高 暢,劉桂敏,曾 紅,2

(1.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300)

棉花黃萎病主要是由大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)引起的一種土傳性植物病害，造成棉花等經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量質(zhì)量下降，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。新疆是中國最大的棉產(chǎn)基地之一[1]，近年來，棉花黃萎病在新疆地區(qū)危害日益加重，2000年，農(nóng)5師0.67hm2棉田發(fā)病嚴(yán)重，發(fā)病率占總棉田的25%。棉花黃萎病在新疆主要植棉地區(qū)普遍發(fā)生，中度及以上病田占比達(dá)48.1%，嚴(yán)重發(fā)生病田占比為24.1%[2]，危害嚴(yán)重，已成為阻礙新疆棉花生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一，而防治棉花黃萎病的生物菌劑有限，所以篩選棉花黃萎病高效拮抗菌株，研究其防病效果及機(jī)制對于棉花黃萎病的生物防治具有重要意義。

棉花黃萎病難以防治的根源是大麗輪枝菌的休眠體微菌核(microsclerotia，ms)具有耐寒耐旱等抗逆特性[3]，可以在土壤中存活10a之久[4]。國內(nèi)外關(guān)于棉花黃萎病防治采取的措施主要有抗性品種選育、改善栽培措施、施用化學(xué)農(nóng)藥等[5]。多菌靈、高錳酸鉀、咪鮮胺是常用的防治棉花黃萎病的化學(xué)農(nóng)藥，能迅速抑制或殺死病原菌，但對土壤和宿主植物破壞性強(qiáng)。以甲基溴作為殺菌劑，利用煙熏法殺死微菌核[6]，僅能緩解棉田地表病害，對于棉花黃萎病土傳性病害防效有限，長期使用造成致病菌產(chǎn)生耐藥性，不能有效抑制土壤中微菌核含量，且對環(huán)境污染嚴(yán)重，因此甲基溴逐漸被淘汰。傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥難以控制微菌核，而生物防治作為一種環(huán)境友好型的方法則可以有效抑制微菌核的存活，降低其致病活性或抑制萌發(fā)，大量研究表明采用生物防治大麗輪枝菌是十分理想的選擇。2004年Tjamos等[7]報(bào)道過一種植物根系促生細(xì)菌PaenibacillusalveiK165作為生物控制調(diào)節(jié)體(BCAS)殺死V.dahliae；2012年薛磊等[8]篩選出6株拮抗性鏈霉菌，通過離體試驗(yàn)利用其發(fā)酵液作用于大麗輪枝菌，結(jié)果表明6株拮抗菌的發(fā)酵液均對大麗輪枝菌微菌核有一定抑制作用，其中B49抑菌效果最好，其抑菌率高達(dá)69.70%；2020年張向月等[9]發(fā)現(xiàn)枝頂孢霉屬內(nèi)生真菌CEF-193對大麗輪枝菌生長及微菌核形成均有抑制作用。因此，可以通過微生物菌劑抑制大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)，保障棉花增產(chǎn)、增收，實(shí)現(xiàn)棉花產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展。

新疆棉區(qū)以連作為主，導(dǎo)致土壤微環(huán)境很難被改善，微菌核長期存活土壤中，使得黃萎病害日趨嚴(yán)重，同時(shí)缺乏有效防治棉花黃萎病的生物菌劑。在前期工作中從新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第1師12團(tuán)連作棉田篩選出一株對棉花黃萎病有明顯抑制效果的拮抗菌株，通過形態(tài)鑒定、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA和gyrB基因序列分析，確定該菌株為TUBP1(Bacillusaxarquiensis)，利用生長速率法和牛津杯法在離體條件下測定拮抗菌株TUBP1發(fā)酵液對棉花黃萎病菌抑菌活性，盆栽試驗(yàn)和小區(qū)生防試驗(yàn)結(jié)果均證明B.axarquiensis對棉花黃萎病生防效果顯著[10]。后期又研究TUBP1對大麗輪枝菌拮抗活性，結(jié)果表明該菌株活性成分為蛋白，此類蛋白能夠破壞大麗輪枝菌細(xì)胞膜，從而進(jìn)入細(xì)胞引起線粒體細(xì)胞膜電位極化，促使其活性氧增加，破壞大麗輪枝菌細(xì)胞造成細(xì)胞凋亡[11]；用TUBP1蛋白處理的大麗輪枝菌其孢子和菌絲出現(xiàn)凹陷萎縮[12]。本研究通過菌核萌發(fā)、共培養(yǎng)試驗(yàn)及盆栽試驗(yàn)檢測TUBP1發(fā)酵液對微菌核的抑制作用，為研制和開發(fā)棉花黃萎病有效生防菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

病原菌菌株：大麗輪枝菌VerticilliumdahliaeATCC36211。

生防細(xì)菌菌株：BacillusaxarquiensisTUBP1，由塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，分離于新疆第1師12團(tuán)棉田土壤。

