馮舉伶,姚立蓉，汪軍成，司二靜，楊 軻，李葆春，孟亞雄，馬小樂，尚勛武，王化俊

(1.省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農業(yè)大學農學院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院，甘肅蘭州 730070)

小麥(L.)是我國主要糧食作物之一，產量高低與國民經濟和國家糧食安全息息相關。隨著全球變暖的加劇，干旱已成為制約農業(yè)生產的主要生態(tài)因子，干旱缺水所造成的作物減產遠遠超過其他非生物限制因素的總和，因而開展小麥抗旱性研究對農業(yè)生產具有重要意義。種子萌發(fā)是植物生長發(fā)育的起始階段，易受機械損傷、病害和環(huán)境脅迫的影響，被認為是植物生命周期中最關鍵的階段。種子在干旱脅迫下能否正常萌發(fā)直接影響小麥出苗的快慢和質量，進而決定基本苗數及群體結構，并最終影響產量的形成。因此，研究干旱脅迫對小麥種子萌發(fā)的影響對小麥抗旱遺傳育種和高產栽培具有指導作用。

在干旱、鹽堿、高溫等非生物脅迫下，植物會啟動一系列相應的耐逆機制來抵御環(huán)境脅迫。在此過程中，植物各種功能基因和調節(jié)蛋白的表達量幾乎都會發(fā)生變化。小麥在抵御干旱脅迫的過程中，轉錄因子起到了至關重要的作用。在眾多植物轉錄因子中，NAC轉錄因子具有多種功能，參與植物生長發(fā)育調節(jié)及逆境脅迫響應等，目前已有大量該轉錄因子類基因被克隆研究。如從小麥中克隆的轉錄因子被導入擬南芥后，轉基因植株的抗旱耐鹽能力得到了提高。也有研究揭示了轉錄因子在PEG、NaCl和ABA脅迫下均上調表達，說明在非生物脅迫應答機制上起著重要作用。C2結構域蛋白(C2 domain protein，C2DP)是一類在真核生物中廣泛存在的鈣依賴性結合蛋白，這些蛋白在結構上具有高度的保守性，可參與一系列信號傳導及細胞膜轉運調控過程等。小麥基因在ABA、PEG、溫度等脅迫誘導下均顯著上調表達，因而推測基因也可能參與非生物脅迫的抗性反應。胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant protein，LEA蛋白)是一類在種子胚胎發(fā)育后期大量富集的脫水保護因子，可以清除逆境條件下植物體內產生的大量活性氧自由基以及作為調節(jié)蛋白參與滲透調節(jié)等。從小麥中克隆到的基因受外源ABA、干旱、高鹽等脅迫誘導表達，且其轉基因擬南芥比野生型更耐旱。基因在小麥的根、莖、葉等組織受到非生物脅迫誘導時也能大量表達，并且對細胞起到保護作用。半胱氨酸蛋白酶(CP)作為蛋白水解酶之一，對植物同樣至關重要。除了蛋白酶水解以增加植物的抗性外，有些CP還能加快葉片衰老速度和提高植物在不良環(huán)境下的敏感性等。在小麥蛋白酶家族中，TaCP是主要上調表達的植物蛋白酶，以此來應對干旱、鹽堿、高溫等多重脅迫壓力。α-淀粉酶(α-AMY)是植物淀粉酶中應用范圍最廣的一類，在禾谷類種子萌發(fā)過程中起主導酶作用，淀粉是禾谷類種子的主要成分，因此禾谷類種子萌發(fā)可以看作是淀粉降解的一個過程。小麥基因在干旱脅迫下會上調表達。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是植物體內清除活性氧自由基的主要酶，可抵御膜損傷。其與植物抗逆性緊密相關，可用來反映氧化脅迫傷害程度和評價植物的抗逆能力，故對GPXs基因的研究對于提高植物抗逆性具有重要意義。然而，目前關于GPXs的研究多集中在動物組織或細胞中，而對于非生物脅迫下基因表達特性的研究還未見相關報道。

