張?jiān)?田嬌嬌 葉凌志 葉正威 張 琳,3,* 徐繼林,3,*

(1 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(寧波大學(xué))，浙江 寧波 315211；3 浙江省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(寧波大學(xué))，浙江 寧波 315211)

作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者，微藻富含糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸和色素等營養(yǎng)物質(zhì)，且光合效率高、繁殖速度快，被廣泛用作水產(chǎn)動(dòng)物餌料[1-3]。許多微藻代謝產(chǎn)物具有較高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值。其中，二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)可提高脂肪細(xì)胞線粒體氧化能力，在一定程度上避免氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]； β-胡蘿卜素能清除水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的活性氧，提高機(jī)體免疫力[5]；蝦青素能夠使甲殼類、魚類保持健康體色，提高其觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]；從橢圓小球藻(Chlorellaellipsoidea)中提取的紫黃素具有一定的抗炎活性[7]。同時(shí)，微藻還可為幼魚生長提供優(yōu)質(zhì)蛋白，并能促進(jìn)雙殼貝類生長[8]。

餌料微藻營養(yǎng)物質(zhì)積累受多種環(huán)境因子影響，如光強(qiáng)、光質(zhì)、溫度、鹽度、營養(yǎng)鹽等[9-10]。據(jù)報(bào)道，300 μmol photons·m-2·s-1光強(qiáng)能顯著提高缺刻緣綠藻(Parietochlorisincisa)的生物量并促進(jìn)其脂肪酸積累[11]，而50 μmol photons·m-2·s-1光強(qiáng)比210 μmol photons·m-2·s-1光強(qiáng)更能促進(jìn)普通小球藻(Chlorellavulgaris)生長[12]。紅(80%)、藍(lán)(20%)光混合照射可促進(jìn)螺旋藻(Spirulinasp.)生長，并顯著提高其葉綠素a、藻藍(lán)素和類胡蘿卜素含量[13]。類似地，LED白藍(lán)混合光照射可大大提高普通小球藻的生物量[14]。而171 μmol photons·m-2·s-1純藍(lán)光比混合白光更能促進(jìn)湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)光合作用[15]。此外，在一定范圍內(nèi)(10～30 mg·L-1)增加氮濃度可提高鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)比生長速率、生物量、蛋白和可溶性糖含量，而氮濃度過高(40 mg·L-1)則會(huì)抑制其生長[16]。在氮充足條件下，蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)對(duì)氮源的吸收效率受磷濃度影響，且在藍(lán)光輔助照射下對(duì)磷吸收效率最高，達(dá)90.80%[17]?？梢?，不同環(huán)境因子間可相互影響，共同作用于微藻生長和代謝，光和營養(yǎng)鹽是其中重要的環(huán)境因子，頗具研究意義。

微擬球藻(Nannochloropsissp.)是一類分布廣泛的單細(xì)胞微藻，既有海水種也有淡水種[18]，個(gè)體微小，生長迅速，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域[19]。微擬球藻富含油酸、亞油酸、EPA等多不飽和脂肪酸，其中，EPA含量最高可達(dá)總脂肪酸的30%[20]。此外，微擬球藻色素組成十分獨(dú)特，只含有葉綠素a，不含葉綠素b和葉綠素c[21]，富含β-胡蘿卜素、角黃素、葉黃素、紫黃素和無隔藻黃素等，一些微擬球藻還能積累蝦青素[22]?？扇苄蕴呛偷鞍鬃鳛槲M球藻中最豐富的有機(jī)成分，占細(xì)胞干重比重較大，其中蛋白含量最高可達(dá)30%[23]。

