任 妍，呂俠雷，吳曉輝，侯瑋秀，劉 倜，王麗艷，馮家春，陳 鋒,3

(1.阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽阜陽 236065；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南鄭州 450046；3.徐州佳禾農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇徐州 221200)

小麥?zhǔn)侨祟愖钪匾募Z食作物之一，為全世界人口提供了1/5以上的能量來源。由禾本科布氏白粉菌(f.sp.)引起的小麥白粉病是全球性真菌病害，嚴(yán)重威脅小麥的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。在中國，該病害引起的小麥產(chǎn)量損失平均每年高達(dá)30.45萬t，嚴(yán)重時產(chǎn)量損失甚至在50%以上。實踐證明，與化學(xué)防治等措施相比，選育和應(yīng)用抗病品種是防治小麥白粉病最安全、環(huán)保和有效的途徑。因此，培育抗病品種是當(dāng)前小麥育種的重要目標(biāo)之一。迄今為止，已有66個抗白粉病基因(～)被定位并正式命名。這些基因中，近三分之二的抗性基因來自于小麥的祖先和野生近緣種。如基因來自黑麥，在中國50%以上的冬小麥品種都攜帶有該基因；基因來自簇毛麥，在全生育期對白粉病具有高水平的廣譜抗性，且分布廣泛。然而，由于白粉菌具有易變異、進(jìn)化快等特點(diǎn)，使得專化性抗性基因抗性喪失較快，致使抗性不持久。如抗白粉基因早期對小麥白粉病具有優(yōu)異的抗性，但隨著20世紀(jì)70年代該基因的廣泛應(yīng)用，白粉菌對基因的毒性日益增加，如今基因在世界范圍內(nèi)基本上喪失了對白粉病的抗性。相反，非專化性抗性或成株抗性由于無?；曰?qū)；匀酰瑴p少了對小種的選擇壓力，從而表現(xiàn)為抗性更持久、穩(wěn)定，這類抗性通常由微效多基因(如、和)控制，自上世紀(jì)初以來，這些基因一直保持著良好的白粉病抗性，而且兼抗條銹病、葉銹病等多種病害。因此，進(jìn)一步發(fā)掘新的白粉病成株抗性基因，特別是持久抗性基因及其抗源，對中國小麥白粉病成株抗性基因的克隆和抗性育種具有重要的意義。

四倍體小麥中蘊(yùn)含著豐富的抗白粉病基因，且大部分抗性基因已經(jīng)廣泛應(yīng)用于我國小麥抗病育種中。如來自于栽培二粒小麥的，目前對河南地區(qū)的白粉病流行小種仍具有較好的抗性；來自于波斯小麥的，編碼一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在中國和美國的小麥抗病育種中仍發(fā)揮著重要作用。本研究利用UC1113和Kofa這兩個具有不同白粉病抗性的四倍體硬粒小麥構(gòu)建的一個F代RIL群體為材料，在4個環(huán)境下對該群體進(jìn)行白粉病成株抗性鑒定，并利用完備區(qū)間作圖法構(gòu)建遺傳圖譜，挖掘硬粒小麥中新的白粉病成株抗性QTL位點(diǎn)，以期為小麥抗白粉病育種提供新的抗源和抗病基因。

1 材料與方法

1.1 材 料

以硬粒小麥UC1113和Kofa雜交并通過單粒傳法獲得的一個含有93個株系的F代RIL群體為材料。其中，UC1113是由美國加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校的研究人員從CIMMYT雜交組合中選育出的一個農(nóng)藝性狀優(yōu)良的硬粒小麥品系，其系譜為KIFS//RSS/BD1419/3/MEXIS-CP/4/WAHAS/5/YAV79，該品系在苗期對白粉菌生理小種E09和E20表現(xiàn)為高感，反應(yīng)型(infection type，IT)為4級，但在成株期對E09和E20表現(xiàn)為高抗。Kofa是由西方育種家選育的一個沙漠硬粒小麥品種，是一個蛋白含量高且品質(zhì)優(yōu)良的強(qiáng)筋品種，該品種在苗期對白粉菌生理小種E09和E20表現(xiàn)為高感(IT=4)，在成株期對E09和E20表現(xiàn)為中感(未發(fā)表)。白粉菌生理小種E09和E20由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所李洪杰研究員和吳培培博士提供。

1.2 白粉病溫室苗期接種鑒定

將93個RIL家系及其雙親分別于2017年和2021年在室內(nèi)種植進(jìn)行白粉病接種鑒定，具體方法參考Jia等的方法。IT分級標(biāo)準(zhǔn)參考Wang等的方法。