本研究以20% PEG6000溶液模擬干旱脅迫，對119份春小麥材料萌發(fā)期的種子發(fā)芽勢、種子發(fā)芽率、根鮮重、根干重、苗鮮重、苗干重、葉鮮重、葉干重、根長和苗長等指標進行測定分析，以期篩選出抗旱型與干旱敏感型小麥類型；并進一步分析與抗旱相關基因、、、、和在抗旱型與敏感型材料萌發(fā)期響應干旱脅迫的表達特征，以驗證抗旱材料篩選的準確性，以期為后續(xù)選育抗旱新品種提供種質資源，為小麥抗旱機理研究提供材料支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

119份春小麥種質材料(表1)，由省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室/甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室麥類種質創(chuàng)新課題組提供。

表1 119份春小麥種質材料名稱及編號Table 1 Name and code of 119 spring wheat germplasms

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發(fā)和形態(tài)指標測定

選取上述119份春小麥材料中飽滿、大小均勻的種子若干，清洗好后均勻擺放于墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中于室溫條件下進行萌發(fā)，用20% PEG6000溶液對種子進行干旱脅迫處理，以蒸餾水作為對照。培養(yǎng)3 d后測定種子發(fā)芽勢；培養(yǎng) 7 d后測定種子發(fā)芽率，并選取長勢均一的幼苗20株測定根鮮重、根干重、苗鮮重、苗干重、葉鮮重、葉干重、根長和苗長等指標，3次重復。

1.2.2 小麥抗旱相關基因的表達量分析

RNA提取與檢測以篩選出的2份抗旱型種質和2份干旱敏感型種質為材料，按上述方法用蒸餾水連續(xù)萌發(fā)7 d后再用20% PEG6000溶液進行不同時長(0 h、1 h、6 h、12 h、24 h)脅迫處理，對根、葉組織采樣并迅速置于液氮中，于 -70 ℃保存?zhèn)溆?。用RNA Simple Total RNA Kit(TIANGEN，北京)提取上述組織的總RNA，具體操作步驟參考說明書進行，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，通過核酸測定儀測定RNA的濃度和純度。

cDNA第一鏈合成運用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(TIANGEN，北京)進行cDNA第一鏈的合成，具體操作參考說明書。

qRT-PCR分析依據基因序列，設計、、、、和這6種基因的特異引物(表2)用于其表達特性分析，利用小麥的β-actin基因(GenBank：AB181991)作為內參基因。運用SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(TIANGEN，北京)完成qRT-PCR，反應體系(20 μL)：2×SuperReal Premix Plus 10 μL、50×Rox Reference Dye 0.4 μL、正向引物(10 μM)0.6 μL、反向引物(10 μM)0.6 μL、cDNA(80 ng· μL)1 μL、RNase-Free ddHO 7.4 μL，每個樣品設置3個重復。擴增程序：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸32 s，40個循環(huán)。待擴增完成后，根據擴增曲線和熔解曲線檢測其特異性，并利用2-△△法對基因表達情況進行分析。

表2 qRT-PCR引物Table 2 Primers for qRT-PCR

1.3 數據處理

利用SPSS 21.0進行相關性分析、主成分分析、聚類分析等，利用RStudio和Microsoft Excel 2010進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 小麥萌發(fā)期抗旱性鑒定及評價結果

2.1.1 干旱脅迫對各指標的影響

20% PEG6000脅迫下，除苗干重之外，其余9個指標的測定值較對照均有所下降(表3)。其中，苗長的下降程度最大，降幅為80.44%；其次為葉鮮重和種子發(fā)芽勢，降幅分別為79.07%和71.74%；而種子發(fā)芽率的降幅最小，為 14.58%。這9個指標的變異系數較對照均增加，其中種子發(fā)芽勢增加最明顯。經配對檢驗，對照與脅迫處理間各指標差異均顯著。這表明20% PEG6000脅迫對小麥種子萌發(fā)具有一定的抑制作用，且各指標對干旱脅迫的響應程度存在差異。

表3 20% PEG6000脅迫下小麥萌發(fā)期各指標的變化Table 3 Changes of various indices at wheat germination stage under 20% PEG6000 stress