環(huán)境因子對(duì)微擬球藻營養(yǎng)組成的影響已有部分報(bào)道。當(dāng)?shù)?、磷、鐵的濃度分別為24.6、1.1和0.2 mg·L-1時(shí)，微擬球藻可獲得最高生物量和蛋白含量[24]。Sung等[23]比較了相同光強(qiáng)的白光、紅光和藍(lán)光對(duì)微擬球藻的影響，發(fā)現(xiàn)在紅、藍(lán)光下其生物量積累分別提高40.3%、35.1%。相較于150 μmol photons·m-2·s-1光強(qiáng)，微擬球藻在50 μmol photons·m-2·s-1光強(qiáng)下能獲得更高的生物量和脂肪酸(尤其是EPA)產(chǎn)量[25]。研究表明，相同培養(yǎng)條件下，高生物量與高營養(yǎng)物質(zhì)積累往往不能兼得，需采用“兩階段培養(yǎng)法”：第一階段為微擬球藻提供最適生長條件，短期內(nèi)獲得更多生物量；第二階段將擴(kuò)繁后的微擬球藻轉(zhuǎn)移至目標(biāo)營養(yǎng)物質(zhì)最適積累條件下培養(yǎng)，優(yōu)化營養(yǎng)組成，提高目標(biāo)營養(yǎng)占比[26]。通過調(diào)控環(huán)境因子，使微擬球藻短期內(nèi)獲得最大生物量進(jìn)而積累更多目標(biāo)營養(yǎng)物質(zhì)，可大大促進(jìn)微擬球藻在餌料領(lǐng)域的應(yīng)用，是現(xiàn)階段研究的重要方向之一。

基于此，本試驗(yàn)系統(tǒng)分析了4種不同環(huán)境因子(光質(zhì)、光強(qiáng)、氮、磷)對(duì)微擬球藻生長及營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響，分析其生長最適環(huán)境因子與營養(yǎng)物質(zhì)積累最佳因子，旨在為后續(xù)大規(guī)模培養(yǎng)微擬球藻提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)藻種選取海洋微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)，由浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，編號(hào)NMBluh014。藻種培養(yǎng)選用高壓滅菌(121℃、20 min)后的NMB3#培養(yǎng)基[27]。培養(yǎng)溫度25℃，光強(qiáng)80 μmol photons·m-2·s-1，光暗比12 h∶12 h。每天搖瓶數(shù)次，防止藻細(xì)胞貼壁。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)分為光質(zhì)、光強(qiáng)、氮濃度和磷濃度梯度試驗(yàn)四部分。所有試驗(yàn)組微擬球藻初始接種密度統(tǒng)一，并同時(shí)采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法與紫外分光光度計(jì)法(OD值)在波長750 nm處測(cè)定藻細(xì)胞密度(2±0.5×106cell·mL-1；OD750=0.050±0.003)。除所設(shè)環(huán)境因子變量外，其余環(huán)境因子保持一致，隔天測(cè)定OD750。培養(yǎng)25 d后取5 mL藻液進(jìn)行色素分析，離心(8 000 r·min-1，10 min)收集藻細(xì)胞，冷凍干燥48 h后測(cè)定脂肪酸、可溶性糖及蛋白含量。每組設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.1 光質(zhì)試驗(yàn)方法 使用N600H2-S-K06-06可調(diào)式液冷復(fù)合光譜試驗(yàn)燈組(廈門三安光電有限公司)，調(diào)節(jié)不同試驗(yàn)組中紅、藍(lán)、綠光分別占比為100%、50%、0%，并依據(jù)RGB三原色原理(Red∶Green∶Blue=2∶1∶1)[28]將剩余比例單色光補(bǔ)齊(表1)。

表1 不同試驗(yàn)組光質(zhì)組成Table 1 Light quality composition of different experimental groups

1.2.2 光強(qiáng)試驗(yàn)方法 微擬球藻培養(yǎng)在恒溫GXZ-280B光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)內(nèi)完成。設(shè)置光強(qiáng)分別為20、80、140和200 μmol photons·m-2·s-1，編號(hào)L1～L4。

1.2.3 氮濃度、磷濃度試驗(yàn)方法 以NMB3#培養(yǎng)基氮、磷工作濃度(氮13.85 mg·L-1、磷2.24 mg·L-1)為對(duì)照。設(shè)置氮元素55.40、13.85、3.46、1.73 mg·L-14個(gè)梯度(編號(hào)N1～N4)，磷元素8.96、2.24、0.56、0.28 mg·L-14個(gè)梯度(編號(hào)P1～P4)，梯度設(shè)置基于預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，其余營養(yǎng)鹽濃度保持不變。其中，N2與常規(guī)NMB3#培養(yǎng)基中氮濃度一致，且其余環(huán)境因子均相同，因此將N2視為常規(guī)對(duì)照組。

