陳江華 王仁定

1998年提出的宏基因組概念最初指土壤標(biāo)本中所有微生物基因組信息的總和,包括無法培養(yǎng)的基因組信息。后來宏基因組概念被應(yīng)用于臨床標(biāo)本中的生物遺傳信息特征。宏基因組二代測序(mNGS)主要通過以二代測序為代表的高通量測序技術(shù),對臨床標(biāo)本進行宏基因組學(xué)分析,從而獲取病原體的分類、血清型、耐藥性以及毒力等一系列生物學(xué)信息。

mNGS是一種直接從患者標(biāo)本中檢測樣本中的所有核酸, 并按等位擴增和測序,允許對所有微生物組(即細菌、病毒、寄生蟲和真菌)、耐藥性標(biāo)記物、毒力因子、甚至與不同疾病狀態(tài)相關(guān)的宿主生物標(biāo)志物進行鑒定。這提供了直接從患者標(biāo)本進行無假設(shè)診斷的優(yōu)勢。mNGS已被證明是檢測多個部位感染的成功診斷工具,包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血流、呼吸道、胃腸道、人工關(guān)節(jié)、泌尿道和眼部。鑒定出的各種病原體包括細菌、分枝桿菌、RNA和DNA病毒、酵母和霉菌、寄生蟲。mNGS在檢測新的、例罕見和非典型病因或接受過治療的患者中尤其成功,因此mNGS 也作為人群中發(fā)現(xiàn)潛在危險和(或)突發(fā)病毒的理想工具。目前在腎臟疾病領(lǐng)域主要集中在腎移植供受體圍手術(shù)期精準(zhǔn)化治療、明確免疫功能低下肺部感染病原菌以及部分泌尿系統(tǒng)感染的檢測。

mNGS助力腎移植供受體圍手術(shù)期精準(zhǔn)化治療

目前我國腎移植的供體主要來源親屬活體捐獻和公民死亡后捐獻,特別是公民死亡后捐獻的供體,由于重癥捐獻者都在監(jiān)護室救治,需要氣管插管,可能使用大量廣譜抗生素等繼發(fā)病毒、耐藥菌、真菌等病原菌感染。對供體的相關(guān)體液包括裝載供體器官的保存液進行mNGS檢測,可以在器官植入受體前或術(shù)后盡早獲得相關(guān)病原菌和病原菌耐藥信息,對決定器官的使用與否,以及器官移植后的精準(zhǔn)抗感染治療具有重要的意義。

對于器官移植受者,由于術(shù)后早期需要使用大劑量免疫抑制劑,對T細胞和(或)B細胞進行抑制和清除,感染表現(xiàn)常不典型和被掩蓋,盡管可以采取相關(guān)體液培養(yǎng),但由于術(shù)后抗生素的使用和培養(yǎng)的時效性問題,使培養(yǎng)結(jié)果的陽性率較低和及時性較差。對受體的相關(guān)體液包括創(chuàng)口引流液進行mNGS檢測, 可以盡早發(fā)現(xiàn)感染病原菌,盡量避免“大包圍”抗生素使用;同時對于無感染依據(jù)的受體,可盡早降低抗生素使用級別,實現(xiàn)圍手術(shù)期的精準(zhǔn)抗感染治療。我們對270例公民死亡后捐獻供腎的術(shù)后引流液采用 mNGS檢測監(jiān)控, 實現(xiàn)了無供體來源的真菌、耐藥菌導(dǎo)致的受體死亡和感染性血管破裂等嚴重并發(fā)癥,同時明顯降低了抗生素使用級別和療程。

mNGS在明確免疫功能低下肺部疾病中扮演重要角色

免疫性腎臟疾病患者常長期接受免疫抑制治療,易造成機體免疫功能低下。免疫功能低下患者的傳染病及感染診斷具有獨特的挑戰(zhàn)性。這一人群中的患者通常出現(xiàn)不尋常病原體感染,具有常見病原體的非典型表現(xiàn),并且更容易合并感染。對免疫功能低下患者的感染性疾病評估可能會耗費臨床醫(yī)生的時間和資源,可能需要大量的微生物學(xué)診斷測試來確定致病病原體或排除感染。

