廖 森，方正武，胡文靜，王書平，王曉玲，吳榮林，江 偉，高德榮

(1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北荊州 434025；2.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部長江大學(xué)中下游小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225007)

小麥(L)是世界上播種面積最大、分布最廣的糧食作物。但目前各種病害嚴(yán)重影響了小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，其中赤霉病是小麥的主要病害之一。小麥赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是由禾谷鐮孢菌()、亞洲鐮孢菌()等多種鐮孢菌引起的一種世界性真菌病害，在中國主要發(fā)生在長江中下游冬麥區(qū)、東北春麥區(qū)東部和華南冬麥區(qū)，該病害受溫度和濕度影響較大。該病害在小麥整個(gè)生育期均可發(fā)生，會(huì)導(dǎo)致小穗形成枯白穗，引起籽粒發(fā)霉干癟，也會(huì)造成麥株基部變褐腐爛。在赤霉病菌積累的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)等毒素，對(duì)人畜健康危害較大，會(huì)引起發(fā)燒、惡心、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)。

近年來，隨著氣候和耕作制度的變化，赤霉病流行面積不斷擴(kuò)大。2012-2015年度江蘇省赤霉病年平均發(fā)生面積約120萬hm。培育和廣泛種植抗赤霉病品種是目前防控赤霉病最安全和有效的措施。目前已經(jīng)正式命名的抗赤霉病基因僅有7個(gè)(～)，其中、、和來源于普通小麥，、和來源于小麥遠(yuǎn)緣種質(zhì)。、、、和屬于抗擴(kuò)展類型，和屬于抗侵染類型。位于3B染色體短臂上的是國內(nèi)外公認(rèn)的主效抗赤霉病基因，貢獻(xiàn)率達(dá)20%～30%。除上述抗病基因外，研究人員也發(fā)掘出一些抗赤霉病QTL，其中的抗病效應(yīng)較大，并且在長江中下游小麥品種(系)中分布較為廣泛。這些小麥抗赤霉病基因/QTL為小麥抗赤霉病育種奠定了基礎(chǔ)。19世紀(jì)70年代起，中國小麥赤霉病研究協(xié)作組利用抗赤霉病基因/QTL對(duì)3萬多份小麥品種進(jìn)行了赤霉病抗性鑒定，篩選出蘇麥3號(hào)、望水白、翻山小麥、荊州1號(hào)、武漢1號(hào)等抗性較好的品種。袁謙等對(duì)27份小麥種質(zhì)資源進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)3份材料在單花滴注和噴霧接種條件下對(duì)赤霉病抗性均表現(xiàn)為中抗以上。黃杰等從204份小麥品種(系)中僅發(fā)現(xiàn)4份中抗赤霉病的材料。常蕾等發(fā)現(xiàn)，56份淮北小麥品系中僅有2份對(duì)赤霉病表現(xiàn)為中抗，41份淮南品系中有15份表現(xiàn)為中抗及以上水平。胡中澤等連續(xù)3年對(duì)不同小麥品種(系)的赤霉病抗性、豐產(chǎn)性以及DON毒素含量進(jìn)行比較，最終篩選出3份適宜蘇中地區(qū)種植的高產(chǎn)、抗赤霉病小麥品種(華麥7號(hào)、寧麥13和揚(yáng)麥21)。以上研究結(jié)果說明，從整體上看，小麥抗赤霉病材料缺乏，開展抗赤霉病品種(系)的篩選對(duì)小麥抗赤霉病育種具有十分重要的意義。