1.2.4 脂肪酸組成測(cè)定方法 藻粉冷凍干燥后置于10 mL玻璃試管中，加入HPLC級(jí)正己烷1 mL和甲酰氯1.5 mL(甲醇∶乙酰氯=10∶1)，漩渦震蕩30 s，65℃水浴2.5 h，加入6%碳酸鉀2.5 mL、正己烷1 mL，漩渦震蕩30 s，取上清液至2 mL EP管中，3 000 r·min-1離心10 min，用0.22 μm針式有機(jī)相濾膜過濾至2 mL棕色進(jìn)樣瓶，使用7890B/7000C三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜分析儀(美國安捷倫科技有限公司)進(jìn)行脂肪酸組成分析，采用面積歸一化法計(jì)算相對(duì)百分含量。

1.2.5 色素組成測(cè)定方法 色素提取操作嚴(yán)格避光。取5 mL藻液，用47 mm GF/F玻璃纖維濾膜真空抽濾，剪碎濾膜至15 mL離心管中，加入HPLC級(jí)甲醇5 mL，渦旋震蕩5 min，冰浴超聲20 min后用0.22 μm有機(jī)相針式過濾器(直徑13 mm)過濾上清液去除雜質(zhì)，2 mL棕色進(jìn)樣瓶收集濾液，使用HPLC-Q-Orbitrap超高液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(美國賽默飛世爾科技公司)進(jìn)行色素組成分析，采用面積歸一化法計(jì)算相對(duì)百分含量。

1.2.6 蛋白和可溶性糖含量測(cè)定方法 采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定可溶性糖含量，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，測(cè)定使用對(duì)應(yīng)濃度試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)，步驟謹(jǐn)遵說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與制圖。使用SPSS 20軟件進(jìn)行單因素方差分析及差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同環(huán)境因子下微擬球藻生長

注：A：7 d時(shí)各試驗(yàn)組OD值；B：15 d時(shí)各試驗(yàn)組OD值；C：23 d時(shí)各試驗(yàn)組OD值；L1～L4分別表示光強(qiáng)20、80、140和200 μmol photons·m-2·s-1； N1～N4分別表示氮濃度55.40、13.85、3.46、1.73 mg·L-1；P1～P4分別表示磷濃度8.96、2.24、0.56、0.28 mg·L-1；不 同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A: OD value of each experimental group at 7 d. B: OD value of each experimental group at 15 d. C: OD value of each experimental group at 23 d. L1～L4 represent the light intensity 20, 80, 140, 200 μmol photons·m-2·s-1, respectively. N1～N4 represent nitrogen concentration of 55.40, 13.85, 3.46, 1.73 mg·L-1, respectively. P1～P4 represent phosphorus Concentration 8.96, 2.24, 0.56, 0.28 mg·L-1, respectively. Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. The same as following.圖1 不同時(shí)間點(diǎn)不同環(huán)境因子下微擬球藻生長Fig.1 Growth of N. oceanica with different environmental factors at different time points

圖1為微擬球藻在不同環(huán)境因子下的生長情況，選取時(shí)間點(diǎn)分別為指數(shù)期(7 d)、平臺(tái)初期(15 d)和平臺(tái)末期(23 d)，7 d時(shí)，綠光G2組生長最為緩慢，并與紅、藍(lán)光組存在顯著性差異(P<0.05)。氮濃度試驗(yàn)組中，N1組生長速度最快，N3、N4生長較為緩慢。培養(yǎng)7～15 d時(shí)，隨著氮、磷的缺乏，N3、N4和P4組生長速率變慢，與之相比，其他試驗(yàn)組生物量積累均穩(wěn)步提高，15 d時(shí)，L4組生長最為迅速。培養(yǎng)至23 d，L4組獲得最大生物量。氮、磷試驗(yàn)組生長情況與營養(yǎng)鹽濃度呈正相關(guān)，N1和P1組生物量積累較大，N4組生物量最少。光質(zhì)試驗(yàn)中，R1組生物量積累較大，并與其他光質(zhì)試驗(yàn)組存在顯著性差異(P<0.05)。值得注意的是，所有光質(zhì)比例下微擬球藻均可保持健康生長，預(yù)示著微擬球藻光譜適應(yīng)性較廣。純紅光或氮富足條件下指數(shù)期微擬球藻生長增速較大，更高的光強(qiáng)對(duì)于微擬球藻在指數(shù)末期至平臺(tái)期生長增速較大。