1.2 試劑及材料

抗生素(青霉素鈉溶液與硫酸慶大霉素混合)、棉花種子、PMMA觀察箱、營養(yǎng)土。

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，水定容至1 000 mL。

Czapek-Dox培養(yǎng)基：蔗糖30 g，NaNO32 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2。

NB培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏5 g/L，pH 7.0。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制備大麗輪枝菌微菌核懸浮液及TUBP1無菌發(fā)酵液 將PDA平板中活化好的V.dahliae打成7 mm的菌餅(2～3個)，接種到100 mL Czapek-Dox培養(yǎng)液中，每瓶培養(yǎng)液加入100 μL(0.05 g/L)抗生素，120 r/min、22 ℃培養(yǎng)3周，離心收集微菌核，無菌水重懸，重復(fù)3次，收集微菌核懸浮液置，4 ℃下保存，備用。

TUBP1接種到NB培養(yǎng)液中，180 r/min、 37 ℃培養(yǎng)48 h，離心收集上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾2～3次，將無菌發(fā)酵液置于4 ℃下保存，備用[13]。

1.3.2 TUBP1發(fā)酵液活性測定 處理組(TM)：100 mL滅菌后PDA培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右，分別取原濃度、5倍和10倍稀釋后的TUBP1發(fā)酵液25 mL加入 PDA平板中。對照組(CK)：以等量無菌水代替處理組混合液中的發(fā)酵液，震蕩混勻后倒板，得到對照組和處理組PDA平板。平板凝固12 h，取100 μL微菌核懸浮液均勻涂板，室溫培養(yǎng)，每隔12 h觀察微菌核萌發(fā)情況。

分別取上述對照組、處理組PDA平板，平板中央接入大麗輪枝菌菌餅，每隔5 d觀察大麗輪枝菌生長狀態(tài)，十字交叉法測量不同處理下菌落大小，根據(jù)菌落直徑計(jì)算發(fā)酵液抑菌率( inhibition rate，IR) ，抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-7 )×100%。

1.3.3 掃描電鏡觀察TUBP1與大麗輪枝菌共培養(yǎng)對其形態(tài)影響 取TUBP1無菌發(fā)酵液與大麗輪枝菌共培養(yǎng)5 d、10 d、15 d菌體，參考電鏡樣品處理步驟[14]進(jìn)行前處理，電鏡觀察。

1.3.4 盆栽試驗(yàn)檢測微菌核萌發(fā)率 10 cm×10 cm(口徑×高度)育苗袋育苗，自然土和營養(yǎng)土(含泥炭、椰糠、珍珠巖、蛭石、復(fù)合花肥等)按比例(1∶1)制成混合土壤，播種后保持土壤濕度，使種子有充足水分萌發(fā)。培養(yǎng)3周的棉苗移栽到PMMA觀察箱(15 cm×15 cm×25 cm，L×W×H),每箱1株棉苗，設(shè)置對照組(CK)、處理組(TM)各5組。箱正面透明可活動的標(biāo)為A面，箱底有孔保持水分流通，土壤同樣采用育苗時(shí)的比例。10 d后棉苗恢復(fù)活性，處理組用TUBP1發(fā)酵液澆灌棉苗(每箱100 mL)，對照組用等量無菌水澆灌，每隔2 d，重復(fù)以上操作。5 d后將微菌核菌懸液加入0.75%瓊脂液中(溫度控制在 45 ℃左右防治破壞微菌核活性)，用磁力攪拌器混勻后倒至A面，凝固后取出，在室內(nèi)晾置24 h，多余水分蒸發(fā)使瓊脂層變成薄層，將A面組裝回箱子。10 d后顯微鏡觀察，微菌核的萌發(fā)數(shù)設(shè)為x未萌發(fā)數(shù)設(shè)為y，分別在A面根尖區(qū)域抽樣，樣方為20 cm2。

相對抑制率=

2 結(jié)果與分析

2.1 TUBP1對大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)及形態(tài)的影響

微菌核萌發(fā)隨時(shí)間不斷增加，前12 h CK組和TM組均無明顯變化，24 h時(shí)開始萌發(fā)，待 72 h CK組微菌核萌發(fā)率達(dá)到85.49%，TM組原發(fā)酵液處理的微菌核萌發(fā)率為62.52%(圖1-A)，5倍和10倍稀釋發(fā)酵液的微菌核萌發(fā)率分別為70.10%(圖1-B)、75.33%(圖1-C)。

CK、TM分別指對照組和處理組；A.TUBP1原發(fā)酵液；B.TUBP1發(fā)酵液5倍稀釋；C.TUBP1發(fā)酵液10倍稀釋

2.2 TUBP1對大麗輪枝菌的形態(tài)影響

培養(yǎng)15 d后，與對照組相比，處理組菌絲生長旺盛且原濃度發(fā)酵液共培養(yǎng)的大麗輪枝菌菌絲較發(fā)達(dá)。施加原濃度發(fā)酵液共培養(yǎng)10 d大麗輪枝菌菌落不產(chǎn)微菌核(圖2-B)，共培養(yǎng)15 d時(shí)菌落邊緣有極少微菌核產(chǎn)生(圖2-C)，由原來的菌核型轉(zhuǎn)變成菌絲型。3個不同培養(yǎng)時(shí)期，處理組菌落直徑隨TUBP1發(fā)酵液濃度增加逐漸降低且始終小于對照組(圖2-D)。

