo)志物骨特異性堿性磷酸酶（BALP）、Ⅰ型前膠原氨基末端肽（PINP）和骨吸收標(biāo)志物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP5b）、Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽（CTX）水平。

1.6 股骨形態(tài)學(xué)觀察 大鼠取血后，取出右側(cè)股骨頭，暴露部分骨髓腔，加入4%甲醛溶液固定24 h，10%乙二胺四乙酸脫鈣2 個月。梯度乙醇脫水，矢狀面切開，石蠟包埋、切片，甲苯胺藍(lán)染色。應(yīng)用Bioquant-Osteo 骨形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件，觀察股骨頭關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨區(qū)和生長板軟骨的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以-x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況比較 造模期間，空白對照組反應(yīng)靈敏，多動，進(jìn)食佳，皮毛光澤，體質(zhì)量增長規(guī)律；模型組反應(yīng)略有遲鈍，活動倦怠，進(jìn)食正常，皮毛較松。藥物干預(yù)期間，模型對照組神態(tài)、活動無明顯好轉(zhuǎn)；護(hù)骨膠囊基礎(chǔ)劑量和雙倍劑量組進(jìn)食、活動均有所好轉(zhuǎn)，肢體活動明顯增多。各組大鼠造模期間、藥物干預(yù)期間的體質(zhì)量增長率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1、2。

圖1 造模期間各組大鼠體質(zhì)量增長率

圖2 藥物干預(yù)期間各組大鼠體質(zhì)量增長率

2.2 血清骨代謝指標(biāo)比較 與空白對照組相比，模型對照組血清BALP、TRAP5b、PINP、CTX 水平在干預(yù)42 d 和60 d 均升高（P均＜0.01）。與模型對照組相比，護(hù)骨膠囊基礎(chǔ)劑量組和雙倍劑量組干預(yù)42 d 和60 d 后，血清BALP、TRAP5b、PINP、CTX 水平均降低（P均＜0.01），其中雙倍劑量組上述指標(biāo)均較基礎(chǔ)劑量組降低（P均＜0.01）；在相同劑量組內(nèi)，干預(yù)42 d 與60 d 相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組血清BALP、PINP、TRAP5b、CTX水平比較（±s）

表1 各組血清BALP、PINP、TRAP5b、CTX水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與同時點模型對照組比較，*P＜0.01；與同時間點護(hù)骨膠囊基礎(chǔ)劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別模型對照組42 d 60 d護(hù)骨膠囊基礎(chǔ)劑量組42 d 60 d護(hù)骨膠囊雙倍劑量組42 d 60 d空白對照組n 8 8 8 8 8 8 4 BALP（IU/L）1774.22± 40.51##1843.06± 76.46##1312.68±101.42*1333.96± 56.60*1167.28± 65.40##*△△1129.07± 51.90*△△1392.11±114.61 PINP（μg/L）25.48±1.62##23.11±2.87#18.04±1.13*18.81±1.07*16.61±1.55*△16.28±1.09##*△△18.68±1.49 TRAP5b（U/L）1016.69±32.31##1030.66±62.76##766.75±34.05*769.64±39.12*632.16±42.77*△△651.25±38.70*△△739.56±85.33 CTX（μg/L）76.20±1.49##78.85±4.72##56.99±3.53*57.13±4.71*49.15±2.47##*△△50.61±3.09##*△△55.79±1.38