2.2 不同環(huán)境因子對(duì)微擬球藻脂肪酸組成影響

不同環(huán)境因子下微擬球藻脂肪酸組成見表2。共檢出二十碳五烯酸(C20:5n-3，EPA)、花生四烯酸(C20:4n-6)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亞油酸(C18:2n-6)、棕櫚酸(C16:0)、棕櫚油酸(C16:1)和肉豆蔻酸(C14:0)8種脂肪酸，其中飽和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)3種，占比為31.767%～58.436%，不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid, UFA)5種，占比為41.564%～68.233%。

光強(qiáng)試驗(yàn)中，光強(qiáng)在80～200 μmol photons·m-2·s-1范圍內(nèi)時(shí)，SFA比例隨光強(qiáng)增強(qiáng)呈上升趨勢(shì)，UFA比例則逐漸下降。除C14：0在L1與L3組存在顯著性差異外，其余脂肪酸組分在不同光強(qiáng)下差異均不顯著。光質(zhì)試驗(yàn)中，EPA的積累量隨著紅光比例的的下降而增大，隨著藍(lán)光比例下降而減少，SFA與UFA則未呈現(xiàn)明顯的變化趨勢(shì)。整體來看，單色光和光強(qiáng)對(duì)微擬球藻脂肪酸組成影響不大。

相較于光質(zhì)和光強(qiáng)，氮、磷濃度變化對(duì)脂肪酸積累影響更大。氮濃度試驗(yàn)中，隨著氮濃度降低，SFA比例呈上升趨勢(shì)，UFA比例則逐漸下降。N1組UFA比例達(dá)到最大值，為68.233%，EPA積累也達(dá)到最大值20.502%。N4組SFA比例達(dá)到最大，為58.436%，而UFA最低，為41.564%，說明氮元素的缺乏是導(dǎo)致微擬球藻UFA比例下降的主要原因。磷濃度試驗(yàn)中，隨著磷濃度降低，SFA比例先下降后上升，UFA比例先上升后下降，推測(cè)微擬球藻UFA最適積累磷濃度為2.24 mg·L-1，C14：0和C18：0在P1組中分別達(dá)到最大積累量4.398%和7.941%，C20：4n-6在P2組積累量最大，為3.368%。

2.3 不同環(huán)境因子對(duì)微擬球藻色素組成影響

微擬球藻中共檢出11種色素，分別是葉綠素a、β-胡蘿卜素、角黃素、硅甲藻黃素、葉黃素、玉米黃素、蝦青素、紫黃素、隱藻黃素、異黃素和百合黃素。其中葉綠素a和β-胡蘿卜素占比最大，非脅迫狀態(tài)下兩者含量之和可達(dá)總含量的70%。

由表3可知，隨著光強(qiáng)的增加，葉綠素a和蝦青素占比逐漸降低，β-胡蘿卜素、玉米黃素占比逐漸增大。在L1中，葉綠素a占比達(dá)到全試驗(yàn)組最大，為55.114%，β-胡蘿卜素占比最小，為23.889%，整體來看，弱光有利于微擬球藻積累葉綠素。

