許 昆 張 靜 楊敬平 劉志紅

染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)[1-2]是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù),用于檢測(cè)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)-蛋白質(zhì)相互作用。它基于與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的DNA富集,從而確定各種轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors, TF)[3]、組蛋白[4-5]和其他蛋白質(zhì)[6]結(jié)合位點(diǎn)的位置。TF結(jié)合位點(diǎn)和共價(jià)修飾組蛋白的全基因組分析對(duì)于拓寬對(duì)基因組如何部署以實(shí)現(xiàn)特定基因調(diào)控的理解至關(guān)重要。ChIP與隨后的高通量測(cè)序分析(ChIP-sequence,ChIP-seq)相結(jié)合[7-9],已成為識(shí)別全基因組蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)和了解蛋白質(zhì)在細(xì)胞身份基礎(chǔ)上發(fā)揮作用最泛用和最有效的方法。影響ChIP實(shí)驗(yàn)的因素有很多,如組織或細(xì)胞的類(lèi)型、樣品的起始量、抗體質(zhì)量和獲取的染色質(zhì)質(zhì)量等。因此,有必要優(yōu)化每種組織或細(xì)胞類(lèi)型的染色質(zhì)制備方案,以提高ChIP實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。

脂肪是代謝過(guò)程中能量?jī)?chǔ)存和產(chǎn)熱的組織[10],同時(shí)在免疫過(guò)程中釋放炎癥因子,還可以通過(guò)分泌脂肪因子在內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)揮作用[11-13]。這歸因于脂肪細(xì)胞組成包括了成熟脂肪細(xì)胞以及血管基質(zhì)組分(stromal vascular fraction, SVF)細(xì)胞[14]。成熟脂肪細(xì)胞中大量的油脂使得脂肪組分的ChIP實(shí)驗(yàn)極具挑戰(zhàn),導(dǎo)致細(xì)胞組分分離和從細(xì)胞中回收DNA的過(guò)程特別困難。此外,由于某些部位脂肪組分細(xì)胞數(shù)量有限,ChIP應(yīng)用受限。因此研究人員更傾向于僅在組織水平研究體內(nèi)脂肪[15]或僅研究能夠提供足夠樣本量的部位,如性腺脂肪[16-17]。為了研究特定的脂肪組分和每個(gè)脂肪部位,有必要提高脂肪組分的染色質(zhì)數(shù)量和質(zhì)量。本研究對(duì)不同部位脂肪的兩個(gè)細(xì)胞組分的ChIP實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了一系列優(yōu)化,以獲得更多更高質(zhì)量的染色質(zhì)。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象選擇12周齡的C57BL/6J雄性小鼠, 用濃度為0.2%～0.5%的一氧化碳對(duì)小鼠進(jìn)行安樂(lè)死,隨后使用頸椎脫位確認(rèn)安樂(lè)死,并立即解剖樣品。以75%乙醇對(duì)小鼠進(jìn)行消毒,并確認(rèn)小鼠表面足夠濕潤(rùn),以減少皮毛對(duì)解剖的污染。

不同部位脂肪組織的解剖和獲取分離棕色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT),將小鼠置于俯臥位,用解剖針固定其四肢。然后提起頸部皮膚,沿脊柱至背部中段做垂直切口。剝離皮膚露出肩胛間脂肪庫(kù),剪下蝴蝶形的BAT,去除表面的白色脂肪組織。

分離腹股溝下脂肪組織(inguinal adipose tissue, IAT),將小鼠置于仰臥位并固定四肢。提起胸骨底部的皮膚,從胸骨底部到尾根部做垂直切口。剝離腹、腿部的皮膚,露出與皮膚相連的三角形的IAT并切除。

分離性腺脂肪組織(gonadal adipose tissue, GAT),提起腹膜,從胸骨底部到直腸底部做垂直切口。剝離腹膜后,找到睪丸并用提起GAT,仔細(xì)切除脂肪組織,避開(kāi)睪丸、附睪和血管。

腎周脂肪組織(perirenal adipose tissue, PRAT) 環(huán)繞雙側(cè)腎臟。先將腎臟提起并拉至中線,辨認(rèn)PRAT與其后方的腹膜后脂肪組織(retroperitoneal adipose tissue, RAT)之間的分界線。切除與腎臟直接相連的脂肪組織,并確保將腎臟上方的腎上腺?gòu)闹局刑蕹?/p>

