鐘雅婷，鄒東霞，廖旺姣，趙鵬飛，黃 寧，羅 輯

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；2.廣西林業(yè)有害生物天敵繁育工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530002）

桉樹Eucalyptus是我國速生豐產(chǎn)林的主要樹種之一，也是廣西的重要經(jīng)濟(jì)林木，具有生長迅速、伐期短、產(chǎn)量高、用途廣、效益好等特點(diǎn)，是優(yōu)良的綠化和工業(yè)兩用林[1]。桉樹輪斑病是一種由Coniella eucalyptorum引起的桉樹葉部真菌病害，可造成桉樹葉片大面積枯斑，影響光合作用，導(dǎo)致芽枯和嫩梢枯等，極大影響桉樹的速生豐產(chǎn)[2-3]。該病全年均可發(fā)生，尤其在7—9月高溫、高濕、多雨季節(jié)擴(kuò)展迅速。植物真菌或細(xì)菌性病害的發(fā)生和發(fā)展與內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)。一方面，植物內(nèi)生菌中可能存在潛伏期的植物病原菌，當(dāng)內(nèi)生菌與植物之間的共生平衡被打破時(shí)，這些病原菌即大量增殖，引起病害的發(fā)生[4]；另一方面，外來病原菌侵入植株，引起內(nèi)生菌群的群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化，病原菌成為內(nèi)生菌群落中的優(yōu)勢種群，導(dǎo)致植株進(jìn)入病理過程[5]。同時(shí)，內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)的改變也可能是造成染病植株癥狀復(fù)雜多樣的原因之一[6]。除此之外，染病植株中還可能存在與病原菌相互促進(jìn)、相伴發(fā)生的微生物，兩者共同加劇了病害的發(fā)展[7]。

森林病害防控是林業(yè)生產(chǎn)首要關(guān)注的研究方向之一。病害的發(fā)生，會導(dǎo)致林木減產(chǎn)甚至死亡，直接影響林業(yè)經(jīng)濟(jì)。因此，研究植物內(nèi)生真菌群落組成和結(jié)構(gòu)，有助于揭示桉樹病害的發(fā)生和發(fā)展機(jī)理。但由于大部分的內(nèi)生真菌均為不可培養(yǎng)的微生物，無法從植物組織中分離，這給全面了解內(nèi)生真菌群落組成結(jié)構(gòu)與病害發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)帶來了較大困難。本研究基于高通量測序，分析輪斑病害葉片內(nèi)生真菌群落的變化，并以輪斑病菌為指示菌，研究對其可能有拮抗作用的菌株。旨在明確桉樹葉內(nèi)輪斑病菌與內(nèi)生真菌間的關(guān)聯(lián)，探討輪斑病菌的致病成因，同時(shí)也為拓展桉樹輪斑病的防控思路奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 桉樹葉樣品的采集與處理

于2020年5月在廣西國有東門林場發(fā)生輪斑病害的桉樹林地（107°51′E,22°20′N）采集樹齡為1.5 a 的尾巨桉葉樣品（尾巨桉基因型暫處于保密階段）。采集地屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，當(dāng)月平均溫度為24～33℃，平均降水量為134 mm。按照“Z”形隨機(jī)選取20～30 棵樹，每棵樹間隔15 m 以上，在每棵樹的東南西北四個(gè)方位、高1.5～2.0 m 處隨機(jī)采集健康葉片（304JN）和有輪斑病病斑的桉樹葉片（304BN）（病斑范圍為葉片表面積的1/5以上），每棵采6～10 片葉。將采集到的健康葉片、病害葉片分別混合，隨后各分為5 組重復(fù)，每組重復(fù)約20 片葉。所有葉片樣品均用無菌水沖洗后晾干，75%乙醇洗滌2 次，每次2 min，2.5%NaClO（含0.1% Tween 80）浸泡5 min，隨后再用無菌水沖洗3 次，晾干后提取基因組DNA，用于內(nèi)生真菌多樣性測定。

1.2 基因組DNA 的提取

用液氮將處理好的桉樹葉樣品研磨成粉末，按 照E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 試劑盒（OMEGA，M5635-02）操作說明書提取樣品基因組DNA。完成基因組提取后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA。