本研究對(duì)江蘇省59份小麥品種(系)進(jìn)行赤霉病抗擴(kuò)展鑒定，同時(shí)利用與、、、基因和位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記對(duì)供試材料進(jìn)行檢測，明確其抗病基因組成，并連續(xù)兩年對(duì)赤霉病抗性達(dá)到穩(wěn)定中抗水平的品種(系)進(jìn)行產(chǎn)量和相關(guān)農(nóng)藝性狀調(diào)查，篩選抗赤霉病的優(yōu)良小麥品種(系)，以期為小麥抗赤霉病育種提供材料來源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為來源于江蘇省的59份小麥品種(系)，分別以蘇麥3號(hào)、揚(yáng)麥158、揚(yáng)麥15和安農(nóng)8455作為高抗、中抗、中感和高感赤霉病對(duì)照品種。

禾谷鐮孢菌菌株(F0301、F0609、F0980和F1312)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所陳懷谷研究員惠贈(zèng)。

1.2 田間試驗(yàn)

供試小麥材料于2016—2017和2017—2018年度在江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所小麥試驗(yàn)基地種植，設(shè)計(jì)2個(gè)重復(fù)。每個(gè)品種(系)種植2行，行長1.5 m，行距0.3 m，每行種植30粒種子，土質(zhì)為沙壤土，前茬作物為水稻，肥力中等，田間管理如施肥、除草、灌溉和蟲害防治同常規(guī)育種田。

1.3 赤霉病抗性鑒定

參照Yu等的方法制備禾谷鐮刀菌孢子懸浮液(1×10～5×10個(gè)·mL)。采用單花滴注接種法，于小麥揚(yáng)花期，使用微量移液器吸取10 μL的孢子懸浮液注入到麥穗中部小穗內(nèi)，每行品種(系)隨機(jī)接種10個(gè)小穗，定期人工噴霧保濕。接種21 d后調(diào)查接種小麥病小穗數(shù)，并計(jì)算病小穗率。病小穗率(PDS)=發(fā)病小穗數(shù)/總小穗數(shù)×100%?？剐栽u(píng)價(jià)以對(duì)照品種為標(biāo)準(zhǔn)，劃分為高抗(HR)、中抗(MR)、中感(MS)、高感(S)品種，具體分類標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 小麥赤霉病抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criterion of resistance to Fusarium head blight

1.4 抗病基因檢測

1.4.1 DNA提取

每個(gè)品種(系)取5粒種子，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，定期噴水，培養(yǎng)一周后取小麥嫩葉置于2 mL試管中，采用CTAB法提取基因組DNA，DNA干燥后加入1×TE(Tris-EDTA buffer solution)溶液溶解，放入4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.4.2 分子標(biāo)記檢測

基因檢測采用Su等設(shè)計(jì)的KASP標(biāo)記TaHRC-Kasp(表2)，參考Rasheed等的檢測方法，以蘇麥3號(hào)為陽性對(duì)照，將位點(diǎn)呈抗病基因型的品種記為“+”，其他記為“-”。、、基因檢測采用南京農(nóng)業(yè)大學(xué)馬正強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)提供的引物序列，側(cè)翼標(biāo)記分別為Wmc398和Wgrb969、Gwm513和Gwm149、Mag9482和Wmc752(表2)，以望水白為陽性對(duì)照。位點(diǎn)側(cè)翼標(biāo)記參考Somers等開發(fā)的標(biāo)記，以揚(yáng)麥158為陽性對(duì)照，側(cè)翼標(biāo)記為Gwm539和Wmc41。、、和的PCR反應(yīng)體系均為10 μL，包含5.0 μL 2×Taq Master Mix(P114-03，中國南京諾唯贊生物科技有限公司)、上下游引物(濃度均為10 μmol·L)各0.1 μL，DNA模板(50 ng·μL)1.0 μL，ddHO 3.8 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s、退火溫度根據(jù)各引物設(shè)定(表2)、72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用8%(w/v)的非變性聚丙烯酰胺凝膠，在1×TEB緩沖液200V電壓下電泳(不同引物時(shí)間不同)，銀染顯色觀察。若待測品種(系)的、和側(cè)翼標(biāo)記帶型與望水白一致，記為“+”，否則記為“-”。若待測品種(系)的側(cè)翼標(biāo)記帶型與揚(yáng)麥158一致，記為“+”，否則記為“-”。同一抗病基因/QTL的2個(gè)側(cè)翼標(biāo)記檢測均為“+”，推測該品種(系)可能攜帶該抗病基因/QTL。