2.3 各組股骨頭形態(tài)學(xué)比較

2.3.1 股骨頭關(guān)節(jié)軟骨區(qū)域 空白對照組關(guān)節(jié)軟骨軟骨面光滑，結(jié)構(gòu)連續(xù)完整；移行層結(jié)構(gòu)明顯，幼稚軟骨細(xì)胞多呈扁平形，長軸多與關(guān)節(jié)面平行；輻射層著色較深，軟骨細(xì)胞呈圓形，位于軟骨陷窩內(nèi)，呈同源細(xì)胞群排列；潮線界限明顯，可見潮線下方的鈣化層和軟骨細(xì)胞。模型對照組干預(yù)42 d時關(guān)節(jié)軟骨面欠光滑，移行層偏少，與輻射層界限不清，輻射層軟骨細(xì)胞呈同源細(xì)胞群排列，但軟骨陷窩多為空骨陷窩，潮線不清晰；干預(yù)60 d 時關(guān)節(jié)軟骨面欠光滑，移行層少，輻射層同源細(xì)胞群較少，少見空骨陷窩，潮線不清晰。護(hù)骨膠囊基礎(chǔ)劑量組給藥42 d時關(guān)節(jié)軟骨面欠光滑，軟骨多層結(jié)構(gòu)不清晰，軟骨細(xì)胞明顯增多，柱狀排列，以幼稚細(xì)胞為主，同源細(xì)胞群少見；給藥60 d 時軟骨細(xì)胞較42 d 時細(xì)胞體積變大，軟骨細(xì)胞多為圓形，同源細(xì)胞群多見。護(hù)骨膠囊雙倍劑量組給藥42 d 時關(guān)節(jié)軟骨面光滑，軟骨多層結(jié)構(gòu)較清晰，同源細(xì)胞群數(shù)目較基礎(chǔ)劑量組增多，偶見空骨軟骨陷窩；給藥60 d 時可見清晰深染的關(guān)節(jié)軟骨表面，纖維束結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，移行層和輻射層結(jié)構(gòu)界限清晰可見，細(xì)胞各層軟骨細(xì)胞形態(tài)明顯清晰，少見空骨軟骨陷窩。

2.3.2 股骨頭骺板區(qū)域 空白對照組骺板靜止區(qū)、增殖區(qū)和肥大區(qū)清晰可見；靜止區(qū)與上方的軟骨下骨板相鄰，結(jié)構(gòu)連續(xù)，而增殖區(qū)和肥大區(qū)軟骨細(xì)胞排列成明顯的柱狀，下方與海綿體和骨小梁相鄰。模型對照組干預(yù)42 d 和60 d 均見骺板內(nèi)結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨細(xì)胞柱結(jié)構(gòu)不連續(xù)，靜止區(qū)與上方的軟骨下骨板，以及下方的增殖區(qū)與肥大區(qū)之間有出現(xiàn)了水平結(jié)構(gòu)斷裂，增殖樣軟骨細(xì)胞數(shù)量減少或缺如。護(hù)骨膠囊基礎(chǔ)劑量組干預(yù)42 d時骺板結(jié)構(gòu)明顯較模型對照組清晰，軟骨細(xì)胞柱清晰可見，但骺板上與軟骨下骨板相鄰處仍可見部分?jǐn)嗔眩桓深A(yù)60 d時，骺板結(jié)構(gòu)清晰正常，與軟骨下骨板相連的靜止區(qū)軟骨細(xì)胞層數(shù)較42 d時增多，增殖區(qū)軟骨柱結(jié)構(gòu)緊密，骺板上下結(jié)構(gòu)連續(xù)性好，少見斷裂。護(hù)骨膠囊雙倍劑量組干預(yù)42 d 時可見骺板上方與骨板有部分?jǐn)嗔眩?0 d 可見清晰的骺板結(jié)構(gòu)，且骺板上、下方結(jié)構(gòu)連續(xù)性好，幾無斷裂。2.3.3 股骨頭軟骨下骨區(qū)域 空白對照組股骨頭軟骨下血管豐富，骨小梁粗大，編織狀排列，骨髓竇內(nèi)充滿骨髓細(xì)胞，僅見少量脂肪細(xì)胞。模型對照組可見明顯骨壞死，骨小梁排列紊亂，稀疏斷裂，夾雜大量未完全吸收的骨小梁壞死碎片，骨髓竇內(nèi)細(xì)胞減少甚至缺如，脂肪細(xì)胞肥大融合成空泡，部分表現(xiàn)為囊性樣變。軟骨下血管內(nèi)可見淤血。護(hù)骨膠囊基礎(chǔ)劑量組干預(yù)42 d 時骨壞死狀況有所改善，骨小梁斷裂減少，未吸收的骨小梁碎片也明顯減少，但排列仍然紊亂；干預(yù)60 d 時壞死骨組織進(jìn)一步減少。護(hù)骨膠囊雙倍劑量組干預(yù)42 d 時骨小梁紊亂有所改善，近鈣化軟骨下方可見有部分淤血。部分骺板處仍有斷裂。護(hù)骨膠囊雙倍劑量組干預(yù)60 d時軟骨下骨區(qū)內(nèi)骨小梁粗大，結(jié)構(gòu)明顯清晰，軟骨下骨區(qū)與骺板結(jié)構(gòu)連續(xù)，無斷裂。