與光強(qiáng)試驗(yàn)不同，光質(zhì)試驗(yàn)中β-胡蘿卜素在G1組占比最大(48.281%)，葉綠素a在G1組占比最小(18.962%)，表明綠光有利于微擬球藻積累β-胡蘿卜素。百合黃素在B3組占比最大(4.282%)，在其余試驗(yàn)組內(nèi)則無顯著性差異。整體來看，光質(zhì)和光強(qiáng)對(duì)微擬球藻中高含量色素的影響較大，如葉綠素a和β-胡蘿卜素，對(duì)微量色素的影響相對(duì)較小。

氮、磷試驗(yàn)組中，隨著氮濃度降低，葉綠素a占比逐漸增大，β-胡蘿卜素、異黃素和百合黃素占比逐漸降低，在N4組中，蝦青素、角黃素和玉米黃素占比最大，分別為6.280%、10.557%和5.665%。隨著磷濃度降低，角黃素、硅甲藻黃素、紫黃素和隱藻黃素占比逐漸降低，硅甲藻黃素、葉黃素、紫黃素和隱藻黃素在P1組占比最大，分別為3.556%、11.932%、2.340%和6.658%，可見絕大多數(shù)類胡蘿卜素積累的極值均出現(xiàn)在氮、磷脅迫試驗(yàn)組，表明相較于光質(zhì)和光強(qiáng)，氮、磷濃度對(duì)微擬球藻中微量類胡蘿卜素積累的影響更大。

2.4 不同環(huán)境因子對(duì)微擬球藻可溶性糖和蛋白含量影響

由圖2可知，隨著光強(qiáng)增加，微擬球藻中可溶性糖和蛋白含量均逐漸增大，可溶性糖和蛋白含量在L4組中達(dá)到最大值，分別為5.17 mg·mL-1和2.40 mg·L-1。 氮濃度試驗(yàn)中，隨著氮濃度降低，可溶性糖和蛋白含量均有所降低(P<0.05)。類似地，在磷濃度試驗(yàn)中，隨著磷濃度降低，細(xì)胞中蛋白含量逐漸下降，而可溶性糖含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在磷2.24 mg·L-1時(shí)達(dá)到峰值，表明該濃度或許為其積累可溶性糖的最佳濃度。光質(zhì)試驗(yàn)組中，R3組蛋白含量較其余所有光質(zhì)組顯著升高，G1組蛋白含量較其余所有光質(zhì)組顯著下降(P<0.05)，B1組可溶性糖含量最低，可見，強(qiáng)烈的光照對(duì)可溶性糖和蛋白積累的影響遠(yuǎn)大于其他環(huán)境因子，強(qiáng)光能促進(jìn)微擬球藻細(xì)胞中可溶性糖和蛋白的積累，而氮濃度的降低則會(huì)抑制其積累。同樣，純綠光亦會(huì)抑制蛋白積累。

3 討論

3.1 不同環(huán)境因子對(duì)微擬球藻生長的影響

微擬球藻生長不僅可以利用二氧化碳、無機(jī)氮等無機(jī)物，還可以利用葡萄糖、醋酸等有機(jī)物，同時(shí)還受營養(yǎng)鹽濃度、接種密度、溫度、光照等多種環(huán)境因子影響[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度對(duì)微擬球藻生長影響較為明顯，在20 μmol photons·m-2·s-1光強(qiáng)下，微擬球藻在指數(shù)期生長較為緩慢，平臺(tái)期則迅速增長，200 μmol photons·m-2·s-1光強(qiáng)下生長速度始終最快，且最終生物量最高。光質(zhì)試驗(yàn)中，微擬球藻在純紅光下生長速度最快，且表現(xiàn)出較廣的光譜適應(yīng)性。據(jù)報(bào)道，相比于其他光質(zhì)條件，微擬球藻在100 μmol photons·m-2·s-1藍(lán)光下有更多的生物量積累[31]，這與本研究結(jié)果不同，由此推測(cè)更高的光強(qiáng)可能會(huì)提高微擬球藻對(duì)于藍(lán)光的利用率。氮、磷濃度試驗(yàn)中，N1與N4、P1與P4生長差異顯著。氮濃度試驗(yàn)中，N1組生長速度最快，表明足量的氮源有利于微擬球藻在指數(shù)期積累生物量。培養(yǎng)至平臺(tái)期時(shí)，N4、P4組由于氮、磷的缺乏導(dǎo)致其生長速度變慢，且與其他試驗(yàn)組生物量積累出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)?？梢?，氮磷的缺乏是導(dǎo)致微擬球藻生物量積累匱乏的最主要原因。

