田 潔 王啟璋 鐘啟文

(1 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016；2 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016)

果聚糖由蔗糖與一個或多個果糖基線性或分支型通過β-1，2-糖苷鍵聚合而成，是一種水溶性的非還原性多糖，其相對分子質(zhì)量變化范圍為3 500～5 500[1]。 果聚糖味甜、熱量低，具有調(diào)節(jié)血糖血脂、改善腸道菌群等功能，目前已被多個國家批準(zhǔn)為食品和營養(yǎng)增補劑[2-4]。

大蒜(AlliumsativumL.)又名蒜、胡蒜，為百合科蔥屬植物，是重要的經(jīng)濟作物[5-6]。我國作為最主要的大蒜生產(chǎn)國，其大蒜種植面積、產(chǎn)量及出口額均位居世界之首[7-8]。研究表明，大蒜果聚糖占其干物質(zhì)含量的75%～80%，很大程度上影響著大蒜產(chǎn)品的口感，是收獲期大蒜產(chǎn)品的重要品質(zhì)參數(shù)。大蒜中的果聚糖以聚合度為2～9的低聚果糖為主，包括蔗果三糖、蔗果四糖、新蔗果三糖等[9-10]。大蒜中的低聚果糖能夠促進腸道雙歧桿菌增殖、抑制腸道有害細(xì)菌生長，具有很高的藥用價值和保健功能[11]。因此，果聚糖含量成為影響大蒜風(fēng)味形成及藥理作用的重要指標(biāo)，對其檢測方法的探索需沿著靈敏準(zhǔn)確、快速穩(wěn)定的方向發(fā)展。

目前測定植物果聚糖含量的方法主要包括比色法、試劑盒酶解法、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)及離子色譜法[12-15]等。但比色法對于組分復(fù)雜的果聚糖檢測準(zhǔn)確度不高；試劑盒酶解法價格昂貴且操作步驟復(fù)雜；離子色譜法檢測成本高；HPLC已成為應(yīng)用最廣泛的果聚糖檢測方法，如利用HPLC法能夠測定煙草中單糖或二糖含量[16]、菊芋中聚合度≤5的果聚糖含量[17]以及大蒜中菊糖和聚合度≤4的果聚糖含量[18]。但這些檢測均受到果聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的限制，并未測定聚合度>5的果聚糖含量，無法計算果聚糖總含量。因此，為建立一種快速、經(jīng)濟、高效的大蒜果聚糖總含量測定方法，本試驗利用強酸將不同聚合度的多種大蒜果聚糖徹底水解，在對總糖的提取方法、果聚糖的水解試劑、水解濃度、水解時間和溫度進行單因素試驗篩選的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳降解工藝，對比不同檢測方法，并通過方法學(xué)驗證和品種差異比較，以期確立適宜的果聚糖總量檢測體系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試品種樂都紫皮大蒜及其他10份大蒜資源均取自青海省農(nóng)林科學(xué)院園藝所資源圃，按照常規(guī)方法種植及田間管理。選取新鮮、大小一致的樂都紫皮大蒜鱗莖，經(jīng)蒸餾水清洗后用濾紙擦干，切片，105℃殺青15 min，80℃烘干，粉碎，過40目篩備用。

蔗糖、D-無水葡萄糖、D-果糖的標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；果聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，東京化成工業(yè)株式會社；鹽酸(HCl)、濃硫酸(H2SO4)、三氯乙酸(TCA)、乙醇、氫氧化鈉(NaOH)，均為分析純，天津北辰方正試劑廠。