表2 抗赤霉病基因/QTL連鎖的分子標(biāo)記Table 2 Molecular markers linked to FHB resistance genes/QTL

1.5 農(nóng)藝性狀調(diào)查

2019年秋，將2016-2017和2017-2018兩個(gè)年度的赤霉病抗性鑒定結(jié)果均為中抗及以上水平的供試品種(系)種植于江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所小麥試驗(yàn)基地，以長江中下游區(qū)試對(duì)照品種揚(yáng)麥20為農(nóng)藝性狀參考品種，每個(gè)品種(系)種植6行，行長1.5 m，行距0.3 m，每行種植約30粒種子，按照當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)栽培措施進(jìn)行田間管理。于2020年待小麥成熟時(shí)，每行隨機(jī)選取5個(gè)單株，調(diào)查其主莖株高、穗長、穗粒數(shù)和小穗數(shù)，并計(jì)算其平均值。每個(gè)品種(系)混合收獲后取500粒種子稱重，重復(fù)3次，取其平均值后轉(zhuǎn)化為千粒重。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥品種的赤霉病抗性鑒定結(jié)果

經(jīng)連續(xù)2年田間赤霉病抗性鑒定，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，除蘇麥3號(hào)外，供試材料中沒有發(fā)現(xiàn)免疫或高抗赤霉病的品種(系)。與對(duì)照品種蘇麥3號(hào)、揚(yáng)麥158、揚(yáng)麥15、安農(nóng)8455相比，19份小麥品種(系)在兩個(gè)年度均表現(xiàn)為中抗赤霉病，平均病小穗率為14.68%～25.06%；20份小麥品種(系)在兩個(gè)年度均表現(xiàn)為中感赤霉病，平均病小穗率為29.25%～45.01%；5份小麥品種(系)在兩個(gè)年度均表現(xiàn)為高感赤霉病，平均病小穗率為55.74%～71.98%。高感赤霉病的品種均為徐麥品種(系)，其中徐麥14017感病最嚴(yán)重，平均病小穗率達(dá)到71.98%。

2.2 抗赤霉病基因的分子檢測結(jié)果

分子標(biāo)記檢測結(jié)果(表3)表明，59份供試小麥品種(系)中，鎮(zhèn)麥12、寧麥1526、E1192等15份小麥品種(系)攜帶；寧麥27和E1192攜帶；寧麥27、寧麥17097和寧麥17001攜帶；揚(yáng)糯麥1號(hào)、寧麥27、揚(yáng)輻麥11號(hào)等15份小麥品種(系)攜帶；未檢測到攜帶的品種(系)。

表3 59份小麥品種(系)的抗赤霉病鑒定及其基因/QTL的分子檢測結(jié)果Table 3 Results of FHB resistance identification and genes/QTL detection in 59 wheat cultivars(lines)

(續(xù)表3 Continued table 3)

經(jīng)單小花滴注接種鑒定為中抗赤霉病的19份小麥品種(系)中，鎮(zhèn)麥12、寧麥1526、E1192等9份品種(系)攜帶，其中E1192除攜帶外，還攜帶；徐麥17252和寧麥17329除攜帶外，還攜帶。揚(yáng)糯麥1號(hào)、揚(yáng)輻麥11號(hào)和揚(yáng)麥173046僅攜帶，寧麥27除攜帶外，還攜帶和。有6份品種(系)未檢測到所檢測基因/QTL。所有中抗赤霉病品種均不攜帶。