表2 不同環(huán)境因子對(duì)微擬球藻脂肪酸組成影響Table 2 The influence of different environmental factors on the fatty acid composition of N. oceanica /%

表3 不同環(huán)境因子對(duì)微擬球藻色素組成影響Table 3 The influence of different environmental factors on the pigment composition of N. oceanica /%

圖2 不同環(huán)境因子對(duì)微擬球藻可溶性糖和蛋白含量影響Fig.2 The influence of different environmental factors on the soluble sugar and protein content of N. oceanica

以上結(jié)果為微擬球藻培養(yǎng)提供了新思路，可采用指數(shù)期供應(yīng)高濃度氮源外加紅光輔助其生長，到達(dá)平臺(tái)期則提供高光強(qiáng)白光，不同階段采用不同生長策略，以期在短時(shí)間內(nèi)積累更多生物量。

3.2 不同環(huán)境因子對(duì)微擬球藻脂肪酸積累的影響

微擬球藻以富含EPA等多不飽和脂肪酸而備受關(guān)注，其脂肪酸主要以結(jié)構(gòu)脂(磷脂、糖脂)以及儲(chǔ)存脂(甘油三酯)兩種形式存在，可用于制備高品質(zhì)生物柴油[32]。諸多研究表明，不同環(huán)境因子下微擬球藻脂肪酸積累存在明顯差異[33]。因此，解析不同環(huán)境因子對(duì)其脂肪酸積累的影響，確定其最優(yōu)積累條件，是高效利用微擬球藻的基礎(chǔ)[34]。

本研究中，培養(yǎng)25 d的微擬球藻，光強(qiáng)從140 μmol photons·m-2·s-1降至20 μmol photons·m-2·s-1時(shí)，EPA含量從8.687%增至11.802%，與Pal等[35]的結(jié)果類似，即當(dāng)微擬球藻培養(yǎng)7 d，光強(qiáng)從700 μmol photons·m-2·s-1降低至170 μmol photons·m-2·s-1時(shí)，EPA含量從10.8%增加到17.8%?？梢姡M球藻中EPA含量與光強(qiáng)呈反比。據(jù)報(bào)道，在光脅迫條件下，微擬球藻UFA含量會(huì)隨著光強(qiáng)的增加而減少，而在光飽和條件下，微擬球藻UFA含量則隨著光強(qiáng)的增強(qiáng)而增加，可能由于在強(qiáng)光脅迫下，微擬球藻細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，而UFA尤其是EPA的大量合成能抑制強(qiáng)光對(duì)其細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響[36]。