RAT位于脊椎兩旁,沿著腹膜后壁和脊髓之間的邊界分布。在切除PRAT后,使用虹膜剪小心地從腹膜后壁上將其切除。

組織消化解剖完成后將脂肪組織轉(zhuǎn)移至裝有磷酸鹽緩沖冰鹽水(phosphate buffered saline, PBS)的5 mL離心管中,剪成<1 mm的組織塊,再轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,加入適量膠原酶Ⅰ(2 mg/mL)解離緩沖液。組織消化在恒溫37℃搖床(EZ ThermoShake)進(jìn)行,轉(zhuǎn)速100 r/min,30～40 min,消化至看不見(jiàn)組織顆粒的勻漿狀態(tài)時(shí),加入含10%新鮮胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基3 mL 終止消化。勻漿過(guò)濾后在4℃、500 g的條件下離心8 min。

ChIP-seq實(shí)驗(yàn)按文獻(xiàn)方案進(jìn)行[18]。Sonics VCX-130用于超聲片段化染色質(zhì),參數(shù)設(shè)置為每個(gè)循環(huán)開(kāi)啟30 s,關(guān)閉30 s,共15次循環(huán)。使用2 μg抗體[組蛋白H3賴(lài)氨酸27的乙酰化(H3K27ac),Abcam,ab4729;組蛋白H3賴(lài)氨酸4的三甲基化(H3K4me3),Abcam,ab8580]進(jìn)行免疫沉淀。使用DNA Clean & Concentrator-5試劑盒(ZYMO)進(jìn)行純化 DNA。使用NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (E7370)為ChIP樣品構(gòu)建文庫(kù),并由安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司在HiSeq4000上進(jìn)行測(cè)序。

ChIP-seq的分析流程每個(gè)樣本獲得的數(shù)據(jù),使用cutadapt[19]1.18 版本去接頭,并使用參數(shù)“--no-mixed”和“--no-discordant”與 bowtie2[20]2.3.0版本與參考序列進(jìn)行比對(duì)。SAMtools[21]1.3.1 版本、Picard 中的MarkDuplicates和 bedtools 2.25.0 版本用于去除比對(duì)后數(shù)據(jù)中的重復(fù)。 MACS2[22]2.1.2 版用于基因組范圍的結(jié)合峰尋找,參數(shù)“--broad”專(zhuān)門(mén)用于 H3K27ac 的峰。bedGraphToBigWig4.0版本用于將bedGraph文件轉(zhuǎn)換為BigWig文件。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用《R軟件4.0.3》進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算。成熟脂肪細(xì)胞、SVF細(xì)胞優(yōu)化前后DNA含量的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。ChIP-seq數(shù)據(jù)優(yōu)化前后峰的個(gè)數(shù)和FRIP分?jǐn)?shù)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

各部位脂肪組織的解剖順序獲取新鮮的組織或細(xì)胞是ChIP實(shí)驗(yàn)的第一步。因此必須快速進(jìn)行解剖以保持染色質(zhì)的完整性。我們按照BAT、IAT、GAT、PRAT和RAT的順序解剖了小鼠的脂肪庫(kù)(圖1A),5min左右即可完成一只小鼠的五次解剖,至少節(jié)省50%時(shí)間。

SVF細(xì)胞分離方法的優(yōu)化經(jīng)過(guò)解剖、消化和離心的步驟后,獲得了含有新鮮脂肪組分的三層溶液。頂層含有成熟脂肪細(xì)胞,中間層是解離緩沖液,底部沉淀含有SVF細(xì)胞(圖1B)。為了分離成熟脂肪細(xì)胞和SVF細(xì)胞,需要將三層分離開(kāi)來(lái)。通常的做法是,將頂層成熟脂肪細(xì)胞用移液槍轉(zhuǎn)移到新的離心管中,丟棄中間層,隨后將底部的SVF細(xì)胞重懸并留置在管中。按照上述實(shí)驗(yàn)方法,轉(zhuǎn)移脂肪層后大量的油脂牢固地附著在管壁上,在固定過(guò)程中油脂將與SVF細(xì)胞混合并牢固地附著在其細(xì)胞膜上(圖1C)。在超聲裂解染色質(zhì)的過(guò)程中,附著在細(xì)胞膜表面的油脂會(huì)重新釋放到緩沖液中,干擾超聲效率,SVF細(xì)胞的染色質(zhì)片段會(huì)變得過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短,同時(shí)因?yàn)楸尘霸肼暩邔?dǎo)致ChIP結(jié)果不佳。

為了避免出現(xiàn)上述問(wèn)題,本研究?jī)?yōu)化了SVF細(xì)胞的分離。去除頂層和中間層后,先用200 μL PBS快速重懸管底的SVF細(xì)胞,然后迅速轉(zhuǎn)移到新的離心管中,避免從離心管壁中帶出任何油脂(圖1C)。該轉(zhuǎn)移步驟的添加顯著減少了油脂污染。超聲處理后含有染色質(zhì)片段的緩沖液不再被油脂污染,變得清晰透明(圖1D)。 DNA片段大小大致正常分布,長(zhǎng)度為200～500 bp,適合后續(xù)高通量測(cè)序(圖1E)。