2.3 中抗赤霉病供試品種(系)的農(nóng)藝性狀

以長江中下游區(qū)試對(duì)照品種揚(yáng)麥20為農(nóng)藝性狀參考品種，評(píng)價(jià)19份中抗赤霉病小麥材料的農(nóng)藝性狀。在千粒重方面，鎮(zhèn)麥12、寧麥1529、寧麥27等8份小麥品種(系)顯著高于揚(yáng)麥20，揚(yáng)糯麥1號(hào)、K122、E1192等8份小麥品種(系)顯著低于揚(yáng)麥20；在株高方面，寧麥1526和寧麥15219顯著高于揚(yáng)麥20，僅徐麥17252顯著低于揚(yáng)麥20；在穗長方面，寧麥27、揚(yáng)輻麥11號(hào)和寧麥15219顯著大于揚(yáng)麥20，揚(yáng)糯麥1號(hào)、K122、徐麥17252等5份小麥品種(系)顯著小于揚(yáng)麥20；在穗粒數(shù)方面，寧麥27、揚(yáng)輻麥11號(hào)、鎮(zhèn)麥13322等4份小麥品種(系)顯著高于揚(yáng)麥20，寧麥1526和徐麥17252顯著低于揚(yáng)麥20；在小穗數(shù)方面，僅揚(yáng)麥173046顯著大于揚(yáng)麥20，其他小麥品種(系)與揚(yáng)麥20無顯著差異；在小穗密度方面，揚(yáng)糯麥1號(hào)、K122、徐麥17252等5份小麥品種(系)顯著大于揚(yáng)麥20，寧麥27、寧麥1526、E1192等11份小麥品種(系)顯著低于揚(yáng)麥20(表4)。綜上，鎮(zhèn)麥12號(hào)、寧麥1529、寧麥27、鎮(zhèn)麥13322、寧麥17110、鎮(zhèn)麥13、寧麥17108和寧麥17396對(duì)赤霉病表現(xiàn)為中抗且農(nóng)藝性狀優(yōu)良，可以作為小麥抗赤霉病遺傳改良的有效資源。

表4 中抗赤霉病小麥材料的農(nóng)藝性狀Table 4 Evaluation on agronomic traits of wheat cultivars(lines)with moderately resistance to FHB

3 討 論

3.1 抗赤霉病基因/QTL的效應(yīng)分析

小麥赤霉病抗性是典型的數(shù)量遺傳性狀，受主效基因和微效基因共同控制，以加性效應(yīng)為主。是目前效應(yīng)最大的抗赤霉病基因，本研究59份供試材料中僅有10份僅攜帶，兩年度平均病小穗率為22.21%。有9份小麥品種(系)僅攜帶，兩年度平均病小穗率為 27.82%，一般情況下，的抗性效應(yīng)普遍高于，這與前人的研究結(jié)論一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，某些僅攜帶的品種(系)赤霉病抗性低于僅攜帶的品種(系)，這表明赤霉病抗性基因的效應(yīng)可能需要在一定的遺傳背景下才能表現(xiàn)出來，這與Buerstmayr等的研究結(jié)果一致。寧麥27不攜帶，但攜帶、和，兩年度平均病小穗率為16.28%，低于大多數(shù)僅攜帶的品種(系)，這說明聚合多個(gè)抗赤霉病基因/QTL也可以提高赤霉病抗性水平，甚至超過抗赤霉病主效基因發(fā)揮的作用。蘇麥3號(hào)是公認(rèn)的高抗赤霉病品種，抗赤霉病側(cè)翼標(biāo)記檢測結(jié)果顯示，該品種同時(shí)攜帶了、、和，這也說明聚合不同抗病基因/QTL是增強(qiáng)小麥赤霉病抗性水平的有效途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，寧麥1529、鎮(zhèn)麥13322、K122、寧麥17320、寧麥17110和寧麥15219不含本研究所檢測的基因/QTL，但它們的赤霉病抗性在兩個(gè)年度均能達(dá)到中抗水平，目前也尚未有這些品種(系)赤霉病抗性基因/QTL的報(bào)道，說明這些材料可能攜帶其他赤霉病抗性基因/QTL。供試品種(系)中僅有少部分品種(系)攜帶、和基因，原因可能是現(xiàn)有標(biāo)記不能有效檢測出這些基因，或者這些品種(系)中不攜帶這些基因。

