趙 微,崔 璇,趙 蕾

(山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南 250014)

磷是滿(mǎn)足植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素之一，通常以正磷酸鹽的形式吸收，構(gòu)成核酸、生物膜等物質(zhì)，參與多種重要的生化反應(yīng)，但由于磷在土壤中的有效性低，易通過(guò)離子交換吸附、配位吸附和化學(xué)反應(yīng)固定等方式被土壤轉(zhuǎn)化為無(wú)效態(tài)磷[1]，導(dǎo)致世界性耕地普遍面臨著缺磷問(wèn)題，而鐵作為保證機(jī)體生物氧化還原活動(dòng)正常進(jìn)行的重要微量元素，組成多種酶類(lèi)和電子傳遞蛋白，但鐵常以難溶或微溶性化合物形式存在于土壤中，從而造成植物的鐵營(yíng)養(yǎng)缺乏[2]。

木霉菌(Trichodermasp.)是一類(lèi)廣泛存在于土壤中的植物根際有益真菌，可通過(guò)產(chǎn)生酸性磷酸酶、有機(jī)酸等溶磷作用[3-5]以及缺鐵條件下產(chǎn)生嗜鐵素[6-7]等促進(jìn)植物對(duì)磷和鐵等元素的吸收利用。木霉菌在植物根際的有效定殖是其促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)吸收的必要條件，而土壤脅迫因子如缺磷、缺鐵對(duì)木霉菌在植物根際定殖的影響尚不明確。

有研究表明，多種病原菌對(duì)植物的侵染與嗜鐵素有關(guān)[8]，如食源性致病菌沙門(mén)氏菌(Salmonellaenterica)侵染植物與嗜鐵素的生物合成有關(guān)[9]，引起植物葉斑病的病原菌鏈格孢菌(Alternariaalternata)嗜鐵素合成相關(guān)基因AaNPS6敲除后對(duì)柑桔的致病性降低[10]，說(shuō)明胞外嗜鐵素不僅與病原菌的鐵吸收有關(guān)，還參與菌體對(duì)植物的侵染過(guò)程。而木霉菌在植物根部的定殖也與某些因素有關(guān)，如纖維素膨脹因子合成相關(guān)基因swollenin過(guò)度表達(dá)能促進(jìn)里氏木霉菌(Trichodermareesei)在黃瓜根系的定殖[11]，但木霉菌產(chǎn)生的嗜鐵素對(duì)菌體在植物根際定殖的影響尚不明確。本試驗(yàn)利用篩選并鑒定的棘孢木霉菌(Trichodermaasperellum)T6以及獲得的棘孢木霉菌(T.asperellum)嗜鐵素合成相關(guān)基因sidA的敲除突變株[12]，研究磷、鐵脅迫對(duì)菌體在擬南芥根部定殖的影響，為進(jìn)一步完善非生物脅迫下棘孢木霉菌(T.asperellum)對(duì)植物的促生機(jī)制提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材 料 棘孢木霉菌(Trichodermaasperellum)T6、棘孢木霉菌(T.asperellum)sidA基因敲除突變株，由山東師范大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室獲得并保存；擬南芥(Columbia 生態(tài)型)，由齊魯師范學(xué)院能源植物研究中心惠贈(zèng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA(Potato dextrose agar)：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，去離子水定容至1 L。

MS(Murashige & Skoog)固體培養(yǎng)基：30 g蔗糖，50 mL MSⅠ儲(chǔ)液(6.6 g NaCl，33 g NH4NO3，38 g KNO3，3.4 g KH2PO4，7.4 g MgSO4·7H2O，去離子水定容至1 L)，5 mL MSⅡ儲(chǔ)液(4.46 g MnSO4·4H2O，1.24 g H3BO3，1.72 g ZnSO4·7H2O，0.166 g KI，0.05 g Na2MoO4·2H2O，0.005 g CuSO4，0.005 g CoCl2·6H2O，去離子水定容至1 L)，5 mL MSⅢ儲(chǔ)液(5.56 g FeSO4，7.46 g EDTA，去離子水定容至1 L)，5 mL MSⅣ儲(chǔ)液(20 g肌醇，0.1 g鹽酸硫胺素，0.1 g鹽酸吡哆醇，0.1 g煙酸，0.4 g甘氨酸，去離子水定容至1 L)，20 g瓊脂，去離子水定容至1 L,pH調(diào)至5.8。