圖1 防止SVF細(xì)胞被油脂污染的實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化BAT:棕色脂肪組織;IAT:腹股溝下脂肪組織;GAT:性腺脂肪組織;PRAT:腎周脂肪組織;RAT:腹膜后脂肪組織;SVF:血管基質(zhì)組分;BP:堿基對(duì);橫軸:片段的大小;縱軸:熒光定量;A:按① BAT ② IAT ③ GAT ④ PRAT ⑤ RAT 的順序進(jìn)行解剖;B:離心后分層,從上到下依次為成熟脂肪細(xì)胞、解離緩沖液和SVF細(xì)胞;C:優(yōu)化前:由于油脂牢固地附著在管壁上,SVF細(xì)胞在后續(xù)操作中會(huì)受到污染;優(yōu)化后:使用小體積重懸進(jìn)行額外的轉(zhuǎn)移來(lái)避免油脂污染;D:優(yōu)化前:被油脂污染的染色質(zhì)溶液呈白色混濁;優(yōu)化后:獲得的染色質(zhì)溶液清晰透明,無(wú)油脂污染;E:優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法中獲得的DNA片段的大小分布;此結(jié)果是使用LabChip Touch獲得的

增加成熟脂肪細(xì)胞染色質(zhì)數(shù)量方法的優(yōu)化獲得成熟脂肪細(xì)胞后,繼續(xù)進(jìn)行固定和洗滌。原始實(shí)驗(yàn)方法中,每次進(jìn)行離心后,都是使用移液槍直接將漂浮在頂部的成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的離心管中(圖2A)。由于成熟脂肪細(xì)胞的低表面張力和高黏度,細(xì)胞傾向于留在緩沖液中或黏在管壁和移液槍吸頭上,在轉(zhuǎn)移過(guò)程中細(xì)胞損失很高。

為了減少細(xì)胞損失,本研究選擇抽出下層緩沖液,將成熟脂肪細(xì)胞留在原離心管中,不進(jìn)行轉(zhuǎn)移。由于成熟的脂肪細(xì)胞會(huì)黏附在移液槍吸頭上,改用5 mL注射器來(lái)進(jìn)一步防止細(xì)胞損失(圖2B)。在原管中進(jìn)行固定和三次洗滌,直到細(xì)胞溶解。通過(guò)這些優(yōu)化步驟,可以獲得更多的成熟脂肪細(xì)胞,其DNA獲得量的增長(zhǎng)率為117.2%～150.0%(圖2C,表1)。

提高SVF細(xì)胞染色質(zhì)回收率方法的優(yōu)化除了成熟脂肪細(xì)胞,本研究還嘗試提高 SVF細(xì)胞染色質(zhì)的回收率。在原始方案中,在獲得SVF細(xì)胞后通常對(duì)SVF組分進(jìn)行紅細(xì)胞裂解的操作,可能對(duì)其他細(xì)胞類(lèi)型造成潛在傷害。由于成熟的紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞核,本研究直接省略紅細(xì)胞裂解步驟。改進(jìn)后觀察發(fā)現(xiàn),SVF細(xì)胞的染色質(zhì)回收率顯著增加,其DNA獲得量的增長(zhǎng)率為54.8%～223.7%(圖2D,表1)。

圖2 增加成熟脂肪細(xì)胞和SVF細(xì)胞的染色質(zhì)數(shù)量DNA:脫氧核糖核酸;SVF:血管基質(zhì)組分;H3K27ac:組蛋白H3賴(lài)氨酸27的乙酰化;H3K4me3:組蛋白H3賴(lài)氨酸4的三甲基化。A:成熟脂肪細(xì)胞的原始轉(zhuǎn)移方法導(dǎo)致細(xì)胞大量損失;B:優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法將使成熟脂肪細(xì)胞的數(shù)量增加到兩倍以上;C:成熟脂肪細(xì)胞ChIP-DNA條形圖;D:SVF細(xì)胞ChIP-DNA條形圖;*:與優(yōu)化前比較,P<0.05

表1 實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化前后的樣品和ChIP-DNA的相關(guān)信息