3.2 抗赤霉病基因/QTL的來源分析

最早從蘇麥3號(hào)和望水白中發(fā)掘出來，、和最早從望水白中發(fā)掘出來。本研究供試材料中，徐麥17252、鎮(zhèn)麥8號(hào)、寧麥17329和寧麥17342同時(shí)攜帶和，除寧麥17342外，均為赤霉病抗性相對(duì)較好的品種(系)。根據(jù)系譜分析發(fā)現(xiàn)，徐麥17252赤霉病抗性基因/QTL來源于抗赤霉病材料H35；鎮(zhèn)麥8號(hào)是由揚(yáng)麥158和寧麥9號(hào)雜交選育出的品種，已有研究表明，揚(yáng)麥158及其衍生品種(系)大多數(shù)攜帶，寧麥9號(hào)及其衍生品種(系)大多數(shù)攜帶基因，并且寧麥9號(hào)是長江中下游麥區(qū)的來源。因此，鎮(zhèn)麥8號(hào)的抗病基因/QTL來源于寧麥9號(hào)和揚(yáng)麥158。寧麥17329和寧麥17342均是揚(yáng)麥20和寧麥14雜交產(chǎn)生的后代，而揚(yáng)麥20和寧麥14分別具有揚(yáng)麥158和寧麥9號(hào)的血緣，故推測寧麥17329和寧麥17342的抗病基因/QTL也分別來源于寧麥9號(hào)和揚(yáng)麥158。

3.3 抗赤霉病種質(zhì)資源的篩選

本研究通過2年田間環(huán)境，對(duì)江蘇59份小麥品種(系)利用單花滴注法鑒定赤霉病抗性，篩選出19份中抗赤霉病的小麥材料，除蘇麥3號(hào)外，沒有發(fā)現(xiàn)高抗赤霉病的材料，說明近年來小麥抗赤霉病遺傳育種雖然進(jìn)展迅速，但是該地區(qū)還未在大范圍內(nèi)育成高抗赤霉病的品種(系)，且小麥育種專家們選育出的大部分抗赤霉病材料農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀較欠缺，因此小麥抗赤霉病遺傳改良的途徑和方法仍需要突破。胡文靜等對(duì)長江中下游小麥品種進(jìn)行赤霉病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)一些農(nóng)藝性狀優(yōu)良且抗性相對(duì)較好的品種，且主要以揚(yáng)麥品種為主。小麥赤霉病抗性是典型的數(shù)量遺傳性狀，易受外界環(huán)境影響，育種上僅依靠少數(shù)抗性基因很難取得較大的突破，加上大多數(shù)抗性基因的來源是農(nóng)藝性狀較差的地方品種、早期改良品種和外源種質(zhì)，因此篩選優(yōu)良和有效的抗性種質(zhì)資源仍然是抗赤霉病遺傳改良的首要環(huán)節(jié)。本研究經(jīng)過連續(xù)2年的赤霉病抗擴(kuò)展鑒定和1年的農(nóng)藝性狀考察，明確鎮(zhèn)麥12、寧麥1529、寧麥27、鎮(zhèn)麥13322、寧麥17110、鎮(zhèn)麥13、寧麥17108和寧麥17396對(duì)赤霉病表現(xiàn)為中抗且農(nóng)藝性狀優(yōu)良，可以作為小麥抗赤霉病遺傳改良的有效資源。

致謝：感謝江蘇省農(nóng)科院姚金保研究員、吳紀(jì)中研究員對(duì)本研究供試材料的饋贈(zèng)，感謝長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院賈寶森、肖朋飛同學(xué)對(duì)本研究的幫助。