1.3 內(nèi)生真菌多樣性測定

以上述方法提取的基因組DNA 為模板，對真菌ITS rDNA 的ITS1-2 區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。第一輪PCR 擴(kuò)增使用真菌ITS rDNA 通用引物：ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ 和ITS2R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。PCR反應(yīng)體系（30 μL）：2×Taqmaster Mix 15 μL，F(xiàn)/R 引物（10 μM） 各1 μL，DNA10～20 ng，Nuclease-Free Water 補(bǔ)齊總體積至30 μL；PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃復(fù)性30 s，共5 個(gè)循環(huán)；94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃復(fù)性30 s，共20 個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。第二輪PCR 擴(kuò)增以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為DNA 模板，引入Illumina 橋式PCR 兼容引物，反應(yīng)體系（30 μL）：2×Taqmaster Mix 15 μL，F(xiàn)/R 引物（10 μM）各1 μL，第一輪PCR產(chǎn) 物DNA 20 ng，Nuclease-Free Water 補(bǔ)齊總體積至30 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃復(fù)性30 s，共5 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，使用磁珠純化方法對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成高通量雙末端測序，測序平臺為美國Illumina 公司Illumina Miseq ?/Hiseq ?PE300 高通量測序儀。

1.4 測序數(shù)據(jù)的處理與分析

Miseq 測序獲得的paired-end reads 首先根據(jù)overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，區(qū)分樣本后對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行在97%相似度水平下的聚類，獲得分類操作單元（operational taxonomic units，OTU），隨后進(jìn)行OTU 聚類分析和物種分類學(xué)分析。使用包含Shannon、Simpson 等指標(biāo)對樣品進(jìn)行Alpha 和Beta 多樣性分析，研究真菌菌群組成和差異等。

1.5 可培養(yǎng)菌株抑菌作用測定

待測可培養(yǎng)細(xì)菌：解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens、貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis和可培養(yǎng)真菌：青霉Penicillium mallochii均為本實(shí)驗(yàn)室已有保存的菌種；供試病原菌C.eucalyptorumGXLB 株（ITS1-5.8S-ITS2 序列Genbank 登錄號：MW020030）分離自桉樹輪斑病病害葉片，保存于本實(shí)驗(yàn)室。

可培養(yǎng)細(xì)菌對輪斑病菌生長的影響。將待測細(xì)菌接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 rpm 振蕩培養(yǎng)24 h，10 000 rpm 離心10 min，取上清并用0.22 μm 孔徑濾器過濾除菌，獲得無菌發(fā)酵液；將該發(fā)酵液與PDA 培養(yǎng)基混勻（發(fā)酵液終濃度為10%），制作平板，同時(shí)以加入與發(fā)酵液等體積的LB 液體培養(yǎng)基（0.22 μm 孔徑濾器過濾除菌）的PDA 培養(yǎng)基作為對照；在GXLB 株的菌落中打取直徑為6 mm 的菌絲塊，接種在上述PDA 平板上，28℃恒溫培養(yǎng)96 h，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

可培養(yǎng)真菌對輪斑病菌生長的影響。在指示菌的菌落中打取直徑為6 mm 的菌絲塊并接種于PDA 平板中央，同時(shí)打取待測真菌的菌絲塊（直徑6 mm）按照3～4 點(diǎn)接種于平板邊緣，距離指示菌25 mm，距離平板邊緣不得小于10 mm，同時(shí)以僅接種指示菌的平板作為對照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)96 h。采用十字交叉法測量指示菌的直徑，計(jì)算抑菌率。抑菌率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%[8]。

1.6 樣品中GyrA 基因片段的擴(kuò)增

以步驟1.2 提取的基因組DNA 為模板，采用通用引物PCR 擴(kuò)增304JN 和304BN 樣品GyrA 基因片段。GyrA-F：5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGT CCTT-3′ 和GyrA-R：CAAGGTAATGC TCCAGG CATTGCT。PCR 反應(yīng)體系（30 μL）：2×Taqmaster Mix 15 μL，F(xiàn)/R 引物（10 μM）各1 μL，DNA 10～20 ng，Nuclease-Free Water 補(bǔ)齊總體積至30 μL；PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸75 s，共30 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，將PCR 產(chǎn)物交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 OTU 注釋及分析