1.3 白粉病田間成株期接種鑒定

1.3.1 田間種植

將93個RIL家系及其雙親于2019-2020和2020-2021年度分別種植于河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)(113.59°E，34.86°N)和河南省原陽縣河南農(nóng)業(yè)大學(xué)原陽基地(113.95°E，35.10°N)。田間種植采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，雙行區(qū)，2次重復(fù)(第1、2次重復(fù)及其平均值分別用2019ZZ Ⅰ、2020ZZ Ⅰ、2019YY Ⅰ、2020YY Ⅰ、2019ZZ Ⅱ、2020ZZ Ⅱ、2019YY Ⅱ、2020YY Ⅱ和2019ZZ A、2020ZZ A、2019YY A、2020YY A)，行長1.0 m，行距0.3 m。每10個材料加2行高感對照品種京雙16。為了確保發(fā)病，區(qū)組與區(qū)組間的走道采用寬窄行設(shè)計，即1行寬走道(50 cm)和1行窄走道(30 cm)，并在窄走道的中間沿著垂直于鑒定材料的方向均勻播種高感對照品種京雙16，進(jìn)一步誘發(fā)田間白粉病。

1.3.2 田間接種

2020-2021年度河南鄭州點(diǎn)采用人工接種的方法，接種時間為2021年3月14日。首先在室內(nèi)將高感對照品種京雙16在一次性塑料小盆中種植，待其第2片葉完全展開時利用白粉菌小種E09和E20進(jìn)行接種，接種7 d后，當(dāng)白粉菌孢子堆在小麥葉片上逐漸顯現(xiàn)時，將感白粉病的小麥苗移栽至田間試驗誘發(fā)行，每1.5 m移栽4盆。其余環(huán)境均為自然發(fā)病。

1.3.3 田間鑒定

2019-2020年度鄭州點(diǎn)以及2019-2020和2020-2021兩年度的原陽點(diǎn)為自然發(fā)病，當(dāng)高感對照品種京雙16倒二葉上的白粉病嚴(yán)重度(即白粉菌孢子堆的面積占整個葉片面積的百分?jǐn)?shù))達(dá)到70%以上時，對RIL群體及其雙親的白粉病最大嚴(yán)重度(maximum disease severity,MDS)進(jìn)行調(diào)查，1周后對白粉病MDS進(jìn)行第2次調(diào)查。2020-2021年度鄭州點(diǎn)為接種鑒定，根據(jù)當(dāng)年高感對照品種的發(fā)病情況，分別在2020年4月27日和2020年5月7日調(diào)查材料的白粉病MDS。

1.3.4 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.4 遺傳圖譜的構(gòu)建及QTL定位

Zhang等選用1 235個SSR標(biāo)記、275個小麥SNP標(biāo)記以及7個已克隆基因的功能標(biāo)記對親本材料UC1113和Kofa進(jìn)行了多態(tài)性篩選，并用親本間有多態(tài)性的標(biāo)記對93個家系進(jìn)行了群體基因型分析，共獲得235個多態(tài)性標(biāo)記的群體基因型信息。本研究利用這235個多態(tài)性標(biāo)記和完備區(qū)間作圖法構(gòu)建遺傳圖譜，并利用作圖軟件QTL ICIMapping V4.1(http://www.isbreeding.net)對群體基因型進(jìn)行連鎖分析并結(jié)合白粉病表型進(jìn)行QTL定位。BIP工具的參數(shù)設(shè)置如下：作圖方法選用ICIM-ADD，步長值設(shè)為1.0 cM，PIN設(shè)為0.001，LOD閾值為 2.5，permutation為1 000次，Type I error為 0.05。在Wheat Omics 1.0(http://202.194.139.32/)網(wǎng)站上獲得連鎖標(biāo)記在中國春基因組中的物理位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙親及其RIL群體的白粉病抗性表現(xiàn)

2017年和2021年的白粉病苗期鑒定結(jié)果表明，感病對照品種京雙16對白粉菌小種E09和E20的IT為3～4級，說明苗期白粉病發(fā)病充分，苗期接種有效；RIL群體的93個家系及其雙親對白粉菌小種E09和E20的反應(yīng)型均為3～4級，表明該群體的白粉病抗性不屬于苗期抗性或全生育期抗性。

2019-2020和2020-2021兩年度鄭州點(diǎn)和原陽點(diǎn)的田間試驗中，感病對照品種京雙16在4個環(huán)境下的MDS均在80%以上，說明白粉病發(fā)病充分。93個家系在4個環(huán)境下的平均MDS變化幅度分別為0.5%～70.0%、3.0%～90.0%、3.0%～87.5%和0.0%～80.0%，均呈現(xiàn)出連續(xù)性變異(圖1)，表明RIL群體的白粉病成株抗性屬于數(shù)量性狀。親本UC1113在4個環(huán)境下的白粉病MDS介于1.0%～7.5%之間，而Kofa在4個環(huán)境下的MDS較高，在45.0%～70.0%之間?？梢钥闯?，在所有環(huán)境中UC1113的MDS均小于Kofa，說明UC1113的白粉病抗性優(yōu)于Kofa。