2.1.2 指標間的相關性

經對各指標的相對值(脅迫處理/對照)相關性(表4)分析，種子發(fā)芽勢與種子發(fā)芽率、葉干重、苗長之間，種子發(fā)芽率與葉干重之間，根鮮重與根干重、苗鮮重、葉鮮重之間，根干重與苗鮮重、葉鮮重、葉干重之間均呈極顯著正相關。根長與葉鮮重、葉干重間均呈極顯著負相關，相關系數分別為-0.243和 -0.326。種子發(fā)芽率與葉鮮重間，苗干重與葉干重、根長間，葉鮮重與苗長間均呈顯著正相關；其余指標間也存在不同程度的相關性。這說明20% PEG6000脅迫下，不同指標間存在較大的信息重疊，僅憑單個指標難以對小麥抗旱能力作出評價，還需進一步對各指標進行綜合分析才能更有效地篩出抗旱型小麥種質。

表4 20% PEG6000脅迫下小麥萌發(fā)期不同指標相對值間的相關系數Table 4 Correlation coefficients between relative values of various indices at wheat germination stage under 20% PEG6000 stress

2.1.3 抗旱性主成分分析

對各指標的相對值進行主成分分析，共提取到5個主成分(表5)。第一主成分的貢獻率最大，達36.89%，其主要特征向量為葉鮮重；第二主成分的貢獻率為19.62%，其主要特征向量為種子發(fā)芽勢；第三主成分的貢獻率為12.32%，其主要特征向量為苗長和種子發(fā)芽率；第四主成分的貢獻率為8.90%，其主要特征向量為苗鮮重；第五主成分的貢獻率為6.26%，其主要特征向量為苗干重。這5個主成分的累計貢獻率達 83.99%，可以代表所測指標的絕大部分信息，且葉鮮重、種子發(fā)芽勢、苗長、種子發(fā)芽率、苗鮮重和苗干重與主成分有較高的相關性，相關系數分別為 0.90、0.84、0.62、0.60、0.58和0.67，因此可以選擇這6個指標作為綜合評價供試材料抗旱性的主要鑒定指標。

表5 5個主成分的貢獻率及載荷矩陣Table 5 Contribution rate and load matrix of the five principal factors

2.1.4 抗旱性聚類分析

采用隸屬函數法計算每個指標的隸屬函數值，再進一步計算每份材料的抗旱性綜合評價值(值)(表6)，最后根據值進行聚類分析。結果表明，119份供試材料可以分為4大類(圖1)。第Ⅰ類為抗旱型種質，只有蒙茬1號這1份材料，值為0.67；其在20%PEG-6000脅迫條件下的苗鮮重、苗干重、葉鮮重和葉干重均顯著優(yōu)于其余材料。第Ⅱ類為較抗旱型種質，包括黑穗、12-122羅布、紅禿頭等36份材料，值在 0.47～0.60之間。第Ⅲ類為較敏感型種質，包括MS94-1、寧春10號、J90-9等43份材料，值為0.38～ 0.45。第IV類為敏感型種質，包括09594、K250、隴春3939等39份材料，值為0.23～ 0.37，其在脅迫條件下的各種性狀表現均較差。

圖1 119份春小麥種質的D值聚類圖Fig.1 Clustering diagram of D value of 119 spring wheat germplasms

表6 119份供試材料的D值及分類Table 6 D values and types of 119 tested materials

2.2 小麥萌發(fā)期抗旱相關基因的表達特性分析

通過qRT-PCR分析，隨著脅迫時間的增加，09594、K250、蒙茬1號和黑穗葉片及根系中、、、、和等6個基因均上調表達，表達量均在脅迫24 h時達到峰值，且抗旱材料蒙茬1號和黑穗的基因表達量均高于干旱敏感材料09594和K250。

在PEG脅迫1 h時，在根系中迅速上調表達，而葉片中的表達較緩慢，抗旱材料蒙茬1號根系和葉片中的表達量較對照分別增加了75.12%和48.19%，而敏感材料09594根系和葉片中的表達量較對照分別增加了59.02%和 37.89%；且在其他脅迫階段根系中的表達量也均明顯高于葉片。此外，脅迫24 h時，較抗旱材料黑穗葉片和根系中的表達量突增，均稍高于抗旱材料蒙茬1號(圖2A)，說明干旱脅迫24 h可能為黑穗材料萌發(fā)期該基因表達的一個突增點，具有一定的時間特異性，但至于脅迫時間大于24 h時，該材料中基因的表達量是否依然會高于抗旱材料蒙茬1號，還需進一步驗證。