LC-20A液相色譜儀，日本島津公司；Specord 210 Plus紫外可見分光光度計，德國耶拿分析儀器股份公司；Milli-Q IQ 7000 超純水儀，美國Millipore公司；HH-600數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇大地自動化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 大蒜可溶性總糖提取方法的確定 在4種提取方法下，分別精確稱取1.0 g大蒜鱗莖干樣，每種提取方法設(shè)3份重復(fù)，共計12份樣品。參考宋可珂等[19]和閆訓(xùn)友等[20]的方法按照以下4種方法提取大蒜可溶性總糖。① 熱水提取法：分別在3份鱗莖干樣中加入10 mL雙蒸水，沸水(94℃，西寧，海拔2 261 m)提取30 min，浸提、離心重復(fù)3次，合并3次上清液定容至100 mL；② 超聲波提取法：分別在3份鱗莖干樣中加入25 mL雙蒸水，500 W超聲波下提取15 min，提取溫度為60℃，間歇提取3次，離心合并上清液定容至100 mL；③ 超聲波-熱水提取法：分別在3份鱗莖干樣中加入25 mL雙蒸水，500 W超聲波下提取15 min，提取溫度為60℃，超聲波間歇提取2次后，沸水提取30 min，離心合并上清液定容至100 mL；④ 乙醇提取法：分別在3份鱗莖干樣中加入12 mL 80%乙醇，80℃水浴30 min，溶液冷卻至室溫后，離心取上清液轉(zhuǎn)入容量瓶，再向沉淀中加入12 mL 80%乙醇溶液，80℃水浴30 min，重復(fù)提取2次，合并上清液定容至100 mL。采用蒽酮比色法測定可溶性總糖含量[21]，確定最佳提取方法。

1.2.2 大蒜果聚糖的水解方法及試驗設(shè)計 精確稱取0.84 g大蒜鱗莖干樣3份，分別加入17.4 mL雙蒸水。在樣品提取液中，加入1 mL 3 mol·L-1的HCl。然后利用1.2.1篩選出的最佳方法提取大蒜可溶性總糖并水解果聚糖，水解1 h，冷卻至室溫后，加入1 mL 3 mol·L-1的NaOH及0.6 mL 8.75 mmol·L-1的 Al2(SO4)3溶液平衡pH值，定容至20 mL。以不加強酸未水解的樣品作為對照。反應(yīng)物過0.2 μm微孔濾膜，作為下一步檢測的樣品。①單因素試驗設(shè)計：在 3 mol·L-1HCl煮沸1 h的恒定條件下，以水解試劑類型(HCl、H2SO4和TCA)、水解試劑pH值(pH值0.1、1、2、4)、HCl濃度(1、3、6、9 mol·L-1)、水解時間(0.5、1、2、4 h)和水解溫度(60、70、80℃和沸水)5個影響大蒜果聚糖水解效果的因素做單因素試驗，重復(fù)3 次，確定各因素適宜范圍。②響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案：基于單因素試驗結(jié)果，固定水解試劑類型、水解pH，選取水解溫度、水解試劑濃度和水解時間為主要因素。根據(jù) Box-Behnken 響應(yīng)面法試驗設(shè)計原理及Design-Expert 12軟件建立二次多項式數(shù)學(xué)模型，以水解溫度(A)、水解試劑pH(B)和水解時間(C)為響應(yīng)變量，以大蒜中果聚糖含量為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面中心組合法對大蒜中果聚糖提取工藝的主要參數(shù)進行分析優(yōu)化。

1.3 大蒜果聚糖檢測方法的研究

強酸水解-高效液相色譜法：經(jīng)強酸試劑水解后的及未反應(yīng)的樣品，通過HPLC法測定大蒜果聚糖的含量。測定條件：Shodex SUGAR KS-801串KS-802色譜柱，示差檢測器RID-10A，柱溫80℃，進樣量10 μL；流動相為超純水，流速1 mL·min-1。通過蔗糖、葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)品及外標(biāo)法進行蔗糖、葡萄糖及果糖的定量分析，以mg·g-1DW來表示。按照以下公式計算果聚糖含量(mg·g-1DW)：

果聚糖含量=(S1+G1+F1)-(S0+G0+F0)

式中，S1為水解后蔗糖含量；G1為水解后葡萄糖含量；F1為水解后果糖含量；S0為水解前蔗糖含量；G0為水解前葡萄糖含量；F0為水解前果糖含量。

強酸水解-分光光度計法：參照侯大海等[12]的方法測定果聚糖含量。

1.4 大蒜果聚糖含量測定方法的評價

對篩選得到的果聚糖含量測定方法進行評價，考察該方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率[22-23]。精確稱取一定質(zhì)量的果聚糖標(biāo)準(zhǔn)品及大蒜樣品，按照篩選確立的方法分別測定標(biāo)準(zhǔn)品及樣品中果聚糖含量，重復(fù)6次，根據(jù)所得結(jié)果計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)，考察該測定方法的精密度及重復(fù)性。取精密度試驗中的待測樣品，室溫放置0、1、2、4、8 h后測定果聚糖含量并計算RSD，判斷該測定方法的穩(wěn)定性。分別對相同質(zhì)量的大蒜樣品添加0.2、0.3、0.4 g的果聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，每個添加水平3次重復(fù)，進行加標(biāo)回收率的測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0、Design-Expert 12和SigmaPlot 10.0軟件進行試驗數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對大蒜可溶性總糖含量的影響