A～C.TUPB1發(fā)酵液與大麗輪枝菌共培養(yǎng)5～15 d菌落形態(tài)，D.不同處理菌落直徑測量；A～D.CK為對照，TM-1表示原濃度發(fā)酵液、TM-2和TM-3表示5倍和10倍稀釋發(fā)酵液，下同

2.3 TUBP1發(fā)酵液對大麗輪枝菌抑菌效果

TUBP1不同稀釋濃度發(fā)酵液對大麗輪枝菌生長均有抑制作用，不同處理抑制率差異顯著(表1)；原濃度發(fā)酵液抑菌效果較好，共培養(yǎng)15 d，其抑菌率達(dá)到64.69%；5、10倍稀釋發(fā)酵液，共培養(yǎng)5 d、10 d、15 d二者抑菌率均低于原濃度 TUBP1發(fā)酵液。

表1 TUBP1不同濃度發(fā)酵液對大麗輪枝菌抑菌率Table 1 Inhibition rate of TUBP1 against Verticillium dahliae

2.4 掃描電鏡觀察TUBP1發(fā)酵液對大麗輪枝菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

通過掃描電鏡觀察(圖3)，施加不同濃度TUBP1發(fā)酵液對大麗輪枝菌表型均有影響。分生孢子及微菌核形成減少，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長菌絲發(fā)生膨脹、斷裂，出現(xiàn)異型，大麗輪枝菌自身形態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，說明該生防菌株TUBP1對棉花黃萎病菌有較顯著的抑制效果。

CK表示對照；C為分生孢子；H代表菌絲；M為微菌核；①菌絲膨脹；②菌絲破裂；③菌絲腫脹；比例尺=30 μm

2.5 盆栽試驗(yàn)中TUBP1發(fā)酵液對微菌核的抑制作用

盆栽試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，處理組的萌發(fā)率低于對照組，相對抑制率為38.95%，表明TUBP1發(fā)酵液對微菌核的萌發(fā)有較好的抑制 作用。

表2 TUBP1發(fā)酵液對棉花黃萎病菌微菌核萌發(fā)的抑制Table 2 Inhibition of TUBP1 on sclerotia germination of Verticillium dahliae

3 討 論

在國家要求“化肥、農(nóng)藥雙減”的背景下生物菌劑在抑制植物病害方面作用日益突出，芽孢桿菌作為一類抗逆性極強(qiáng)的生防菌，可抑制多種植物病原菌。目前已有許多研究將芽孢桿菌與殺菌劑復(fù)配，包括枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等多個種屬，經(jīng)過驗(yàn)證能成功防治多種植物病害[15]。

在本研究中，阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液可通過抑制大麗輪枝菌微菌核的形成控制病原菌生長繁殖，降低棉花黃萎病發(fā)病率。試驗(yàn)表明，阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液在離體、盆栽試驗(yàn)檢測中對大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)具有較強(qiáng)抑制作用。不同培養(yǎng)時(shí)期，阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液均對大麗輪枝菌形態(tài)及菌核萌發(fā)有影響。其中原濃度發(fā)酵液抑菌作用最強(qiáng)；共培養(yǎng)15 d，大麗輪枝菌由菌核型向菌絲型轉(zhuǎn)變，其抑菌率達(dá)64.69%，說明阿薩爾基亞芽孢桿菌發(fā)酵液對大麗輪枝菌抑菌活性顯著且存在濃度依賴性。在掃描電鏡下較直觀地觀察到對照組與處理組差異，隨培養(yǎng)時(shí)間及發(fā)酵液濃度增加大麗輪枝菌菌絲形態(tài)發(fā)生膨脹、斷裂、異型，分生孢子及微菌核形成逐漸減少，進(jìn)一步說明阿薩爾基亞芽孢桿菌對大麗輪枝菌微菌核有較強(qiáng)抑制作用。

微菌核形成量少或不能形成微菌核的大麗輪枝菌，其致病力也會相應(yīng)減弱[16]，微菌核形成量的減少意味著棉花黃萎病的抗逆性休眠體減少，連作棉田的發(fā)病率降低。拮抗植物病原菌的生防細(xì)菌抗逆性強(qiáng)、生長快、種類較多，其中芽孢桿菌應(yīng)用較多，定殖率高，且能夠促進(jìn)植物生長[17]。該研究中的阿薩爾基亞芽孢桿菌易于培養(yǎng)，生長繁殖速度快，在優(yōu)化發(fā)酵工藝[18 -19]基礎(chǔ)上制成活菌生防菌制劑施入土壤，直接作用于大麗輪枝菌微菌核，減少土壤中黃萎致病菌數(shù)量，達(dá)到生防目的。綜上可見，開發(fā)阿薩爾基亞芽孢桿菌生防菌劑防治棉花黃萎病前景樂觀，對新疆棉花黃萎病的生物防治意義重大。