耶氏卡氏肺囊蟲感染在免疫低下沒有采用有效預(yù)防的患者中,常導(dǎo)致嚴重肺部感染甚至患者死亡。既往對于此類的有效診斷是肺泡灌洗液中通過六胺銀染色發(fā)現(xiàn)囊蟲或通過吉姆薩染色確診卡氏肺囊蟲滋養(yǎng)體,特別是后者的判定需要經(jīng)驗豐富的檢驗者才能確診。相關(guān)研究包括我們的研究提示采用mNGS對肺泡灌洗液進行檢測可以明確是否存在耶氏卡氏肺囊蟲感染;肺泡灌洗的實現(xiàn)需要病人能夠耐受氣管鏡檢查或已經(jīng)在呼吸機呼吸支持的患者,對于沒有呼吸機支持而不能耐受肺泡灌洗的肺部感染患者,肺泡灌洗液的mNGS則無法采用;我們的臨床實踐提示采用外周血mNGS同樣可以明確診斷耶氏卡氏肺囊蟲感染。mNGS可以提前明確卡式肺囊蟲感染,為后續(xù)治療提供有力病源學(xué)依據(jù)。

免疫低下患者常存在特殊病毒感染和真菌感染, 如巨細胞病毒感染可以導(dǎo)致嚴重的肺部感染甚至呼吸衰竭。既往的研究提示器官移植后曲霉菌感染75%的病例是臨床診斷, 僅有25%是病原菌確診的。另外,特別是預(yù)后極差的毛霉菌感染對臨床的診治帶來了極大的挑戰(zhàn)。mNGS可以及時發(fā)現(xiàn)病毒感染,并能明確是否合并其他病原菌感染和感染類型,包括少見的病原菌感染(如馬爾尼菲青霉菌),盡早明確病原菌可以為治療贏得時間,挽救患者生命。 mNGS在免疫低下患者特別是肺部感染的病原診斷中扮演相當(dāng)重要的角色。

mNGS檢測在泌尿系統(tǒng)感染的意義

尿液培養(yǎng)是診斷尿路感染的金標(biāo)準(zhǔn),目前有mNGS檢測應(yīng)用于泌尿系感染的研究,尤其是在某些特殊情況下具有更多的優(yōu)勢。但對于一般的尿路感染,最常見的細菌為大腸桿菌,普通的尿液培養(yǎng)可以有效明確病原菌同時可以明確病原菌的藥敏,mNGS由于較高醫(yī)療費用及無法給出細菌的藥敏,在普通泌尿系感染中并不具有優(yōu)勢。對于非免疫低下的病患,泌尿系真菌感染比較少見,但對于免疫低下患者,尿液真菌培養(yǎng)可以獲得臨床效果,mNGS可以作為一項替代的檢測方法,能比較快速地明確真菌感染類型。泌尿系感染中病毒感染少見,常規(guī)的培養(yǎng)無法明確,mNGS優(yōu)勢明顯,可以明確病毒類型,特別是對于腎移植術(shù)后多瘤病毒感染患者, 我們的研究提示采用目標(biāo)區(qū)域捕獲二代測序方法對鑒別多留病毒腎病和急性T細胞介導(dǎo)的小管間質(zhì)性排斥具有一定的意義;對于特殊的尿路感染如結(jié)核桿菌,由于培養(yǎng)耗時,mNGS具有較好的時效性。另外如在免疫力低下的情況下,可能出現(xiàn)少見的馬爾尼菲青霉菌感染,此類真菌容易被檢驗科醫(yī)師所忽略,mNGS具有確診優(yōu)勢。臨床實踐中,腎活檢病理中存在間質(zhì)中性粒細胞浸潤和(或)腎小管中有白細胞管型的疑似感染性相關(guān)間質(zhì)性腎炎,在無法明確病原菌感染時,mNGS可能通過對尿液標(biāo)本和腎臟組織標(biāo)本進行檢測,可以發(fā)現(xiàn)感染病原微生物。因此,在尿路感染中,mNGS在病毒性尿路感染、真菌性尿路感染以及特殊尿路感染如結(jié)核、馬爾尼菲青霉菌等感染的鑒別診斷中具有優(yōu)勢。

mNGS在腎臟疾病領(lǐng)域特別是免疫低下患者中具有較好的應(yīng)用前景,該檢測對臨床樣本直接進行檢測,可以發(fā)現(xiàn)少見病、不典型及新型病原學(xué)。對于無法培養(yǎng)的病毒感染、已暴露在抗生素下以及生長緩慢的病原菌如真菌等具有輔助診斷作用,能夠提供基于精確醫(yī)學(xué)的診斷方法。但臨床醫(yī)師在使用和解讀MNGS時必須了解這些方法的差異和局限性。如mNGS程序中是否包含基于RNA的方法,是否對胞內(nèi)菌采用了破壁處理,檢測結(jié)果是否反映臨床感染還是定植,是否存在污染等問題進行綜合判斷。