由表1可知，通過不同方法提取的大蒜可溶性總糖含量存在差異。熱水提取法所得大蒜總糖含量達(dá)72.67 mg·100mg-1DW，顯著高于其他方法，其次為超聲波法和超聲波-熱水法，二者之間無顯著差異性。乙醇提取法所得大蒜總糖僅為17.40 mg·100mg-1DW。以提取總糖含量為參照，4種方式的提取效率大小關(guān)系為熱水法>超聲波法>超聲波-熱水法>乙醇法。熱水法的提取效率明顯高于其他方法，這可能是由提取溫度差異引起的。為了避免乙醇揮發(fā)、減小超聲過程中的局部高溫高壓[24]，本研究中，超聲波法、超聲波-熱水法以及乙醇法的提取溫度分別為60℃、60℃和80℃，使得大蒜總糖未能充分溶解在溶劑中。因此，熱水提取法是大蒜可溶性總糖的最佳提取方法。

2.2 不同水解條件對大蒜果聚糖降解效果的影響

2.2.1 水解前后大蒜糖組分的HPLC分析及其標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1所示。果聚糖總量的檢測由于受到高聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品純度、成本以及儀器靈敏度的限制，通常無法準(zhǔn)確測定。為了避免高聚果糖的影響，本研究利用強酸將大蒜可溶性總糖徹底水解，降解大蒜果聚糖組分，并利用HPLC法分析，果聚糖水解前后的檢測結(jié)果見圖2。在果聚糖水解前，通過可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)品的比對，檢測到少量的蔗糖、葡萄糖及果糖(圖2-A)；而利用強酸進行水解后，葡萄糖及果糖含量增加，其中果糖的峰面積增加最明顯(圖2-B)，這是因為果聚糖β-1，2-糖苷鍵的斷裂釋放了大量果糖基導(dǎo)致果糖含量明顯升高。

表1 不同提取方法下大蒜可溶性總糖含量差異Table 1 Differences in total sugar content of garlic in different extraction methods

在HPLC檢測體系下，分別將0、0.25、0.5、0.75、1、1.25和1.5 mg·mL-1的蔗糖、葡萄糖及果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣分析，根據(jù)峰面積與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量進行線性回歸，結(jié)果見表2。蔗糖、葡萄糖及果糖標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系良好，決定系數(shù)均達(dá)到0.999以上，可以用于下一步大蒜果聚糖水解產(chǎn)物的含量檢測。

注：Suc：蔗糖；Glu：葡萄糖；Fru：果糖；Inu：菊糖；DP4：蔗果四糖；DP3：1-蔗果三糖。Note: Suc: Sucrose. Glu: Glucose. Fru: Fructose. Inu: Synanthrin. DP4: Nystose. DP3: 1-Kestose.圖1 可溶性糖混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard mixture of soluble sugar

注：A：水解前；B：水解后。Suc：蔗糖；Glu：葡萄糖；Fru：果糖。Note: A: Before hydrolysis. B: After hydrolysis. Suc: Sucrose. Glu: Glucose. Fru: Fructose.圖2 大蒜果聚糖水解前后HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of fructan in garlic before and after hydrolysis

表2 蔗糖、葡萄糖和果糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Table 2 Regression equation of standard curve for standard sucrose, glucose and fructose

2.2.2 不同水解試劑對大蒜果聚糖含量的影響 為了確定水解果聚糖的最適強酸類型，以相同H+濃度的3種強酸作為水解試劑，通過水解前后蔗糖、葡萄糖及果糖的含量差值即可推算大蒜果聚糖的總含量，結(jié)果見表3。利用HCl、H2SO4和TCA水解大蒜可溶性碳水化合物，測得的果聚糖含量分別為641.22、649.10

表3 不同酸水解大蒜果聚糖含量的差異Table 3 The difference of the content of fructan in garlic hydrolyzed by different acids