在脅迫1、6、24 h時，葉片和根系中的表達量均呈穩(wěn)定上調表達趨勢，雖然在脅迫 12 h時，表達量有所回落，但仍顯著高于對照；且在葉片中的響應速度和誘導水平均明顯高于根系。同樣，在脅迫24 h時，較抗旱材料黑穗葉片和根系中的表達量均稍高于蒙茬1號(圖2B)，進一步說明干旱脅迫24 h也可能為黑穗材料萌發(fā)期基因表達的一個突增點，但當脅迫時間大于24 h時，該材料中的表達量是否也會高于抗旱材料蒙茬1號，仍需進一步驗證。

當增加脅迫時間時，在葉片中的上調表達幅度較小，而根系中表達量明顯增強，且根系中相對表達量在脅迫12 h時均小幅下降，脅迫24 h后又急劇上升(圖2C)。

的誘導表達啟動較晚，在脅迫處理6 h才開始出現較大幅度的上調表達，且在根系中的表達量均明顯高于葉片(圖2D)。

與的誘導表達模式相似，其在小麥葉片中的表達量均明顯高于根系。在PEG脅迫1 h時，小麥抗旱材料蒙茬1號和黑穗的在葉片和根系中迅速上調表達，且其表達量在脅迫6 h時均有所回落，脅迫12 h時又急劇上升；而小麥敏感材料09594和K250在脅迫處理6 h時，在葉片和根系中才出現大幅度的上調表達，且其表達量在脅迫12 h時出現回落，脅迫24 h時又緩慢回升(圖2E)。與的誘導表達模式相似，其在小麥根系中的響應速度和誘導水平均明顯高于葉片(圖2F)。

3 討 論

3.1 小麥萌發(fā)期抗旱性鑒定及評價

干旱是春小麥和其他糧食作物生產中面臨的主要自然災害之一，充分挖掘春小麥自身的抗旱潛力，篩選優(yōu)良抗旱品種，在一定程度上可緩解干旱脅迫對春小麥造成的危害。而種子萌發(fā)是植物生命周期中最關鍵的階段，是春小麥能夠正常生長發(fā)育的前提，萌發(fā)期的抗旱性關乎其出苗率及后續(xù)幼苗生長和形態(tài)建成。因此，研究干旱脅迫對不同基因型春小麥品種種子萌發(fā)的影響對于指導小麥抗旱品種選育顯得尤為重要。

小麥抗旱性是由多基因控制的數量性狀，很難用單一指標對其萌發(fā)期的抗旱性進行準確評價，可先對相關抗旱指標初步篩選，再利用隸屬函數值法進行綜合評價。本研究采用主成分分析，在損失較少信息的前提下，篩選出種子發(fā)芽勢、種子發(fā)芽率、苗鮮重、苗干重、葉鮮重和苗長作為評價春小麥萌發(fā)期抗旱能力的主要指標。前人對于不同小麥種質萌發(fā)期抗旱性的研究也有較多報道。任毅等以-0.5 MPa PEG6000模擬干旱脅迫，對301份冬小麥種質進行種子萌發(fā)培養(yǎng)，測定種子發(fā)芽勢、種子發(fā)芽率、種子發(fā)芽指數、根數、根長、苗高和胚芽鞘長度，綜合評價的結果表明，種子發(fā)芽指數、根長和根數可作為小麥萌發(fā)期抗旱性鑒定的可靠指標。王敬東等以40份春小麥為材料，15% PEG6000水溶液模擬干旱脅迫，結果發(fā)現胚根長可作為春小麥萌發(fā)期抗旱性的主要鑒定指標，胚芽鞘長為參考值。張樹林等以20% PEG6000水溶液模擬干旱脅迫，認為小麥的芽長、種子發(fā)芽勢、根鮮重可用于萌發(fā)期抗旱性鑒定的篩選依據。孫綠等也采用-0.5 MPa PEG6000模擬干旱脅迫，通過加權隸屬函數法對119份冬小麥萌發(fā)期抗旱性進行了綜合評價，確定種子發(fā)芽率、胚芽鞘長、主胚根長、胚根數和干物質重量可作為鑒定小麥萌發(fā)期抗旱能力的主要指標。張芳等也在20% PEG6000脅迫下，對83份新疆冬小麥種質進行萌發(fā)期抗旱性綜合評價，提出胚芽鞘長和最長根長在小麥萌發(fā)期抗旱材料篩選中具有指導作用。綜上所述，小麥萌發(fā)期實驗材料、實驗環(huán)境或研究方法等的不同均有可能造成抗旱指標篩選的差異化。