如表1所示，在對健康葉（5 組重復(fù)）和輪斑病害桉樹葉（5 組重復(fù)）的內(nèi)生真菌測序后獲得554 952 條有效序列。根據(jù)97%相似度對所有序列進(jìn)行同源比對，共聚類成2 798 個(gè)OTUs，其中304JN 樣品為2 037 個(gè)OTUs，共注釋到2 門、15綱、55 目、139 科、238 屬、300 種；304BN 樣品為761 個(gè)OTUs，共注釋到2 門、12 綱、55 目、88 科、130 屬、183 種。

2.2 真菌群落的α 多樣性分析

真菌群落α多樣性檢測結(jié)果顯示（表2），304JN 和304BN 樣品物種覆蓋率均大于97%，提示樣品所構(gòu)建的真菌文庫能有效反映其物種的多樣性，且各組樣品多樣性指數(shù)組內(nèi)偏差較小，數(shù)據(jù)可靠。304JN 樣品中ACE 指數(shù)和Chao 指數(shù)均顯著高于304BN 樣品，說明健康葉片內(nèi)生真菌群落的豐富度明顯高于病害葉片。而兩組樣品的Simpson 指數(shù)和Shannon 指數(shù)雖然略有波動，但無顯著差異，表明葉片染病后內(nèi)生真菌群落多樣性和優(yōu)勢菌種的集中程度均較健康葉片無顯著改變，處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。

表1 304 JN 和304 BN 樣品真菌OTU 聚類及RDP 分類水平統(tǒng)計(jì)Table 1 The fungal OTU clustering and RDP classification level statistics of 304JN and 304BN samples

表2 304JN 和304BN 樣品真菌α 多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)?Table 2 The fungal alpha diversity index statistics of 304JN and 304B samples

2.3 真菌群落的主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）

從OTU 水平上對304JN 和304BN 樣品進(jìn)行PCA 分析（圖1），兩組樣品的真菌群落大致分布在不同區(qū)域，表明304JN 和304BN 樣品真菌的組成和結(jié)構(gòu)存在較大差異。其中，304BN 樣品中有1 組重復(fù)與該組中其他重復(fù)間的距離較遠(yuǎn)，可能是由于該組重復(fù)存在較大偏差所致。

圖1 304JN 和304BN 樣品PCA 分析Fig.1 PCA analysis of 304JN and 304BN samples

2.4 OTUs Venn 分析

桉樹健康和病害葉片樣品內(nèi)生真菌大部分存在交集，又相互獨(dú)立。從Venn 圖來看（圖2），304JN 和304BN 樣品中微生物的OTUs 交叉較多，共有的OTUs 數(shù)量為265 個(gè)，304BN 樣品中與304JN 樣品共有的OTUs 占78.87%。304JN 樣品特有的OTUs 數(shù)量多于304BN 樣品，可能較304BN 樣品擁有更多的特有真菌。

圖2 304JN 和304BN 樣品OTUs Venn 分析Fig.2 The OTUs Venn analysis of 304JN and 304BN samples

2.5 真菌組成及多樣性分析

在種分類階元水平上（圖3），304JN 樣品中排名前三的優(yōu)勢菌種為Uwebraunia australiensis（18.17%）、Passalora californica（7.76%）、Pallidocercos poraventilago（3.67%）；304BN樣品中排名前三的優(yōu)勢菌種為C.eucalyptorum（57.43%）、Talaromyces thailandensis（18.60%）、Teratosphaeria agapanthi（13.09%）。其中，304BN樣品中U.australiensis、P.californica、P.ventilago的豐度明顯低于304JN 樣品（P＜0.05），而C.eucalyptorum的豐度則較304JN 樣品顯著增高（P＜0.01）；304JN 和304BN 樣品中T.thailandensis和T.agapanthi的豐度均無顯著差異。此外，在304BN 樣品中Fusicladium eucalypticola、Fellomyces horovitziae、Cutaneotrichosporon cyanovorans、Fellomyces mexicanus的豐度明顯高于304JN 樣品（P＜0.05）（表3）。

圖3 304JN 和304BN 樣品在種水平的組成Fig.3 Composition of bacteria in 304JN and 304BN samples at the level of species