缺磷MS固體培養(yǎng)基：在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上去除KH2PO4。

缺鐵MS固體培養(yǎng)基：在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上去除FeSO4。

1/2 MS固體培養(yǎng)基：2.32 g MS培養(yǎng)基干粉，15 g蔗糖，20 g瓊脂，去離子水定容至1 L，pH調(diào)至6.0。

無(wú)磷液體培養(yǎng)基：10 g葡萄糖，0.5 g (NH4)2SO4，0.3 g CaCl2，0.3 g MgSO4·7H2O，0.3 g KCl，0.03 g MnSO4，0.03 g FeSO4·7H2O，0.4 g酵母膏，去離子水定容至1 L，pH調(diào)至7.0～7.5。

1.1.3 主要試劑 RNA提取試劑盒、DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa生物科技有限公司；Chrome azurol S(CAS)檢測(cè)液、透明液，磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、利福平等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成、序列測(cè)定由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸液的制備 將棘孢木霉菌(T.asperellum)T6劃線(xiàn)接種于PDA平板，28 ℃培養(yǎng) 7 d，待培養(yǎng)基表面被深綠色孢子覆蓋，用移液器取5 mL無(wú)菌水加入平板中，反復(fù)吹打菌落表面，獲得高濃度孢子懸液。取1 mL孢子懸液加入盛有30 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，內(nèi)含玻璃珠，振蕩15 min，獲得均勻孢子懸液。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，孢子終濃度調(diào)至1×107CFU/mL。

1.2.2 嗜鐵素產(chǎn)量的測(cè)定 利用CAS檢測(cè)法[13]測(cè)定嗜鐵素含量。取2 mL孢子懸液加入100 mL無(wú)磷液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。每24 h取樣4～6 mL，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，加入等體積CAS檢測(cè)液，充分搖勻后暗處理30 min。測(cè)定630 nm處吸光值(As)，未接菌對(duì)照組的吸光值為參比值(Ar)，用去離子水調(diào)零。嗜鐵素含量計(jì)算公式如下：

嗜鐵素含量=[(Ar-As)/Ar]×100%

1.2.3 木霉菌生物量的測(cè)定 采用細(xì)胞干重法[14]測(cè)定木霉菌生物量。將棘孢木霉菌(T.asperellum)T6在不同磷濃度的無(wú)磷液體培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后，抽濾收集菌絲體，50 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱(chēng)量菌絲干質(zhì)量。

1.2.4 嗜鐵素合成相關(guān)基因sidA表達(dá)的半定量測(cè)定 采用RT-PCR檢測(cè)磷濃度對(duì)sidA基因表達(dá)的影響。在不同磷濃度的液體培養(yǎng)基28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)棘孢木霉菌(T.asperellum)5 d后，將菌液移入100 mL離心管中，離心棄上清，將菌絲沉淀用液氮研磨至粉末狀，采用Trizol法提取菌體的總RNA。依據(jù)艾德萊生物試劑盒說(shuō)明書(shū)在RNase-free離心管中構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄體系，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA。以cDNA為模板，以S-RT-F/S-RT-R為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(表1)[12]。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀(guān)察內(nèi)參基因(actin)和(sidA)基因的電泳條帶亮度，分析不同磷濃度下sidA基因的表達(dá)情況。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.5 木霉菌利福平抗性標(biāo)記 將棘孢木霉菌(T.asperellum)T6和sidA基因敲除突變株(記為ΔsidA)分別接種于含10 μg/mL利福平的PDA培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)2 d。挑取菌落形態(tài)與出發(fā)菌株相似的單菌落，分別接種于含50 μg/mL、80 μg/mL和100 μg/mL利福平的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至篩選出能在含200 μg/mL利福平的PDA培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長(zhǎng)的棘孢木霉菌 (T.asperellum)T6和ΔsidA作為標(biāo)記菌株[15]。

1.2.6 標(biāo)記菌株的定殖檢測(cè) 將已消毒的擬南芥種子點(diǎn)種于1/2 MS固體培養(yǎng)基中，4 ℃冰箱中春化3 d。隨后在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，設(shè)置 25 ℃、16 h光照、8 h黑暗處理、光照強(qiáng)度為300 μmol/(m2·s)。選取長(zhǎng)勢(shì)相似的擬南芥幼苗轉(zhuǎn)接至不同處理MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，接種經(jīng)篩選得到的標(biāo)記菌株。