3 討論

ONFH 顯著影響患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重者需進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。與西藥和手術(shù)等治療手段相比，中藥復(fù)方治療ONFH 具有無創(chuàng)方便、價格低廉的優(yōu)勢，更容易被患者所接受。目前，中藥復(fù)方股骨頭壞死愈膠囊治療早期非創(chuàng)傷性股骨頭壞死［8］、活血生骨湯治療中老年激素性股骨頭壞死［9］經(jīng)臨床驗證，已取得較為滿意的效果。中藥護(hù)骨膠囊是由制何首烏、淫羊藿、熟地黃、龜甲、巴戟天、杜仲、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、當(dāng)歸、山藥中提取有效成分，經(jīng)一定工藝加工而成的中藥復(fù)方膠囊制劑。其具有補(bǔ)肝腎、益精血、調(diào)理陰陽的功效，臨床研究顯示，護(hù)骨膠囊用于防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松具有較好的療效?；诠琴|(zhì)疏松和股骨頭壞死某些病機(jī)和治療方案的相似性，本研究探討了護(hù)骨膠囊對股骨頭壞死的治療作用。

本研究應(yīng)用小劑量脂多糖聯(lián)合甲強(qiáng)龍制備大鼠ONFH 模型［10］。小劑量脂多糖能產(chǎn)生施瓦茨曼反應(yīng)，使機(jī)體血管處于髙凝狀態(tài)甚至出現(xiàn)彌漫性血管內(nèi)凝血。當(dāng)大鼠機(jī)體處于高凝狀態(tài)，短時間大劑量的甲強(qiáng)龍沖擊可造成激素性股骨頭缺血壞死。大劑量短期甲強(qiáng)龍沖擊后，換成小劑量甲強(qiáng)龍注射，能夠有效減少動物死亡，同時保證高的成模率。本研究結(jié)果顯示，模型組一般狀況較差；鏡下觀察股骨頭形態(tài)，出現(xiàn)股骨頭關(guān)節(jié)軟骨變薄，同源軟骨細(xì)胞缺少，軟骨下骨區(qū)大片骨壞死，骨小梁斷裂，空骨陷窩增加，骨髓竇內(nèi)細(xì)胞減少甚至缺如，出現(xiàn)大量脂肪細(xì)胞空泡。以上表現(xiàn)符合股骨頭壞死的特征，說明ONFH模型制作成功，為后續(xù)實驗提供了良好的模型。