和649.07 mg·g-1DW，三者無顯著差異，說明強酸類型不是影響大蒜果聚糖水解的主要因素?？紤]到H2SO4脫水性對果糖的破壞以及TCA對植物多糖水解的選擇性，故篩選出HCl作為大蒜果聚糖的水解試劑。

2.2.3 不同pH值對大蒜果聚糖含量的影響 根據(jù)2.2.2的結(jié)果及3種強酸不同的理化性質(zhì)，選擇HCl作為水解試劑進行下一步研究。分別在pH值0.1、1、2、4的HCl下煮沸1 h。由圖3可知，隨著鹽酸pH值升高，大蒜果聚糖含量逐漸降低。pH值為0.1時，果聚糖含量最高(589.80 mg·g-1DW)，顯著高于其他pH值條件下的果聚糖含量。這說明鹽酸pH的降低加速了大蒜果聚糖的水解，原因在于果聚糖分子結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵易被質(zhì)子酸打斷，增強酸性更有利于苷元質(zhì)子化[25]。因此，鹽酸pH值為0.1時果聚糖具有最佳分解效果。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖3 不同pH值下大蒜果聚糖含量差異Fig.3 Differences in fructan content of garlic under different pH value

2.2.4 不同濃度對大蒜果聚糖含量的影響 由2.2.3結(jié)果可知，HCl溶液水解果聚糖的最適pH值為0.1。而當(dāng)HCl濃度≥1 mol·L-1時，溶液pH值均為0.1，因此本試驗進一步研究1、3、6、9 mol·L-1的 HCl溶液對大蒜果聚糖含量的影響。由圖4可知，不同濃度HCl溶液中煮沸水解1 h后，果聚糖含量存在差異。隨著HCl濃度的增加，果聚糖含量先升高后降低。當(dāng)HCl濃度為3 mol·L-1時，果聚糖含量達(dá)最大值(620.47 mg·g-1DW)，而9 mol·L-1HCl水解后推算所得果聚糖含量僅為466.01 mg·g-1DW。這可能是因為果聚糖只有在一定HCl濃度范圍內(nèi)才能水解成單糖，濃度超過閾值，將引起酸性過高導(dǎo)致單糖結(jié)構(gòu)被破壞[10]。因此，3 mol·L-1左右的HCl是大蒜果聚糖水解的最優(yōu)濃度。

圖4 不同HCl濃度下大蒜果聚糖含量差異Fig.4 Differences in fructan content of garlic under different HCl concentration

2.2.5 不同水解時間對大蒜果聚糖含量的影響 以3 mol·L-1的HCl煮沸水解0.5、1、2、4 h為降解條件，果聚糖含量如圖5所示。在水解0.5～1 h，果聚糖含量顯著增加，由455.50 mg·g-1DW急劇上升至620.47 mg·g-1DW。 在水解1 h達(dá)最大值，顯著高于其他水解時間處理；而后(水解2～4 h)果聚糖含量緩慢下降，趨于平穩(wěn)，水解2 h和4 h的果聚糖含量無顯著差異。由此可見，水解時間的延長不一定提高果聚糖的降解程度。這是因為在適宜的酸性條件下，水解1 h即可使大蒜果聚糖完全水解。故水解1 h是大蒜果聚糖的最優(yōu)水解時間。

圖5 不同水解時間下大蒜果聚糖含量差異Fig.5 Differences in fructan content of garlic under different time

2.2.6 不同水解溫度對大蒜果聚糖含量的影響 以3 mol·L-1的HCl在60、70、80和94℃(沸水)不同溫度下水解1 h為水解條件，果聚糖含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。隨著水解溫度從60℃提高至80℃，果聚糖含量由160.37 mg·g-1DW增加至362.53 mg·g-1DW。而將水解試劑煮沸，果聚糖含量達(dá)峰值(620.47 mg·g-1DW)， 顯著高于其他溫度條件。說明溫度的升高有利于糖苷鍵的斷裂。這是因為鹽酸在高溫環(huán)境下氧化性增強，水解速度與溫度條件呈正相關(guān)關(guān)系[26]。因此，94℃(沸水)是大蒜果聚糖的最優(yōu)降解溫度。

圖6 不同溫度下大蒜果聚糖含量差異Fig.6 Differences in fructan content of garlic under different tempreture