待擬南芥根部被菌絲侵染，將擬南芥放入75%乙醇表面消毒3 min后用無(wú)菌水沖洗，取最后一次沖洗液涂布于含200 μg/mL利福平的PDA平板，28 ℃培養(yǎng)2 d，檢查根表面的消毒效果。將已消毒的擬南芥根部研磨至糊狀，使根組織內(nèi)的標(biāo)記菌株釋放，取100 μL組織懸液稀釋10倍、100倍、1 000倍，涂布于含200 μg/mL利福平的PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，計(jì)算單位為CFU/g[15]。

擬南芥繼續(xù)光照培養(yǎng)2 d后，將植株浸入透明液，4 ℃保存24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察標(biāo)記菌株在擬南芥根部的侵染情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷濃度對(duì)嗜鐵素產(chǎn)量的影響

將棘孢木霉菌(T.asperellum)T6接種于不同磷濃度的培養(yǎng)基中，每24 h測(cè)定發(fā)酵液中嗜鐵素含量。結(jié)果表明，在第5天，無(wú)磷和低磷 (1 μmol/L)條件下嗜鐵素產(chǎn)量顯著高于足磷 (1 mmol/L)濃度，三者嗜鐵素含量分別為： 16.41%、16.77%和6.45%；與足磷培養(yǎng)基相比，無(wú)磷和低磷培養(yǎng)基中菌體嗜鐵素產(chǎn)量分別增加154.42%和160%(圖1)。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對(duì)不同磷濃度菌絲體干質(zhì)量進(jìn)行差異性分析可知，菌絲干質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)，表明磷濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)量影響不大。由此可見(jiàn)，磷充足時(shí)嗜鐵素產(chǎn)量較低，而缺磷脅迫則能促進(jìn)嗜鐵素的產(chǎn)生。

2.2 磷濃度對(duì)嗜鐵素合成相關(guān)基因sidA表達(dá)的影響

sidA基因表達(dá)的半定量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。以?xún)?nèi)參基因actin作為標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)磷條件下電泳條帶最亮，說(shuō)明sidA基因表達(dá)量最多，磷濃度為 1 μmol/L和1 mmol/L的電泳條帶較暗，說(shuō)明sidA表達(dá)量較少。由此在分子水平上證明，缺磷脅迫能促進(jìn)嗜鐵素合成相關(guān)基因sidA的表達(dá)。

圖1 磷濃度(0、1 μmol/L、1 mmol/L)對(duì)嗜鐵素產(chǎn)量的影響Fig.1 Yield of siderophores under different phosphorus concentrations(0，1 μmol/L，1 mmol/L)

2.3 磷脅迫對(duì)棘孢木霉T6和ΔsidA定殖的 影響

在證明擬南芥根部消毒徹底后，采用抗利福平標(biāo)記法測(cè)定磷脅迫對(duì)棘孢木霉菌(T.asperellum)T6和ΔsidA定殖的影響，對(duì)平板中的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。在缺磷(MS-P)培養(yǎng)基中棘孢木霉菌(T.asperellum)T6的定殖量是含磷(MS)培養(yǎng)基的3倍；而ΔsidA在含磷與缺磷培養(yǎng)基中的定殖量卻無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖3-A)；并且無(wú)磷條件下棘孢木霉菌絲分布較為密集，在擬南芥根尖處常聚集成團(tuán)；而足磷處理的菌絲在遠(yuǎn)離根尖處偶有分布(圖3-B)。以上結(jié)果說(shuō)明，磷含量充足以及嗜鐵素合成相關(guān)基因sidA敲除時(shí)，由于棘孢木霉菌嗜鐵素產(chǎn)量明顯減少，菌體的根際定殖能力降低。因此，缺磷脅迫下棘孢木霉菌(T.asperellum)產(chǎn)生的嗜鐵素能夠促進(jìn)菌體在植物根際的定殖。

圖2 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis map for RT-PCR-amplified products

A. 菌體的定殖量; B. 菌體定殖擬南芥根部的顯微照片(標(biāo)尺=10 μm);不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.4 鐵脅迫對(duì)棘孢木霉T6和ΔsidA定殖的影響