骨代謝指標(biāo)是指骨組織在代謝過程中產(chǎn)生的相關(guān)產(chǎn)物和激素，這些指標(biāo)可以從血液或尿液中檢測到，能夠反映骨代謝水平。骨代謝指標(biāo)主要包括鈣磷代謝調(diào)節(jié)指標(biāo)、骨形成標(biāo)志物、骨吸收標(biāo)志物等。本研究選擇BALP、PINP 這兩種骨形成標(biāo)志物，和TRACP5b、CTX 這兩種骨吸收標(biāo)志物進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型對照組干預(yù)42 d和60 d 時血清BALP、PINP 水平升高，表示成骨細(xì)胞的分化活動加快，呈現(xiàn)骨的高轉(zhuǎn)換；護(hù)骨膠囊不同劑量組血清BALP、PINP 水平均下降，代表成骨細(xì)胞的分化活動下降且骨轉(zhuǎn)換減緩；與模型對照組相比，護(hù)骨膠囊促進(jìn)骨形成，骨轉(zhuǎn)換減緩，雙倍劑量組骨形成指標(biāo)下降尤為明顯。而反映骨吸收的指標(biāo)中，與空白對照組相比，模型對照組血清CTX、TRACP5b 在42 d 和60 d 顯著升高，提示模型對照組體內(nèi)破骨細(xì)胞很活躍，骨吸收加快，Ⅰ型膠原降解產(chǎn)物增多；與模型對照組相比，護(hù)骨膠囊給藥后CTX、TRACP5b均明顯回落，提示護(hù)骨膠囊能夠抑制大鼠破骨細(xì)胞的活性，抑制骨吸收，Ⅰ型膠原降解產(chǎn)物減少；與護(hù)骨膠囊基礎(chǔ)劑量組相比，護(hù)骨膠囊雙倍劑量組的骨吸收指標(biāo)下降更多。本研究還發(fā)現(xiàn)，在護(hù)骨膠囊相同劑量組內(nèi)，42 d 與60 d 時的骨形成和骨吸收代謝指標(biāo)水平無統(tǒng)計學(xué)差異，這與修復(fù)骨壞死是一個長期緩慢的過程，骨代謝指標(biāo)變化也較為緩慢有關(guān)。綜合骨形成和骨吸收的骨代謝指標(biāo)變化，我們認(rèn)為，護(hù)骨膠囊可以促進(jìn)壞死股骨頭的骨形成，抑制骨吸收，雙倍劑量的護(hù)骨膠囊效果優(yōu)于基礎(chǔ)劑量。

股骨頭之所以容易發(fā)生壞死，一部分原因是由于股骨頭有著特殊的解剖結(jié)構(gòu)和血運(yùn)特點。股骨頭絕大部分由關(guān)節(jié)軟骨覆蓋，不與周圍軟組織直接接觸，其與位于下方的軟骨下骨、骺板和骺板下小梁骨等共同承受和分配外來應(yīng)力。在軟骨下骨板區(qū)分布著大量的動靜脈分支，這些血管不僅提供給股骨頭類種類細(xì)胞的代謝需求，而且也影響著軟骨下骨組織的血流灌注。股骨頭內(nèi)發(fā)生骨壞死時，受損斷裂的骨小梁會進(jìn)一步壓迫骨髓竇，使骨內(nèi)壓異常增高，加重股骨頭缺血，造成骨內(nèi)惡性循環(huán)，從而在形態(tài)上表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、骺板和血管等一系列病理表現(xiàn)［11-12］。臨床研究也觀察到病例的壞死股骨頭出現(xiàn)了發(fā)展密切相關(guān)［13］，因此本研究也對股骨頭的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察。本研究發(fā)現(xiàn)，相較空白對照組，模型對照組股骨頭關(guān)節(jié)軟骨變薄，軟骨結(jié)構(gòu)不清晰，軟骨下骨區(qū)出現(xiàn)小的囊性樣變，囊內(nèi)甚至出現(xiàn)纖維組織增生，骨小梁雜亂斷裂，出現(xiàn)云片狀壞死，骨小梁分離度增加，以上均符合早期ONFH 的典型特征。隨著護(hù)骨膠囊給藥，關(guān)節(jié)軟骨幾層結(jié)構(gòu)逐漸清晰，軟骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)分明，同源軟骨細(xì)胞群數(shù)目組明顯增多，偶見空骨軟骨陷窩。軟骨下云片狀骨壞死碎片逐漸減少，骨小梁明顯變粗，骺板軟骨細(xì)胞柱排列完整，結(jié)構(gòu)連續(xù)。有研究［14］發(fā)現(xiàn)，使用甲潑尼龍制作的肉雞股骨頭壞死模型，肉雞的股骨頭生長板會出現(xiàn)線狀裂縫，甚至斷裂，認(rèn)為與Ihh-PTHrP信號通路紊亂有關(guān)［15］，Ihh-PTHrP 信號通路導(dǎo)致軟骨細(xì)胞加速成熟分化，導(dǎo)致生長板增殖區(qū)與肥大區(qū)軟骨基質(zhì)不同程度積聚，密度相差較大，軟骨基質(zhì)分解等原因而出現(xiàn)組織間隙［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠的股骨頭生長板處也有明顯的水平結(jié)構(gòu)斷裂。后續(xù)給藥實驗中，模型對照組使用生理鹽水干預(yù)42 d 和60 d 時，骺板區(qū)域也有明顯的水平結(jié)構(gòu)斷裂。我們認(rèn)為，一方面原因是大劑量激素對軟骨細(xì)胞的成熟分化造成影響，使得骺板處本應(yīng)規(guī)律排列的軟骨細(xì)胞柱出現(xiàn)異常，出現(xiàn)大量肥大樣軟骨細(xì)胞，軟骨外分泌的Ⅹ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶類等都會增多，Ⅹ型膠原的增多引起軟骨基質(zhì)鈣化，在各向異性的牽拉作用力下，骺板在增殖帶軟骨細(xì)胞處出現(xiàn)結(jié)構(gòu)斷裂；另一方面原因可能是股骨頭軟骨下骨的骨小梁紊亂，承受股骨頭應(yīng)力的力學(xué)性能下降，繼而小梁下方響應(yīng)應(yīng)力的骺板軟骨進(jìn)一步遭到損壞。