本研究發(fā)現(xiàn)(表2)，氮、磷對(duì)于微擬球藻脂肪酸積累的影響明顯大于光強(qiáng)和光質(zhì)。據(jù)報(bào)道，將氮濃度從60 μmol·L-1增至2 200 μmol·L-1時(shí)，微擬球藻中EPA含量從總脂肪酸的8.60%增至24.88%[37]。硝酸鹽濃度從1 800 μmol·L-1降至75 μmol·L-1時(shí)，微擬球藻EPA含量顯著降低[36]。這與本試驗(yàn)結(jié)果類似，當(dāng)?shù)獫舛葟?.46 mg·L-1提高至55.40 mg·L-1時(shí)，微擬球藻EPA含量從2.887%增至20.502%，UFA含量從53.246%增至68.233%。表明充足的氮源更有利于EPA的合成。氮濃度過低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞營養(yǎng)不良，生長受限，而氮濃度過高也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因大量合成銨離子而產(chǎn)生銨中毒現(xiàn)象[38]。據(jù)報(bào)道，在氮缺乏條件下，額外添加碳源可提高脂肪酸合成前體的供給，減少UFA的循環(huán)利用，以增加其在細(xì)胞內(nèi)的含量，應(yīng)對(duì)氮缺乏所帶來的壓力[39]。Shi等[40]研究發(fā)現(xiàn)，將微擬球藻(N.oceanica)分別培養(yǎng)于正常條件和無磷培養(yǎng)基中，無磷試驗(yàn)組中脂肪酸迅速積累，其中 C18：1 和 C16：0 最為顯著，多不飽和脂肪酸C20：5和C20：4積累則相對(duì)減少。最終結(jié)果顯示，大多數(shù)脂肪酸在磷缺乏條件下的積累速率顯著高于正常培養(yǎng)條件。本試驗(yàn)得到類似的結(jié)果，當(dāng)磷濃度從2.24 mg·L-1繼續(xù)降低時(shí)，C18：1 和 C16：0含量明顯上升，C20：5n-3和C20：4n-6含量顯著下降，表明磷濃度變化對(duì)不同脂肪酸的影響不同。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不同光質(zhì)照射下，微擬球藻胞內(nèi)SFA比例為38.787%～48.497%，UFA比例為51.503%～61.213%。G1組EPA占比最大，且隨著紅光比例的降低，EPA積累逐漸增多，隨著藍(lán)光比例的下降，EPA積累逐漸降低。有研究證實(shí)，紅藍(lán)光更有利于微擬球藻生物量的積累，而純綠光則更有利于不飽和脂肪酸尤其是EPA的積累[31]。由此可知，在微擬球藻作為高脂餌料的制備過程中，想要獲得更多的EPA積累，降低紅光同時(shí)增加藍(lán)綠光比例，也許是一個(gè)新思路。

3.3 不同環(huán)境因子對(duì)微擬球藻色素積累的影響

葉綠素a廣泛存在于大型陸生植物到小型單細(xì)胞微藻中[41]，起著分離電荷和固定光能、實(shí)現(xiàn)高效捕光以驅(qū)動(dòng)光合反應(yīng)的作用[42]。β-胡蘿卜素顏色鮮艷，能夠富集在動(dòng)物體內(nèi)使之呈現(xiàn)不同顏色，如小丑魚鮮艷的外表以及鮭魚的肉[43]。此外，β-胡蘿卜素在植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫(如干燥和低溫)中也起著重要的保護(hù)作用[44]。

本研究結(jié)果表明，微擬球藻在適宜培養(yǎng)條件下，藻液外觀呈翠綠色，而在環(huán)境脅迫狀態(tài)下，會(huì)呈橘黃色甚至黃褐色，表明環(huán)境因子對(duì)其色素積累有影響。光強(qiáng)試驗(yàn)中，微擬球藻顏色隨著光強(qiáng)增加而逐漸由綠變黃，這種變化主要是由β-胡蘿卜素和葉綠素a的比例變化導(dǎo)致的，與高保燕等[45]的研究結(jié)果類似。由于葉綠素a呈現(xiàn)藍(lán)綠色，β-胡蘿卜素呈現(xiàn)橙黃色[46]，在弱光20 μmol photons·m-2·s-1下胞內(nèi)葉綠素a比例最高，因此藻液呈現(xiàn)翠綠色，而在強(qiáng)光200 μmol photons·m-2·s-1下葉綠素a比例降低，β-胡蘿卜素比例升高，藻液則變?yōu)辄S褐色，這解釋了微擬球藻在環(huán)境因子脅迫下呈現(xiàn)黃褐色的原因。