L：葉片；R：根系；MC1：蒙茬1號；HS：黑穗。L：Leaves;R：Roots；MC1:Mengcha 1;HS:Heisui.圖2 20% PEG6000脅迫下小麥不同抗旱基因的表達模式Fig.2 Expression patterns of different drought resistance genes in wheat under 20% PEG6000 stress

3.2 小麥萌發(fā)期抗旱相關基因的表達特性分析

小麥在受到干旱脅迫時會感知和傳遞脅迫信號，啟動相關基因的表達，前人關于小麥抗旱基因表達特性的研究已有相應報道。徐仲陽利用qRT-PCR對鄭麥9023幼苗中轉錄因子的表達量進行檢測發(fā)現，在不同時間段的20%PEG6000脅迫下，表現出極為顯著的上調表達，本研究結果與其一致，說明轉錄因子參與小麥干旱脅迫的響應。肖瑞霞等研究表明，在20%PEG6000脅迫過程中，小麥葉片中的在脅迫0.5 h、6 h、12 h和24 h時均穩(wěn)定上調表達，本研究結果與其一致，說明該基因可能在小麥抗旱過程中發(fā)揮著重要的脫水保護功能。陳娟對基因的研究結果表明，干旱脅迫處理下，2種不同抗旱型小麥葉片中基因表達量顯著高于正常組，復水后表達量下降，且苗期、分蘗期、拔節(jié)期和開花期的表達量變化趨勢一致，受干旱脅迫越嚴重，基因表達量就越高。而本研究中基因在小麥葉片中的表達量隨脅迫時間的增加而升高，而根中表達量在脅迫12 h時小幅下降，脅迫24 h后又急劇上升，表明小麥基因的表達受干旱脅迫的誘導。張炳慧等對干旱脅迫下基因表達特性的研究表明，在西農538和中國春2個小麥品種葉片中，基因在干旱脅迫0～72 h時間段內的表達量均呈“下降-上升-下降”的趨勢，且西農538在脅迫至12 h時表達量突增達到了一個最大值，脅迫1、3、6、48、72 h時的表達量均低于對照；而中國春在6 h時表達量突增到最大值，脅迫1、3、48 h時的表達量也均低于對照。而本研究結果表明，小麥基因在干旱脅迫處理1、6、12、24 h時均上調表達，且根系中的表達量均明顯高于葉片，與上述結果相比存在一定的差異。陳蕾太等對基因的研究表明，在干旱脅迫條件下，豫農949、豫麥49-198和長4738的α-AMY基因表達量隨脅迫時間的增加均會逐漸升高，本文結果與其一致。目前，關于干旱脅迫下小麥基因表達特性的研究還未見相關報道。本研究中，在20%PEG6000脅迫條件下，小麥葉片和根系中的基因均上調表達，上調程度隨脅迫時間的增加而提高，且其在根系中的響應速度和誘導水平均明顯高于葉片，這可能與根系直接感受滲透脅迫有關。

4 結 論

本研究以20% PEG6000溶液模擬干旱脅迫，通過對119份春小麥種質萌發(fā)期抗旱性進行分析，得出種子發(fā)芽勢、種子發(fā)芽率、苗鮮重、苗干重、葉鮮重和苗長可以作為評價春小麥萌發(fā)期抗旱能力的主要指標，并篩選出了1份抗旱型材料(值為0.67)、36份較抗旱型材料(值為 0.47～0.60)、43份較敏感型材料(值為 0.38～0.45)和39份干旱敏感型材料(值為 0.23～0.37)。隨著脅迫時間的增加，抗旱相關基因、、、、和在小麥葉片和根系中均上調表達，表達量均在脅迫24 h時達到峰值，且、、和在根系中的響應速度和誘導水平均明顯高于葉片，而和在葉片中的響應速度和誘導水平更高。此外，抗旱型材料蒙茬1號和黑穗中6種基因的表達量均高于敏感型材料09594和K250，說明上述不同類型材料的篩選是合適的。