同時我們注意到，股骨頭壞死大鼠給予護(hù)骨膠囊干預(yù)一段時間后，骨髓腔中造血細(xì)胞仍有缺失，脂肪細(xì)胞融合崩解，表現(xiàn)為空泡或囊樣變。這可能存在兩方面的原因：①骨髓造血細(xì)胞是股骨頭骨組織的重要組成部分。脂多糖聯(lián)合大劑量激素造模，骨髓中的造血系細(xì)胞勢必會受到影響。它們的病理變化又勢必影響股骨頭缺血壞死的發(fā)生發(fā)展。研究顯示，骨髓造血細(xì)胞的DNA 氧化損傷發(fā)生于骨細(xì)胞凋亡之前，是激素性股骨頭缺血壞死的早期分子事件［17］。②本實驗給藥方式為治療性給藥，護(hù)骨膠囊短時間內(nèi)對已損傷或發(fā)生凋亡的骨髓造血細(xì)胞影響不明顯，可以考慮活血藥物輔助治療，或調(diào)整給藥方式為預(yù)防性給藥，或延長治療性給藥時間，再行觀察骨髓竇內(nèi)骨髓細(xì)胞的表現(xiàn)。

有研究表明，骨碎補(bǔ)、熟地能誘導(dǎo)骨髓腔中的間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞［18］，護(hù)骨膠囊含有骨碎補(bǔ)和熟地，刺激間充質(zhì)干細(xì)胞聚集在骺板分化成軟骨細(xì)胞，使其再次進(jìn)入增殖、肥大階段，從而恢復(fù)軟骨細(xì)胞柱的結(jié)構(gòu)，保證軟骨內(nèi)成骨的功能，調(diào)節(jié)骺板上下方的成骨能力，繼而增強(qiáng)股骨頭承受機(jī)械應(yīng)力的能力等。本研究結(jié)果顯示，與模型對照組比較，護(hù)骨膠囊不同劑量給藥組的骺板軟骨細(xì)胞柱均有明顯恢復(fù)，骺板上下方結(jié)構(gòu)聯(lián)系明顯改善，這表明護(hù)骨膠囊通過促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分化，使壞死股骨頭的骺板結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能均有了明顯的恢復(fù)。

綜上所述，護(hù)骨膠囊能夠抑制ONFH 模型的骨代謝的高轉(zhuǎn)換狀態(tài)，抑制骨吸收，調(diào)節(jié)骨代謝，改善股骨頭的骨壞死和骺板損傷。相較骨質(zhì)疏松癥適用劑量而言，使用較大劑量的護(hù)骨膠囊干預(yù)，更有于ONFH 癥的防治和改善。本研究結(jié)果為開發(fā)護(hù)骨膠囊的更多適應(yīng)證提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。