李世軍

腎臟疾病患者因長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑,處于免疫抑制狀態(tài)。免疫功能受損患者感染發(fā)生率高,病原體多而復(fù)雜,診斷更加困難。因此病原學(xué)的精準(zhǔn)診斷對(duì)腎臟疾病免疫抑制伴感染患者精準(zhǔn)診療的價(jià)值毋庸置疑。但傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷高度依賴于臨床醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn),根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)做出病原體的鑒別診斷,針對(duì)可疑的病原體進(jìn)行檢測(cè),存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、陽(yáng)性率低、受抗生素使用,特殊病原體難于檢測(cè)等因素影響,已經(jīng)不能滿足當(dāng)前臨床需要。 宏基因組二代測(cè)序(mNGS)技術(shù)可以快速、無(wú)偏倚地同時(shí)檢測(cè)多種病原體,已廣泛地應(yīng)用于臨床感染性疾病病原檢測(cè),成為助力疑難、危重感染診斷的新方法。

什么是mNGS

mNGS通過(guò)對(duì)臨床樣本的DNA或RNA進(jìn)行鳥(niǎo)槍(shotgun)法測(cè)序。二代測(cè)序(NGS)是一種可同時(shí)對(duì)數(shù)十萬(wàn)到數(shù)百萬(wàn)條DNA分子序列進(jìn)行讀取的測(cè)序技術(shù)。mNGS指對(duì)臨床標(biāo)本中的全部生物(人、微生物)基因組進(jìn)行分析,能夠無(wú)偏倚、無(wú)偏差地檢測(cè)多種病原微生物(病毒、細(xì)菌、真菌及寄生蟲(chóng))的一項(xiàng)技術(shù)。

宏基因技術(shù)是把微生物的核酸打斷成核酸片段后進(jìn)行測(cè)序,微生物的序列數(shù)就是檢測(cè)到多少個(gè)核酸片段屬于該微生物,因此序列數(shù)往往與該病原體的載量正相關(guān)。相對(duì)豐度是指該病原體在檢測(cè)到的同類微生物中的序列占比,由于細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)的微生態(tài)特征、臨床意義不同,它們是獨(dú)立計(jì)算相對(duì)豐度的,如某個(gè)細(xì)菌的相對(duì)豐度是該細(xì)菌在該樣本所有檢出細(xì)菌中所占的百分比。因此相對(duì)豐度越高,表示該病原體在標(biāo)本中的占比越高,但不同大類間的微生物相對(duì)豐度無(wú)法互相比較?；蚪M覆蓋度是指該微生物核酸序列覆蓋到該微生物整個(gè)基因序列的比值,基因組覆蓋度與序列數(shù)有關(guān),序列數(shù)越多,核酸越高,表示該病原體在標(biāo)本中真實(shí)存在的可性能越高。相對(duì)豐度越高,可信度越高;序列數(shù)越多,檢測(cè)結(jié)果越準(zhǔn)確。

mNGS的優(yōu)勢(shì)

診斷時(shí)間大大縮短免疫抑制患者感染通常病情進(jìn)展快,機(jī)會(huì)性感染多,而常規(guī)的微生物培養(yǎng)需要數(shù)日才有結(jié)果,從而延誤診斷。而mNGS最快的24 h內(nèi)即可出結(jié)果,為精準(zhǔn)診斷與治療贏得了時(shí)間。

診斷的陽(yáng)性率提高因?yàn)閭鹘y(tǒng)常規(guī)微生物檢測(cè)比較容易受到微生物數(shù)量的影響,如抗菌素使用后,細(xì)菌的數(shù)量迅速下降或者死亡。而對(duì)于NGS來(lái)說(shuō),只要有病原體的基因存在,不管是否活菌,都能夠檢測(cè)到,大大提高了診斷陽(yáng)性率。