代表性結(jié)果通過(guò)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法,對(duì)制備完成的ChIP庫(kù)進(jìn)行測(cè)序和分析。結(jié)果顯示在SVF細(xì)胞標(biāo)記基因座 Pecam1、Cd34和Cd14以及在脂肪細(xì)胞標(biāo)記基因座Dock6、Pck1和Adipoq的顯著 H3K27ac信號(hào)(圖3A)。使用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)到更多高質(zhì)量的峰和更高的峰讀數(shù)(FRIP)分?jǐn)?shù)(圖3B)。對(duì)于成年雄性小鼠PRAT的成熟脂肪細(xì)胞,使用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案確定了29 282個(gè)高置信度峰,其中 46.02%的峰位于啟動(dòng)子中,24.48%位于內(nèi)含子中,19.29% 位于遠(yuǎn)端基因間區(qū)域。對(duì)于SVF細(xì)胞,使用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案確定了27 203個(gè)高置信度峰,其中 47.61%的區(qū)域位于啟動(dòng)子中,25.49%位于內(nèi)含子中,17.48%位于遠(yuǎn)端基因間區(qū)域(圖 3C)。這些結(jié)果表明,對(duì)脂肪組分的ChIP優(yōu)化方案是有效的,實(shí)驗(yàn)方法同樣適用于體積重量有限的脂肪庫(kù)。

圖3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案后獲得的組蛋白圖譜SVF:血管基質(zhì)組分;UTR:非翻譯區(qū);A:從SVF細(xì)胞(左)和成熟脂肪細(xì)胞(右)的 H3K27ac 的ChIP-seq數(shù)據(jù)生成的標(biāo)準(zhǔn)化bigwig格式文件。Pecam1、Cd34、Cd14(SVF細(xì)胞的標(biāo)記基因)、Dock6、Pck1 和Adipoq(脂肪細(xì)胞的標(biāo)記基因)基因座的基因組瀏覽器視圖;B:ChIP-seq數(shù)據(jù)的峰的個(gè)數(shù)和FRIP分?jǐn)?shù)的條形圖;條形圖表示2次重復(fù)的樣本平均值;與優(yōu)化前比較,*P<0.05,**P<0.01;C:成熟脂肪細(xì)胞和SVF細(xì)胞的H3K27ac的ChIP-seq峰的全基因組分布

討 論

獲得高質(zhì)量染色質(zhì)是ChIP-seq面臨的挑戰(zhàn)之一。本文優(yōu)化了從脂肪組分中制備ChIP實(shí)驗(yàn)所需染色質(zhì)實(shí)驗(yàn)方案,減少了脂肪細(xì)胞損失,可防止油脂污染并提高體積重量有限的脂肪組分中染色質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量。

使用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法,我們從4只小鼠的5個(gè)脂肪庫(kù)中獲得了ChIP實(shí)驗(yàn)所需的足夠的染色質(zhì),并獲得了高質(zhì)量的成熟脂肪細(xì)胞和SVF細(xì)胞組蛋白修飾圖譜。與已發(fā)表的文獻(xiàn)相比,在將每一只小鼠作為一個(gè)獨(dú)立樣本進(jìn)行研究的前提下,研究者更傾向選用GAT這種含量豐富的脂肪組織作為研究材料[16-17],而本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)體積重量有限的脂肪組織尤其奏效。例如,與肥胖相關(guān)的BAT在每只成年雄性小鼠體內(nèi)僅有0.15g[23];在解剖中發(fā)現(xiàn),與腎臟疾病相關(guān)的PRAT數(shù)量更少,一般每只成年雄性小鼠體內(nèi)僅有0.1g左右。然而本文通過(guò)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法,成功地對(duì)BAT和PRAT組分進(jìn)行ChIP-seq,以進(jìn)一步了解其在肥胖和其他相關(guān)疾病中的作用。同樣,本實(shí)驗(yàn)方法也可用于有限的體內(nèi)脂肪組織細(xì)胞組分的研究,不使用體外生長(zhǎng)的誘導(dǎo)細(xì)胞系。因此,本結(jié)果為研究珍貴的稀有脂肪組分的表觀遺傳學(xué)提供了更好的選擇。

在富含油脂的組織或細(xì)胞類(lèi)型的ChIP實(shí)驗(yàn)中,防止細(xì)胞被油脂污染同樣重要。除了脂肪組織,來(lái)自肥胖動(dòng)物的其他組織,如肝臟含有的大量油脂,可能會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)本文優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法,可以獲得沒(méi)有油脂污染的高質(zhì)量染色質(zhì),并得到高信噪比的表觀遺傳圖譜以供進(jìn)一步研究。

總之,本研究?jī)?yōu)化了ChIP實(shí)驗(yàn)方法,可以更好地對(duì)體積重量有限和富含油脂的脂肪組分進(jìn)行表觀遺傳學(xué)研究,為后續(xù)研究脂肪組織相關(guān)疾病如肥胖、糖尿病腎病等提供了可行的實(shí)驗(yàn)方案。