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗影響因子篩選確定 基于單因素試驗結(jié)果，確定選取對大蒜果聚糖降解影響較大的水解溫度、HCl濃度和水解時間等3個因素及水平編碼值(表4)。本試驗采用三因素三水平設(shè)計 Box-behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗，并以果聚糖含量測定值為評價指標(biāo)，篩選果聚糖最優(yōu)水解條件[27]。

表4 因素與水平表Table 4 Orthogonal experimental factors and level table

2.3.2 響應(yīng)面設(shè)計試驗優(yōu)化 利用DesignExpert 12軟件分別設(shè)12組析因試驗和5組中心試驗，對表5的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合[28]，擬合得到二次響應(yīng)面回歸模型為果聚糖含量(mg·g-1DW)=393.45+169.05A+38.9B+32.26C-55.70AB-37.63AC+43.44BC+28.57A2-38.20B2+39.70C2。

2.3.3 響應(yīng)因素水平的優(yōu)化 圖7為各因素之間交互作用的等高圖和三維曲面圖，通過分析兩兩因素間的交互作用對果聚糖含量的影響效應(yīng)，從而確定最佳試驗組合。三維曲面圖能直觀反映各因素間的交互作用，響應(yīng)面越平緩，表明該因素對果聚糖含量的影響越小，反之說明該因素對果聚糖含量的影響更顯著[30]。圖7-A～B表示HCl濃度和水解溫度之間的交互效應(yīng)，果聚糖含量隨著水解溫度的升高而增大；但是隨著HCl濃度的升高，果聚糖含量在HCl濃度達(dá)到3 mol·L-1以后逐漸下降，這可能是過高的酸濃度導(dǎo)致糖組分的碳化所致，與單因素試驗結(jié)果一致。圖7-C～D是水解時間和水解溫度間的交互作用，果聚糖含量隨著水解溫度的升高而升高，而水解時間的延長對果聚糖含量的升高無明顯促進作用。圖7-E～F為水解時間和HCl濃度之間的交互效應(yīng)，隨著水解時間的延長，果聚糖含量增長緩慢，說明水解時間的延長對果聚糖含量的升高促進效果較?。煌瑫rHCl濃度達(dá)到3 mol·L-1左右時響應(yīng)面中間部分呈現(xiàn)凸起趨勢，兩端呈現(xiàn)下降趨勢，說明3 mol·L-1的HCl是水解果聚糖的最佳條件。

表 5 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果Table 5 Response surface test design results

2.3.4 最優(yōu)工藝參數(shù)確定及驗證 利用響應(yīng)面分析確定大蒜果聚糖含量。最優(yōu)工藝參數(shù)為水解溫度89.758℃、HCl濃度3.229 mol·L-1、水解時間1.138 h，此試驗組合果聚糖含量預(yù)測值為627.903 mg·g-1FW。 為便于試驗操作，將上述優(yōu)化試驗組合調(diào)整為水解溫度90℃、HCl濃度3 mol·L-1、水解時間 1 h。 經(jīng)過3次平行重復(fù)試驗測得果聚糖含量為620.470 mg·g-1FW，模型預(yù)測值與真實測定值之間差異不顯著(P<0.05)，從而驗證了該模型及優(yōu)化工藝參數(shù)的可靠性。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance for regression model

圖7 各因素交互作用響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of process conditions on the extraction rate of flavonoids

2.4 不同測定方法對大蒜果聚糖含量檢測效果的影響

利用分光光度計法、高效液相色譜法檢測大蒜果聚糖的含量。結(jié)果表明(表7)，通過強酸水解后，不同檢測方法下果聚糖的含量差異顯著。HCl水解-高相液相色譜法下果聚糖含量達(dá)到669.73 mg·g-1DW，顯著高于分光光度計檢測法。這是因為分光光度計法基于不同類型的衍生反應(yīng)，只能檢測到少數(shù)糖類，對于組分復(fù)雜的果聚糖檢測準(zhǔn)確度和靈敏度不高。綜上，強酸水解-高效液相色譜法所測得的果聚糖含量最高，即可達(dá)到相對較好的檢測效果。

2.5 大蒜果聚糖水解及含量檢測的方法學(xué)驗證

2.5.1 線性關(guān)系及檢出限 稱取不同質(zhì)量的果聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(菊糖)，在上述篩選確定的最優(yōu)條件下，水解果聚糖標(biāo)準(zhǔn)品并測定其含量。以測得峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，建立果聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=706.57x+16.168，R2=0.999 7，果聚糖標(biāo)