圖4是采用抗利福平標(biāo)記法測(cè)定鐵脅迫對(duì)棘孢木霉菌(T.asperellum)T6和ΔsidA在擬南芥根部定殖的影響。結(jié)果表明，缺鐵(MS-Fe)培養(yǎng)基中棘孢木霉菌T6的定殖量是含鐵(MS)培養(yǎng)基的2.1倍；且缺鐵條件下，棘孢木霉菌T6在擬南芥根部的定殖量顯著高于ΔsidA，是突變株的1.9倍(圖4-A)。用倒置熒光顯微鏡對(duì)擬南芥根部進(jìn)行鏡檢發(fā)現(xiàn)，缺鐵培養(yǎng)基中棘孢木霉菌絲已侵入擬南芥根部并產(chǎn)生大量孢子；而含鐵培養(yǎng)基中菌體在擬南芥根際的定殖密度較低(圖4-B)。說(shuō)明在缺鐵條件下，突變株由于嗜鐵素合成相關(guān)基因sidA的缺失，嗜鐵素產(chǎn)量明顯減少，減弱棘孢木霉菌(T.asperellum)的根際定殖能力。因此，缺鐵脅迫下棘孢木霉菌(T.asperellum)產(chǎn)生的嗜鐵素能夠促進(jìn)菌體在植物根際的定殖。

A.菌體的定殖量; B.菌體定殖擬南芥根部的顯微照片(標(biāo)尺=10 μm)

3 討論與結(jié)論

木霉菌是一種應(yīng)用廣泛的植物生防促生真菌，能夠通過(guò)與植物形成共生體、分泌多種酶類(lèi)和代謝產(chǎn)物[16]提高植物對(duì)生物和非生物脅迫的抗性[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌在鐵脅迫下具有通過(guò)非核糖體途徑產(chǎn)生一種或幾種嗜鐵素的能力[19]，提高植物對(duì)土壤難溶性礦質(zhì)元素的利用率。山東師范大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉菌(T.asperellum)不僅在缺鐵脅迫下能夠產(chǎn)生特異性螯合Fe3+的嗜鐵素，將土壤中難溶性鐵轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄澡F[3, 6]，還具有根際定殖能力[5]。本研究利用CAS檢測(cè)法和RT-PCR檢測(cè)法研究磷濃度對(duì)棘孢木霉菌(T.asperellum)嗜鐵素產(chǎn)量和嗜鐵素合成相關(guān)基因sidA表達(dá)量的影響，發(fā)現(xiàn)磷脅迫同樣能夠提高菌體嗜鐵素產(chǎn)量以及sidA基因表達(dá)，具體機(jī)制尚待明確，而磷脅迫對(duì)菌體嗜鐵素合成的影響至今未見(jiàn)報(bào)道。

有文獻(xiàn)報(bào)道，缺磷脅迫能夠促進(jìn)叢枝菌根真菌(AMF)定殖及其與植物根系的相互作用[20-21]，而菌體產(chǎn)生的嗜鐵素與定殖也有一定的關(guān)系，如熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)分泌的熒光嗜鐵素可顯著提高其種子粘附和根際定殖能力[22]。本試驗(yàn)采用抗利福平標(biāo)記法測(cè)定缺磷、含磷以及缺鐵、含鐵下棘孢木霉菌(T.asperellum)T6和sidA敲除突變株在擬南芥根際的定殖能力，發(fā)現(xiàn)棘孢木霉菌絲可以穿透并定殖于植物根表皮和外皮層組織中，且磷、鐵脅迫下棘孢木霉菌(T.asperellum)產(chǎn)生的嗜鐵素能夠促進(jìn)菌體在植物根際的定殖。

水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)介導(dǎo)的信號(hào)通路是目前已知的植物調(diào)控自身防御反應(yīng)的3個(gè)重要信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，致病性腸桿菌歐文氏菌(Erwiniasp.)產(chǎn)生的嗜鐵素chrysobactin(CB)能夠激活水楊酸介導(dǎo)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制PDF1.2(ET/JA pathway)基因表達(dá)，提高菌體對(duì)擬南芥的侵染能力[23]。此外，木霉菌能夠增強(qiáng)WRKY18和WRKY40基因表達(dá)，抑制JAZ蛋白激活JA信號(hào)途徑，并負(fù)調(diào)控防御基因FMO1、PAD3和CYP71A1表達(dá)，通過(guò)短暫抑制植物早期防御反應(yīng)，促進(jìn)菌體在植物根際定殖[24]。由此推測(cè)，可能是由于缺磷、缺鐵脅迫下棘孢木霉菌產(chǎn)生的胞外嗜鐵素不僅有利于菌體從寄主植物中獲得鐵營(yíng)養(yǎng)，還能夠?qū)χ参锓烙磻?yīng)進(jìn)行調(diào)控，從而有益于菌體對(duì)植物根系的粘附與定殖。此研究結(jié)果為進(jìn)一步探究非生物脅迫下棘孢木霉菌對(duì)植物根際定殖和促生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。