表3 304JN 和304BN 樣品中優(yōu)勢真菌菌群豐度差異Welch’s t-test 比較?Table 3 The differences in the abundance of dominant fungal populations in 304JN and 304BN samples by Welch’s t-test

2.6 桉樹病害病原真菌豐度差異比較

采用Welch’s t-test 法對種分類水平上304JN和304BN 樣品中桉樹病害病原真菌豐度進(jìn)行比較。在樣品中共發(fā)現(xiàn)有3 種可能的病原真菌，包括桉樹輪斑病菌、花斑病病原菌Aureobasidium pullulans和枝枯病病原菌Lasiodiplodia theobromae。結(jié)果表明（表4），304BN 樣品中桉樹輪斑病菌的豐度明顯高于304JN 樣品（P＜0.01）。兩組樣品中均存在花斑病病原菌和枝枯病病原菌，但上述兩種病原菌在樣品中的豐度極低，且無顯著差異。

2.7 可培養(yǎng)菌株對輪斑病菌生長的影響

結(jié)果表明（表5），P.mallochii對C.eucalyptorum的生長無抑制作用，而B.amyloliquefaciens、B.velezensis、B.subtilis均對C.eucalyptorum的生長有不同程度的抑制作用。其中，B.velezensis對C.eucalyptorum的抑制率最高。為了明確桉樹健康葉和輪斑病害葉內(nèi)是否存在B.velezensis，對兩組葉片樣品中GyrA 基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明在健康桉樹葉中可以檢測到B.velezensis，而輪斑病害葉中則未能檢測到，提示在健康桉樹葉內(nèi)含有B.velezensis，而輪斑病害葉片中不含有或含量很低，這可能是其與輪斑病菌之間存在相互拮抗作用。

表4 304JN 和304BN 樣品中桉樹病害病原真菌菌群豐度差異Welch’s t-test 比較Table 4 Comparison of abundance differences of Eucalyptus disease pathogenic bacteria in BCN and BS samples by Welch’s t-test

表5 可培養(yǎng)菌株對輪斑病菌的抑制率Table 5 Inhibition rates of cultivable strains to B.velezensis

3 討 論

本研究采用ITS rDNA 和Illumina Miseq 技術(shù)分別對健康桉樹葉和輪斑病桉樹葉的內(nèi)生真菌群落組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩組樣品的真菌組成和結(jié)構(gòu)存在較大差異，其中輪斑病害桉樹葉內(nèi)的真菌群落種類和豐富度均明顯低于健康葉，表明輪斑病病原菌侵染引起了桉樹葉內(nèi)原有真菌菌群種類和數(shù)量的下降。在山茶灰斑病、棗樹棗縮果病和漆樹潰瘍病的研究中也得出了類似的結(jié)果，即在病原菌的脅迫下，染病植株葉片的內(nèi)生菌種類和數(shù)量均少于健康植株[9-11]。桉樹和上述不同樹種的研究結(jié)果表明，健康植株組織中的內(nèi)生菌群具有更好的穩(wěn)定性，能夠抑制病原菌的發(fā)展。但在赤松梢枯病、柑橘黃龍病的研究中，染病葉片內(nèi)生菌的豐富度則大于健康葉片[12-13]，推測可能與病原菌侵染的不同階段對植株內(nèi)生菌群的影響程度不同有關(guān)，而桉樹輪斑病菌是否也存在這一現(xiàn)象還需進(jìn)一步深入研究。除此之外，健康植株在受到病原菌脅迫后，內(nèi)部菌群的種類和數(shù)量上升或降低還與植株本身應(yīng)對外界壓力所表現(xiàn)的應(yīng)答能力有關(guān)[14-16]。