據(jù)報(bào)道，微擬球藻在250 μmol photons·m-2·s-1光強(qiáng)下，葉綠素a合成受限[47]。微藻在適宜的光強(qiáng)下才能有效地進(jìn)行光合作用，當(dāng)光強(qiáng)達(dá)到甚至超過光飽和點(diǎn)時(shí)，光合作用被抑制，活性氧(reactive oxygen species, ROS)上升，光合作用細(xì)胞器受損[48]，這可能是導(dǎo)致葉綠素a含量下降的原因。本試驗(yàn)中，弱光對(duì)葉綠素a積累影響較為顯著，而氮、磷則對(duì)多種微量類胡蘿卜素積累影響更大，表明光強(qiáng)和營養(yǎng)鹽對(duì)于微擬球藻色素積累的影響大于光質(zhì)，其原因可能是微藻色素大分子的生物合成過程對(duì)氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)的濃度比較敏感[49]。光質(zhì)試驗(yàn)中，G1組葉綠素a比例最低，這可能表示微擬球藻對(duì)綠光吸收效率較低。因此，合理設(shè)置營養(yǎng)鹽組成和光照強(qiáng)度等條件，可以作為調(diào)控微擬球藻目標(biāo)色素產(chǎn)量的有效手段之一。

3.4 不同環(huán)境因子對(duì)微擬球藻可溶性糖和蛋白積累的影響

微擬球藻在L4組有最大可溶性糖和蛋白含量，同時(shí)該試驗(yàn)組生物量也最大，推測(cè)在該光強(qiáng)下，由于營養(yǎng)充分，光線充足，此時(shí)微藻胞內(nèi)碳源分配策略以供應(yīng)細(xì)胞分裂和合成蛋白骨架為主。光質(zhì)試驗(yàn)中，光質(zhì)條件不同，微擬球藻的碳分配策略也不同，R1～R3組，紅光比例逐漸降低，導(dǎo)致蛋白積累量提升，可溶性糖積累量則下降，表明紅光條件下微擬球藻碳分配策略主要以積累可溶性糖為主。與其余所有先質(zhì)組相比，G1組蛋白積累量顯著下降，推測(cè)純綠光會(huì)抑制微擬球藻積累蛋白質(zhì)。氮濃度和磷濃度試驗(yàn)中，N4和P4試驗(yàn)組由于營養(yǎng)缺乏，細(xì)胞生長受到明顯抑制，蛋白積累量極低，分別為0.40和0.26 mg·mL-1，且N4試驗(yàn)組SFA合成含量大幅上升，推測(cè)在營養(yǎng)鹽缺乏條件下，部分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂肪酸以幫助細(xì)胞應(yīng)對(duì)不良環(huán)境。Sun等[50]研究表明，在不良環(huán)境下，蛋白質(zhì)的降解是脂質(zhì)和可溶性糖合成的主要底物來源，氮源缺乏導(dǎo)致微擬球藻應(yīng)激增強(qiáng)，淀粉合成路徑則會(huì)轉(zhuǎn)向類胡蘿卜素和脂質(zhì)的合成路徑，因此在氮制約下，細(xì)胞內(nèi)部碳分配出現(xiàn)顯著變化。本試驗(yàn)N4組可溶性糖含量下降也與Sun等[50]的結(jié)果一致，由于脂肪酸能夠幫助細(xì)胞抵御外界不良環(huán)境，因此微擬球藻由合成淀粉、蛋白為主的碳分配策略轉(zhuǎn)而以脂質(zhì)合成為主，進(jìn)而影響微擬球藻的逆境適應(yīng)性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)探究了4種環(huán)境因子對(duì)微擬球藻營養(yǎng)物質(zhì)積累的影響，通過測(cè)定其生長及營養(yǎng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)純紅光或氮濃度為55.40 mg·L-1條件下，指數(shù)期生長速率較快，而200 μmol photons·m-2·s-1光強(qiáng)條件下微擬球藻在指數(shù)末期至平臺(tái)期生長速率較快。氮、磷對(duì)脂肪酸、類胡蘿卜素積累的影響較大。氮濃度為55.40 mg·L-1時(shí)UFA有最大積累比例(68.233%)，同時(shí)EPA比例也達(dá)到最大(20.502%)。弱光20 μmol photons·m-2·s-1組葉綠素a占比達(dá)到最大(55.114%)，β-胡蘿卜素在純綠光下有最大比例(48.281%)。高光強(qiáng)200 μmol photons·m-2·s-1組中可溶性糖和蛋白含量最大，表明一定程度的強(qiáng)光會(huì)促進(jìn)可溶性糖和蛋白的積累。