王煒星，張夢宇，董 瑞，張培培，張佳瑤，李在峰，劉大群

(河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點實驗室，河北保定 071001)

小麥葉銹病是小麥生產(chǎn)上的常見病害之一，該病害可通過氣流進行遠距離傳播，在全球范圍內(nèi)分布廣泛，條件適宜時可對小麥生產(chǎn)造成嚴重損失。河南小麥總產(chǎn)量及種植面積居全國首位，為中國小麥主要產(chǎn)區(qū)之一。近年來，小麥葉銹病在河南產(chǎn)區(qū)發(fā)生程度日漸加重，對小麥產(chǎn)量和糧食生產(chǎn)安全造成嚴重影響?？共∑贩N長期的單一化種植易導致小麥葉銹病大流行，因此，抗病品種的合理布局與抗病新品種的培育對防治小麥葉銹病以及保證糧食安全至關(guān)重要。本研究對河南主要栽培小麥品種進行苗期和成株抗葉銹性鑒定，為小麥抗病基因布局和培育抗病品種提供理論依據(jù)和優(yōu)質(zhì)抗源。

Loegering等在基因?qū)蚣僬f的基礎(chǔ)上提出了基因推導的方法，該方法通過接種不同毒力的葉銹菌生理小種，將已知抗性基因載體品種(近等基因系)的侵染型與供試材料的侵染型進行對比，推導出供試材料中可能含有的抗病基因。但由于基因推導法易受到葉銹菌生理小種毒力的影響，致使某些基因無法被鑒別，因此，對小麥品種進行抗性鑒定時，可以利用分子標記檢測并加以系譜分析的方法對推導結(jié)果進行驗證，以獲得準確結(jié)果，目前該方法已廣泛應(yīng)用于小麥品種的抗性基因鑒定研究中。胡長程等、袁軍海等和Ren等分別對中國小麥部分生產(chǎn)品種進行了抗葉銹性鑒定，在這些品種中共鑒定出、、、等36個抗病基因。近年來本課題組利用基因推導和標記檢測對大量國內(nèi)外小麥材料進行了苗期及成株期抗葉銹性鑒定，如閆曉翠等、鄭慧敏等、Gao等和Gebrewahid等分別對來自陜西、貴州、湖北、四川、江蘇、安徽、寧夏的199個國內(nèi)小麥品種及引進國外的130個小麥品種進行了苗期和成株期抗葉銹性鑒定，共鑒定出、、、、、等39個基因，為這些品種的有效利用奠定了基礎(chǔ)。本研究以河南71個主栽小麥品種為試驗材料，利用分子標記檢測、基因推導和田間抗性調(diào)查對其進行抗葉銹性鑒定，以期明確河南主栽品種所含的抗葉銹病基因，為小麥抗病品種的布局防控和優(yōu)質(zhì)抗源的發(fā)掘利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥材料為36個已知抗葉銹病基因載體(近等基因系)品種、71個河南主栽小麥品種、感病對照品種鄭州5389和成株期慢銹對照品種SAAR。16個葉銹菌生理小種為PHJS、PHSP、KHJS、THJS①、THSF、FHSS、THTS、FHJS、PHTS①、PGTS、KHST、THRT、PHSS、PHTS②、THJS②和PHSS，菌種命名利用四字母命名法。供試小麥材料和葉銹菌生理小種均由河北農(nóng)業(yè)大學小麥銹病研究室提供并保存。

1.2 苗期基因推導及抗葉銹性鑒定

苗期試驗在溫室中進行，將36個已知抗葉銹基因的載體品種、71個河南主栽小麥品種和感病對照品種鄭州5389分別播種在16套108孔穴盤內(nèi)，待培養(yǎng)至一葉一心(第二片葉完全展開)期時，采用掃抹法將16個葉銹菌生理小種接種到16套麥苗上，并在黑暗和100%濕度條件下對接種后的小麥進行密封保濕24 h。將保濕完畢后的小麥放置于溫室(25℃左右)內(nèi)培養(yǎng)，待感病對照品種鄭州5389充分發(fā)病時(接種后10 d)，對供試材料進行侵染型鑒定。為保證鑒定結(jié)果準確，將6級鑒定標準調(diào)整為9級侵染型鑒定標準，侵染型等級由低到高依次為0、;、1、1+、2、2+、3、3+和4(0～ 2+為抗病，3～4為感病)。依照Dubin等提出的基因推導方法對鑒定結(jié)果進行抗病基因推導。