2.2 RIL群體白粉病MDS在不同環(huán)境間的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果(表1)顯示，4個環(huán)境中除了2019―2020年度鄭州點(diǎn)和原陽點(diǎn)的白粉病MDS的相關(guān)系數(shù)為0.473外，其余環(huán)境間白粉病MDS的相關(guān)系數(shù)均在0.500以上，說明白粉病MDS在不同環(huán)境間的相關(guān)性較高，表型鑒定的結(jié)果可靠。方差分析結(jié)果(表2)顯示，不同區(qū)組間白粉病MDS存在極顯著差異，說明本研究中設(shè)置區(qū)組有效的降低了試驗誤差，試驗設(shè)計合理。此外，基因型、環(huán)境以及基因型和環(huán)境互作對白粉病MDS的影響均達(dá)到極顯著水平，說明這三者共同影響材料的白粉病抗性。RIL群體白粉病MDS的遺傳力為0.91，說明白粉病成株抗性主要受基因型的影響。

表1 “UC1113/Kofa”RIL群體白粉病MDS在4個環(huán)境間的相關(guān)性Table 1 Correlation of powdery mildew MDS for RIL population of “UC1113/Kofa”in four environments

表2 “UC1113/Kofa”RIL群體白粉病MDS的方差分析Table 2 ANOVA of powdery mildew MDS for RIL population of “UC1113/Kofa”

2.3 白粉病成株抗性QTL的定位結(jié)果

采用完備區(qū)間作圖法對RIL群體4個環(huán)境下2次重復(fù)的MDS及其平均MDS進(jìn)行白粉病抗性QTL掃描，共定位到4個白粉病成株抗性QTL，即、、和(表3)。

2019ZZ：2019-2020年度鄭州點(diǎn)；2020ZZ：2020-2021年度鄭州點(diǎn)；2019YY：2019-2020年度原陽點(diǎn)；2020YY：2020-2021年度原陽點(diǎn)。表1同。白粉病MDS數(shù)據(jù)為2次重復(fù)的平均值。2019ZZ:Zhengzhou in 2019-2020;2020ZZ:Zhengzhou in 2020-2021;2019YY:Yuanyang in 2019-2020;2020YY:Yuanyang in 2020-2021.The same in table 1.MDS values of powdery mildew were the mean of two repeats.圖1 “UC1113/Kofa”RIL群體在4個環(huán)境下白粉病MDS的頻率分布圖Fig.1 Frequency distribution of powdery mildew MDS for RIL population of “UC1113/Kofa”in four environments

其中、和的加性效應(yīng)為負(fù)值，表明其加性效應(yīng)來自父本UC1113，而的加性效應(yīng)為正值，表明其加性效應(yīng)來自母本Kofa。

從表3和圖2可知，在1A染色體上共檢測到1個QTL，為，其位于標(biāo)記區(qū)間BM140362_603-1A～wmc312，在2019―2020年度原陽點(diǎn)的重復(fù)II以及2020―2021年度原陽點(diǎn)2次重復(fù)的MDS平均值中被檢測到，LOD值分別為4.02和2.64，表型貢獻(xiàn)率分別為18.20%和12.16%。在4A染色體上共檢測到2個QTL，分別為和，其中位于標(biāo)記區(qū)間gwm265～wmc258，僅在2019―2020年度原陽點(diǎn)的重復(fù)I中被檢測到，表型貢獻(xiàn)率為 11.98%；位于標(biāo)記區(qū)間wmc718～barc135，在2020―2021年度鄭州重復(fù)I和重復(fù)II以及2次重復(fù)的MDS平均值中均可檢測到，LOD值在2.79～5.24之間，表型貢獻(xiàn)率范圍為3.50%～20.27%。在5A染色體上共檢測到1個QTL，為，位于標(biāo)記區(qū)間barc151～BG607308_101-5A，在2020―2021年度鄭州點(diǎn)重復(fù)II、原陽點(diǎn)重復(fù)I以及原陽點(diǎn)2次重復(fù)的MDS平均值中可檢測到，LOD值在 2.69～3.75之間，表型貢獻(xiàn)率范圍為6.66%～ 10.83%。

表3 “UC1113/Kofa”RIL群體白粉病成株抗性QTL定位結(jié)果Table 3 QTL mapping for powdery mildew resistance in RIL population of “UC1113/Kofa”