在對健康和輪斑病桉樹葉內(nèi)生真菌組成的分析中，我們發(fā)現(xiàn)輪斑病菌C.eucalyptorum在健康葉和病害葉中均有分布，在健康葉中的豐度較低，在病害葉中則占據(jù)優(yōu)勢地位，可見輪斑病菌引起病害發(fā)生的先決條件是須在桉樹葉上定殖并成為優(yōu)勢類群。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)U.australiensis、P.californica和P.ventilago在健康桉樹葉中為優(yōu)勢菌，而在病害葉中的豐度明顯降低，推測上述真菌可能在維持桉樹葉內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，這些優(yōu)勢菌群的豐度降低可能引起桉樹葉部群落性質(zhì)和微環(huán)境改變，最終導(dǎo)致輪斑病害的發(fā)生。但目前尚未有U.australiensis、P.californica和P.ventilago對輪班病菌的生長具有抑制作用的報(bào)道，因此還需開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。此外，染病植株中還可能存在與病原菌伴生的微生物。有報(bào)道顯示，茶樹葉中的茶樹輪斑病菌Pestalotiopsis theae與茶樹云紋葉枯病菌Guignardi camelliae、山茶葉中的G.camelliae與山茶灰斑病菌Pestalotiopsis guepini之間均存在相互促進(jìn)，伴生發(fā)生的現(xiàn)象[17,9]，表明某種病害的發(fā)生可能并非單一致病菌參與其中。在本研究中，我們也在輪斑病害桉樹葉中檢測到了花斑病菌A.pullulans和枝枯病菌L.theobromae的存在，但兩者在病害葉中的豐度與健康葉無顯著差異，表明A.pullulans、L.theobromae與C.eucalyptorum之間可能并不存在伴生關(guān)系。但有意思的是，我們在輪斑病害桉樹葉中檢測到F.eucalypticola、F.horovitziae、C.cyanovorans、F.mexicanus的豐度較健康葉顯著增高，推測可能是由于C.eucalyptorum成為優(yōu)勢菌后引起了桉樹葉內(nèi)微環(huán)境的改變，繼而為F.eucalypticola、F.horovitziae、C.cyanovorans、F.mexicanus的生長創(chuàng)造了適宜條件，促進(jìn)了這些真菌的生長，而上述真菌是否與C.eucalyptorum存在伴生關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)B.velezensis對輪斑病菌的生長均有較強(qiáng)的抑制作用。B.velezensis對多種植物的病原菌均具有較強(qiáng)的拮抗作用，如馬鈴薯瘡痂病菌Streptomyces scabies、煙草青枯病菌Ralstonia solanacearum、水稻稻瘟病Magnaporthe oryzae等[18-20]，具有良好的生防應(yīng)用價(jià)值。我們在健康桉樹葉中也檢測到了B.velezensisGyrA 基因片段，而在輪斑病害桉樹葉中則未能檢測到，推測在病害桉樹葉內(nèi)C.eucalyptorum可能抑制了B.velezensis的生長，這也進(jìn)一步證明B.velezensis與輪斑病菌之間存在相互拮抗作用。但目前對于B.velezensis拮抗病原菌的機(jī)制尚不清楚，推測可能與其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)有關(guān)。B.velezensis所屬的芽孢桿菌屬是一類重要的植物病原菌拮抗菌，易于定向分離，能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如多肽類、脂肽類、蛋白類等，是自然界中廣泛存在的非致病菌[21-23]。在本研究中，B.velezensis對輪斑病菌顯示出了較好的拮抗作用，且該菌作為桉樹葉的內(nèi)生菌，定植能力強(qiáng)，在葉片內(nèi)增殖后能夠更好地與病原菌競爭空間和營養(yǎng)，從而抑制病原菌的生長，最終發(fā)揮防治病害的作用，因此有望作為一種新的生物防治手段。但上述結(jié)果僅是從菌株在實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下的拮抗實(shí)驗(yàn)中獲得，存在一定的局限性，因此下一步還需在桉樹苗上進(jìn)行致病性接種實(shí)驗(yàn)，用來驗(yàn)證B.velezensi拮抗C.eucalyptorum的效果。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)桉樹葉部內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)受到輪斑病菌侵染的影響，導(dǎo)致染病葉內(nèi)生真菌群落的豐度下降。貝萊斯芽孢桿菌對桉樹輪斑病菌的生長具有拮抗作用，但該菌的有效活性成分在室外的穩(wěn)定性、適應(yīng)性和生防效果還有待進(jìn)一步深入探索。目前桉樹輪斑病仍以化學(xué)防治為主，利用生防制劑防治該病害鮮有報(bào)道，因此貝萊斯芽孢桿菌的生防機(jī)制值得深入研究。