表7 不同測定方法大蒜果聚糖含量差異Table 7 Differences in the content of fructan from garlic in different detection methods

準(zhǔn)品在0.5～50 mg·mL-1間線性關(guān)系良好，檢出限為0.01 mg·mL-1，相關(guān)系數(shù)大于0.999，表明該水解工藝及含量測定方法靈敏度高。

2.5.2 精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性 將20 mg·mL-1的果聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液按上述篩選獲得的最優(yōu)方法水解，重復(fù)進樣6次，其果聚糖含量的RSD是1.23%，表明該方法的精密度良好。稱取0.84 g樂都紫皮大蒜樣品按上述方法水解，重復(fù)6次，其果聚糖含量的RSD是0.83%，表明該水解及含量檢測方法重復(fù)性較好；同一份果聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的檢測樣品分別在0、1、2、4、8 h內(nèi)檢測，RSD為0.20%，穩(wěn)定性良好。

2.5.3 回收率 取3份樂都紫皮大蒜樣品，分別加入高(1.00 g)、中(0.30 g)、低(0.01 g)3個質(zhì)量的果聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在加標(biāo)回收率的測定中，樣品果聚糖平均回收率為98.45%～101.04%，RSD為0.59%～1.75%(表8)，表明樣品水解過程中損失少，該方法回收率良好。綜合以上方法學(xué)驗證結(jié)果，說明該水解及檢測方法準(zhǔn)確性較高，試驗結(jié)果可靠，可用于大蒜果聚糖含量的定量分析。

表8 大蒜樣品果聚糖加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 8 Recovery rates of fructan in garlic samples

2.6 不同大蒜品種果聚糖含量的測定

利用建立的大蒜果聚糖含量測定方法，對10份大蒜品種按上述最優(yōu)方法進行水解及果聚糖含量檢測，結(jié)果如圖7所示。不同大蒜品種的果聚糖含量在448.82～677.86 mg·g-1DW之間，大多數(shù)品種間差異顯著。說明該方法可檢測不同大蒜資源果聚糖含量差異，可作為大蒜果聚糖含量的定量分析方法。

圖8 不同品種大蒜果聚糖含量差異Fig.8 Difference of fructan content among different varieties of garlic

3 討論

大蒜是一種藥食兼用蔬菜，營養(yǎng)物質(zhì)和功效成分豐富。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜鱗莖富含多糖、低聚糖和單糖等碳水化合物，其中大蒜多糖種類多樣，包括半乳聚糖、果聚糖以及雜多糖等[31]。果聚糖作為大蒜多糖中含量最高的產(chǎn)量因子及活性成分，約占大蒜糖類物質(zhì)的96%[32]，對大蒜產(chǎn)品的品質(zhì)及保健功效具有較大影響。然而，大蒜果聚糖組分多樣，包含了1-蔗果三糖、1-蔗果四糖等聚合度(degree of polymerization, DP)<10的低聚果糖[33]以及部分DP=58的菊糖型果聚糖新生系列[34]，而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，如索慧[10]發(fā)現(xiàn)大蒜果聚糖的分支度≥17%。以上特征導(dǎo)致糖鏈長、分支多的果聚糖混合物難以被常規(guī)離子交換或氣相層析等方法區(qū)分，分離純化難度極大，迄今尚無果聚糖含量統(tǒng)一有效的測定方法。因此建立一種快速、方便、準(zhǔn)確的大蒜果聚糖含量檢測體系顯得尤為重要。

目前，HPLC法是檢測植物果聚糖含量最常用的方法，研究人員利用果聚糖標(biāo)準(zhǔn)品能夠?qū)π》肿拥牡途厶沁M行定量分析[35-38]。而果聚糖總量的檢測由于受到了高聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品純度、成本以及儀器靈敏度的限制，常無法準(zhǔn)確測定。為了避免高聚果糖的影響，本研究在青海省蔬菜遺傳與生理實驗室前期建立的大蒜果聚糖測定方法[39]基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化，提取大蒜可溶性總糖后，利用強酸將不同聚合度的多種大蒜果聚糖徹底水解，通過水解前后雙糖及單糖(蔗糖、葡萄糖、果糖)含量差值的計算，能夠快速簡便地檢測大蒜組織中所有果聚糖的總含量。