圖2 “UC1113/Kofa”RIL群體白粉病成株抗性QTL在染色體上的分布Fig.2 Location of QTL for powdery mildew MDS on chromosomes in the RIL population of “UC1113/Kofa”

3 討 論

本課題前期對四倍體硬粒小麥品系UC1113進(jìn)行了多年的白粉病抗性鑒定，結(jié)果顯示，UC1113在成株期對白粉菌流行小種E09和E20表現(xiàn)為高抗，且穩(wěn)定遺傳，而苗期則對白粉菌流行小種E09和E20表現(xiàn)為高感(未發(fā)表)，因此，硬粒小麥品系UC1113屬于典型的成株抗性材料。本研究RIL群體中93個家系的苗期鑒定結(jié)果也表明，所有家系在苗期均對E09和E20表現(xiàn)為高感，這也驗證了該群體的白粉病抗性屬于成株抗性。從QTL的定位結(jié)果看，親本UC1113中聚合了3個白粉病成株抗性QTL，而Kofa中只檢測到了1個白粉病成株抗性QTL，表明單個QTL的效應(yīng)可能是微效的，但當(dāng)品種中聚合3個及以上的抗性QTL時，品種的白粉病抗性可以達(dá)到較高水平，這和前人的研究結(jié)果是一致的。因此，不斷發(fā)掘白粉病抗源和抗性QTL，并在育種中聚合多個抗性QTL，是培育持久高抗小麥品種的有效手段。

前人報道中，1A染色體上正式命名的抗白粉病基因有3個，分別為來源于普通小麥或野生四倍體小麥的、黑麥的和野生一粒小麥的。本研究定位到的來自于四倍體硬粒小麥，所以該QTL與和不同。另外，介于分子標(biāo)記SFR159和294D11-22之間，根據(jù)Guo等整合的小麥抗白粉病基因位置圖譜，該基因位于1A染色體短臂近端粒處，而位于1A染色體長臂上，因此也不同于。Lan等在普通小麥百農(nóng)64中定位到一個抗白粉病位點(diǎn)，該QTL位于SSR標(biāo)記barc148和wmc550之間，位于1A染色體著絲點(diǎn)附近。此外，Keller等和Mingeot等用RFLP標(biāo)記分別檢測瑞士斯佩耳特小麥品種Oberkulmer和法國小麥品種RE714，在1A染色體上分別定位到抗白粉病位點(diǎn)和，分別位于psr121b～psr941M和cdo572b～bcd442的標(biāo)記區(qū)間?；谝延械男←湻肿訕?biāo)記圖譜，發(fā)現(xiàn)前人定位到的這3個QTL(、和)與位置相近。然而，從來源上看，、和來自普通小麥或者斯佩耳特小麥，而來自于四倍體栽培種。因此，推測是一個新的白粉病成株抗性QTL。

Chen等將定位在4A染色體上的5B易位系片段，介于SSR標(biāo)記gwm159和barc109之間，而和均定位于4A染色體長臂上，因此和與不同。此外，前人已報道的位于4AL染色體上的抗白粉病QTL中，、和位于4A染色體著絲粒附近，和分別位于SSR標(biāo)記gwm4下游22 cM和37 cM處，而、和則位置相近，均位于4AL染色體末端附近。本研究檢測到的白粉病成株抗性位點(diǎn)位于SSR標(biāo)記gwm265和wmc258之間，基于小麥分子標(biāo)記圖譜，該位點(diǎn)與位置相近。但是，的抗性來自于瑞士普通小麥品種Foron，與來源不同。本研究檢測到的位于分子標(biāo)記wmc718和barc135之間，在下游30 cM左右，與已報道的3個位于4AL染色體末端的白粉病成株抗性QTL(、和)的遺傳距離約為10 cM，表明可能與它們不同。因此，推測和是2個新的白粉病成株抗性QTL。

前人在小麥5AL染色體上已定位了6個抗白粉病QTL，分別為、、、、和。根據(jù)Li等整合的小麥成株抗性QTL圖譜可知，上述6個QTL分別位于5AL染色體上的3個不同區(qū)段，其中位于SSR標(biāo)記gwm666和barc319之間，與本研究檢測到的的染色體位置相近，遺傳距離在5 cM左右。而且是由四倍體小麥材料提供抗性，與來源類似。因此，和很可能是相同的QTL。

4 結(jié) 論

本研究利用完備區(qū)間作圖法共檢測到4個抗白粉病QTL，分別為、、和，單個環(huán)境下可解釋總表型變異的3.50%～20.27%。其中、和來自于抗親UC1113，且均為新的白粉病成株抗性QTL。UC1113及其抗性QTL可用于小麥白粉病的抗性改良。