發(fā)現(xiàn)難以培養(yǎng)的病原微生物mNGS可以檢測(cè)到其他傳統(tǒng)手段無(wú)法檢出的病原體。常見(jiàn)如肺孢子菌、支原體、衣原體、軍團(tuán)菌等。肺孢子菌肺炎(PCP)在免疫抑制腎臟病患者合并重癥肺部感染中并不少見(jiàn),可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征,及時(shí)診斷和治療是降低病死率的關(guān)鍵。但PCP早期病原學(xué)診斷困難,病原檢出率低,容易延誤診治。我們通過(guò)mNGS檢測(cè)患者外周血中的病原序列,證實(shí)了mNGS可用于PCP的診斷,具有較高的敏感度(94.59%)和特異度(100%),具有無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn),大大提高了治療的成功率。

發(fā)現(xiàn)繼往認(rèn)為少見(jiàn)的病原體感染mNGS從基因?qū)用婵梢园l(fā)現(xiàn)更多的繼往認(rèn)為少見(jiàn)的感染。我們近來(lái)的臨床工作中先后應(yīng)用mNGS檢測(cè)技術(shù)成功診斷馬爾尼菲籃狀菌合并非結(jié)核分枝桿菌、恙蟲(chóng)病立克次體、鸚鵡熱衣原體及豚鼠耳炎諾卡氏菌等病原體感染,為臨床及時(shí)調(diào)整治療提供了極大幫助。

發(fā)現(xiàn)混合感染免疫力功能低下患者易發(fā)生混合感染,而傳統(tǒng)檢測(cè)方法很難不出現(xiàn)遺漏。與傳統(tǒng)方法相比,病原mNGS 檢測(cè)由于其獨(dú)特的機(jī)制,具有更廣的微生物檢出譜。我們最近的工作也發(fā)現(xiàn)CKD合并肺孢子菌患者中巨細(xì)胞病毒(CMV)血癥陽(yáng)性率高達(dá)57.7%,其免疫缺陷程度更重,預(yù)后較無(wú)CMV血癥者更差。因此,mNGS其對(duì)病原微生物幾乎達(dá)到“一網(wǎng)打盡”效果,能同時(shí)一次性敏感檢出不同類病原體,尤其在細(xì)菌感染合并真菌、病毒、支原體、衣原體或原蟲(chóng)等感染時(shí)更具顯著意義。

如何解讀mNGS報(bào)告

mNGS最大優(yōu)勢(shì)在于快速精準(zhǔn)、高通量檢測(cè),為早期抗感染治療提供證據(jù)支持,正確的解讀同樣是保證mNGS優(yōu)勢(shì)的關(guān)鍵。由于mNGS操作流程復(fù)雜,各個(gè)環(huán)節(jié)均易引入污染,干擾檢測(cè)結(jié)果,且檢出的病原體無(wú)法具體確定是定植菌、背景菌還是致病菌,因此對(duì)于測(cè)序結(jié)果為陽(yáng)性的報(bào)告應(yīng)根據(jù)患者臨床特點(diǎn)、免疫功能狀態(tài),及輔助檢查結(jié)果系統(tǒng)分析、解讀和驗(yàn)證。

陽(yáng)性結(jié)果固然有助于明確感染病原體,陰性結(jié)果亦可用于排除感染性疾病可能。對(duì)于在核酸提取過(guò)程中破壁困難的微生物,如分枝桿菌屬、諾卡菌屬、真菌(主要包括曲霉菌、毛霉菌、隱球菌屬與雙相真菌)等,即使在檢測(cè)報(bào)告中讀數(shù)較低,也要考慮其為致病微生物的可能,并采用其他方法驗(yàn)證。

mNGS作為一種新的檢測(cè)手段,拓寬了微生物檢查的途徑和范圍、彌補(bǔ)了常規(guī)檢測(cè)手段的一些缺憾。mNGS對(duì)腎臟病免疫功能受損不明原因感染,尤其是條件致病病原學(xué)診斷具有更高敏感性,有助于更早識(shí)別病原體和指導(dǎo)治療用藥。