1.3 田間接種及成株期抗葉銹性鑒定

將供試的71個河南主栽小麥品種、感病對照品種鄭州5389和成株期慢銹對照品種SAAR于2014年10月播種于河北保定試驗田、2014年10月和2015年10月播種于河南周口黃泛區(qū)農(nóng)場試驗田。田間試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計,2次重復，每個試驗品種播種1行(40～50粒)，行長1.5 m、行間距0.25 m，每10行種植1行感病對照品種鄭州5389，并在2列試驗行之間垂直播種鄭州5389作為誘發(fā)行。所有田間試驗于播種后次年的4月初參照Li等的田間接種方法，利用5個高毒性小麥葉銹菌的混合生理小種(PHJS、THJS①、THSF、FHJS和THRT)分別在河北保定試驗田和河南周口黃泛區(qū)農(nóng)場試驗田對誘發(fā)行進行接種。當鄭州5389的葉片侵染面積達到50%時，采用Peterson等提出的方法，對供試材料每 7 d進行1次成株期抗性葉銹鑒定，調(diào)查2次。當對照品種達到發(fā)病高峰時，所調(diào)查的結(jié)果作為最終病害嚴重度(final disease severity，F(xiàn)DS)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用軟件SAS 9.4對71個河南主栽小麥品種在3個環(huán)境下的FDS進行方差分析(ANOVA)和品種間最小顯著差異(least significant difference，LSD)值計算，通過比較苗期和成株期侵染型，將苗期對混合毒力菌種表現(xiàn)為感病(IT:3～4)且成株期FDS小于或與慢銹對照品種SAAR無顯著差異的品種作為慢銹品種。

1.5 抗葉銹病基因的分子標記檢測

利用CTAB法提取71個河南主栽小麥品種葉片的基因組DNA。利用與9個抗葉銹病基因(、、、、、、、和)緊密連鎖的的11個分子標記對供試品種進行分子檢測。引物序列參照相應(yīng)文獻，由生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增體系均為10 μL，包括5 μL 2×Taq PCR Mix、3 μL ddHO、1 μL 4 mol·μL的上、下游引物、1 μL DNA。9個抗葉銹病基因的PCR擴增程序按照相應(yīng)的參考文獻進行。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期基因推導及分子標記檢測結(jié)果

36個含有已知基因載體品種的侵染型鑒定結(jié)果(表1)表明，攜帶、、、、、、和的載體品種對16個供試葉銹菌生理小種均表現(xiàn)為抗病(IT：0～2+)，攜帶、、、、、、、、、和的載體品種對16個供試葉銹菌生理小種均表現(xiàn)為感病(IT:3～4)，因此，這19個抗葉銹病基因無法通過苗期基因鑒定推導出來。

從表1和表2可以看出，對PGTS小種表現(xiàn)為抗病，71個河南主栽小麥品種中，有27個品種(矮豐3號、豐優(yōu)6號、鶴麥026、花培5號、蘭考24、洛麥21、內(nèi)鄉(xiāng)182、內(nèi)鄉(xiāng)188、新麥13、新麥3306、偃師16、偃展4110、豫麥1號、豫麥3號、豫麥52、豫麥53、豫麥7號、豫農(nóng)035、豫農(nóng)201、鄭麥8998、鄭麥9201、周8425B、周麥11、周麥25、周麥26、周麥28和周麥32)也對PGTS表現(xiàn)為抗病，推測這27個品種可能含有。

表1 16個葉銹菌生理小種對36個含有已知抗葉銹菌基因栽體品種的苗期侵染型Table 1 Seedling infection types on 36 wheat lines with known leaf rust resistance genes when tested with 16 P.triticina races

對4個小種(KHJS、FHSS、FHJS和KHST)表現(xiàn)為抗病，71個河南主栽小麥品種中，百農(nóng)3217、百農(nóng)64、鶴麥026、內(nèi)鄉(xiāng)188、新麥3306、豫麥47、鄭麥366和鄭麥8998這8個品種也對這4個小種表現(xiàn)為抗病，推測這8個品種可能含有。

對THRT小種表現(xiàn)為抗病，71個河南主栽小麥品種中，百農(nóng)3217、百農(nóng)64、洛旱3號、偃師16、豫麥57、鄭麥366、鄭麥8998和鄭州005這8個品種也對THRT小種表現(xiàn)為抗病，推測這8個品種可能含有。

對5個小種(PHJS、KHJS、FHSS、FHJS和THJS②)表現(xiàn)為抗病，71個河南主栽小麥品種中，內(nèi)鄉(xiāng)188、新麥3306、鄭麥366和鄭麥8998這4個品種也對這5個小種表現(xiàn)為抗病，推測這4個品種可能含有。

對2個小種(PHSP和THSF)表現(xiàn)為抗病，71個河南主栽小麥品種中，只有豫麥50和周8425B也對這2個小種表現(xiàn)為低侵染性，推測豫麥50和周8425B可能含有。

對3個小種(PHSP、PHTS和PGTS)表現(xiàn)為抗病，71個河南主栽小麥品種中，只有周8425B對這3個小種也表現(xiàn)為抗病，推測周8425B可能含有。

利用11個分子標記對71個河南主栽小麥品種進行檢測，結(jié)果(表2)表明，百農(nóng)3217、百農(nóng)64、鶴麥026等8個小麥品種可以檢測出，豫麥50和周8425B可以檢測出，矮豐3號、豐優(yōu)6號、鶴麥026等27個品種可以檢測出。以上分子標記結(jié)果均與苗期推導結(jié)果完全一致。另外，利用連鎖標記csLV34在鄭麥9694中檢測出，而其他抗葉銹基因、、、和在供試材料中未檢測到。