為了將大蒜組織中所有果聚糖徹底水解，本研究首先將大蒜可溶性糖充分提取，對大蒜總糖的提取方法進行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱水提取法下大蒜總糖含量最高，提取效果明顯優(yōu)于超聲波、超聲波-熱水以及乙醇提取法，這是因為大蒜可溶性糖在水中具有較高的溶解性，并且溶解度會隨著溫度的升高而增大[40]，這與陳秀枝等[41]利用熱水浸提法從菊粉中提取果聚糖的研究結(jié)果一致。同時，本研究利用單因素試驗分別考察了水解強酸類型、水解方式和反應(yīng)時間等對大蒜果聚糖的降解效果。在篩選果聚糖水解試劑方面，通過對比3種強酸(HCl、H2SO4及TCA)對大蒜果聚糖的降解效果發(fā)現(xiàn)，在強酸的H+濃度達(dá)到一定值時，推算得到的大蒜果聚糖含量處于同一水平，說明強酸類型不是影響大蒜果聚糖水解的主要因素。但H2SO4具有強脫水性，可能會碳化蔗糖[42]、破壞果糖，高溫下(70℃)H2SO4會使果糖分解為5-羥甲基糠醛[10]；而TCA對植物細(xì)胞壁多糖、糖胺聚糖和糖蛋白的水解具有專一性，利用TCA作為水解強酸，大蒜多糖可能水解不完全[43]。鑒于H2SO4的脫水性以及TCA的水解選擇性，故篩選出HCl作為果聚糖的水解試劑。為了進一步確定果聚糖的最佳降解條件，對HCl水解的pH、時間及濃度進行了單因素篩選，發(fā)現(xiàn)3 mol·L-1HCl 對果聚糖的降解效果明顯優(yōu)于高濃度(>3 mol·L-1)， 且水解時間的延長并不能提高水解度。這是因為在密閉的高溫條件下，HCl的氧化性和強酸性易使大蒜果聚糖的糖苷鍵斷裂。HCl水解速度會隨著溫度升高和HCl濃度的增大而加快。但大蒜果聚糖只在一定的酸濃度以及適當(dāng)?shù)臏囟群蜁r間下，才水解為果糖和葡萄糖，否則過度水解將會破壞單糖的結(jié)構(gòu)，故水解時間的延長并不一定會提高水解效率。本研究中，利用3 mol·L-1HCl水解1 h即可使大蒜果聚糖完全水解。這與于淑娟等[44]針對甜菜果膠中性糖的水解研究結(jié)果類似?？紤]到果聚糖降解受到水解溫度、HCl濃度、水解時間等因素的協(xié)同影響，本研究利用響應(yīng)面分析進一步對降解工藝進行了優(yōu)化，最終確定大蒜果聚糖最佳水解工藝條件為水解溫度90℃、HCl濃度3 mol·L-1、水解時間1 h。

為了進一步篩選果聚糖降解產(chǎn)物的檢測方式，本研究對比了分光光度法和酸解-高效液相(HPLC)法，發(fā)現(xiàn)HCl水解-HPLC法下檢測的果聚糖含量更高。這是由于HPLC法具有靈敏度高、檢出限低、分離效果好等優(yōu)點。經(jīng)過方法學(xué)驗證，結(jié)果顯示本方法精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性良好，三者的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于1.5%；平均回收率為98.45%～101.04%，其RSD為0.59%～1.75%。說明本研究篩選確立的檢測方法準(zhǔn)確性較高，試驗結(jié)果可靠，適用于大蒜果聚糖含量的測定分析，這將為大蒜果聚糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究建立了大蒜果聚糖的水解和定量檢測方法，通過熱水法提取大蒜可溶性總糖后，利用3 mol·L-1HCl 90℃反應(yīng)1 h徹底水解大蒜組織中不同聚合度的果聚糖，再通過高效液相色譜法檢測水解前后蔗糖、葡萄糖和果糖含量并計算差值，即可得到大蒜組織中所有果聚糖的總含量。本方法準(zhǔn)確性較高、結(jié)果可靠、簡便快速，適用于大蒜組織果聚糖總含量的測定分析。