表2 16個葉銹菌生理小種對71個河南主栽小麥品種的苗期侵染型Table 2 Seedling infection types of 71 wheat cultivars from Henan when tested with 16 P.triticina races

(續(xù)表2 Continued table 2)

2.2 田間成株期抗葉銹性鑒定結(jié)果

對71個河南主栽小麥品種在2014-2015年度河北保定以及2014-2015和2015-2016兩年度河南周口3個環(huán)境下的成株期抗葉銹病鑒定結(jié)果顯示，感病對照品種鄭州5389在3個環(huán)境下均充分發(fā)病，這保證了鑒定結(jié)果的可靠性。對田間鑒定結(jié)果進行方差分析，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，品種間、環(huán)境間以及品種與環(huán)境間都存在顯著差異，這說明小麥成株期抗葉銹性受基因型和環(huán)境的共同影響。根據(jù)LSD分析結(jié)果(表4)，發(fā)現(xiàn)共有7個小麥品種(周麥28、周麥11、周麥25、新麥9408、豫農(nóng)9901、周8425B和鶴麥026)與慢銹對照品種SAAR的嚴重度無明顯差異，表現(xiàn)為成株期抗性，為慢銹品種。

表3 71個河南小麥品種及對照品種SAAR和鄭州5389成株期最終病害嚴重度的方差分析Table 3 Variance analysis of final disease severity(FDS)for 71 Henan wheat cultivars,SAAR and Zhengzhou 5389 at adult plant stage

表4 71個小麥品種在3個環(huán)境下對葉銹菌混合生理小種的最終病害嚴重度Table 4 Final disease severity(FDS)of 71 wheat varieties to mixed P.triticina races under three environments

(續(xù)表4 Continued table 4)

3 討 論

本研究基因推導及分子標記檢測結(jié)果表明，71個河南主栽小麥品種中，13個品種對所有供試條銹菌生理小種表現(xiàn)為感病，未能檢測出已知抗病基因；23個品種對部分條銹菌生理小種表現(xiàn)為抗病，但未能從中檢測出已知抗病基因，因此，這些品種中含有尚未確定的抗病基因?；蛲茖ЫY(jié)果和分子標記檢測結(jié)果一致，保證了鑒定結(jié)果的可靠性。

通過系譜分析，周麥11、周麥25、周麥26、周麥28、周麥32、洛麥21和鶴麥026都是周8425B的后代，并且在本研究中均能檢測到，而周8425B的親本山前麥為含有抗葉銹病基因的1B/1R易位系品種。Zhang等在周8425B中鑒定出了，進一步說明這些品種中攜帶的可能是來自于周8425B。豫麥3號所攜帶的可能來源于其親本高加索，該品種是早年我國引入的含有的1B/1R易位系品種，由于其具有優(yōu)良的抗性和農(nóng)藝性狀，在我國育種中被廣泛利用。本研究部分材料中的依據(jù)系譜分析，也可推出其來源于攜帶1B/1R易位系的國外引進材料。此外，百農(nóng)3217所攜帶的可能來自于親本阿夫。本研究檢測到鄭麥366和其親本豫麥47都含有，推測鄭麥366所攜帶的來自于其親本豫麥47。

本研究成株期抗葉銹性鑒定結(jié)果表明，周麥28、周麥11、周麥25、新麥9408、豫農(nóng)9901、周8425B和鶴麥026為成株慢銹品種，可能含有成株期抗葉銹病基因，Zhang等在周8425B中發(fā)現(xiàn)了抗葉銹病基因，Yan等進一步克隆了該基因，并發(fā)現(xiàn)其為已知抗葉銹病基因，目前在田間對我國葉銹菌生理小種表現(xiàn)出有效抗性，而周麥28、周麥11、周麥25和鶴麥026都是周8425B的衍生系，因此這些品種的成株期抗性可能均來自。

本研究所鑒定出的已知抗葉銹病基因中，、和在我國已喪失抗性；雖苗期對部分條銹菌生理小種表現(xiàn)為抗病，但成株期表現(xiàn)為高感；在苗期對多數(shù)條銹菌生理小種表現(xiàn)為感病，但成株期具有一定抗性；在成株期表現(xiàn)為中抗且FDS較高，但在苗期對多數(shù)葉銹菌生理小種卻表現(xiàn)出有效抗性。多個抗病基因聚合在一起一般可以提供更高和持久的抗性，本研究中部分品種具有多個抗病基因，苗期和成株期也都表現(xiàn)出良好的抗性。另外成株期抗病基因特別是慢銹基因的抗性一般更為持久，因此在育種中可以聚合多個慢銹基因來培育持久抗葉銹性品種。本研究中鑒定到的7個可能攜帶成株期抗性基因的慢銹品種，可作為抗源用于我國的小麥抗葉銹病育種。