黎婷玉，陳瑤瑤，張彥，熊建文，郭壯，王玉榮*

1(湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽，441053) 2(湖北文理學院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽，441053) 3(酵母功能湖北省重點實驗室 安琪紐特股份有限公司，湖北 宜昌，443003) 4(柳州工學院 柳州市螺螄粉植物源性配料研究重點實驗室，廣西 柳州，545616)

酸筍是以新鮮竹筍為主要原料，經(jīng)過發(fā)酵而成的一類傳統(tǒng)泡菜，富含纖維素和多種礦物質(zhì)元素[1]。目前，除了對其風味物質(zhì)有研究外，部分學者還針對其微生物類群方面展開了研究。孫寧等[2]使用MRS培養(yǎng)基從自然發(fā)酵的酸筍中分離得到了69 株乳酸菌，分別隸屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)；陳正培等[3]對柳州酸筍中具有降解亞硝酸鹽特性的乳酸菌展開了篩選工作，得到了1 株亞硝酸鹽降解率達76.58%(亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為625 mg/mL)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)；周金沙等[4]采用Illumina MiSeq測序技術(shù)解析廣西無鹽發(fā)酵酸筍的細菌多樣性，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)為優(yōu)勢菌屬。上述研究均表明酸筍中乳酸菌類群含量較高。然而目前的研究大多僅從純培養(yǎng)方式或測序技術(shù)單方面來進行解析，而更全面地揭示酸筍中細菌及乳酸菌類群的研究較為少見。

酸筍是南寧最知名的小吃“老友粉”中必不可少的特色調(diào)味料，因而解析南寧地區(qū)酸筍的細菌類群具有一定的代表性。當?shù)貍鹘y(tǒng)酸筍的做法通常是將新鮮竹筍切成塊狀、條狀或絲狀后，用涼白開或泉水直接浸泡，不添加食鹽及其他調(diào)味料，經(jīng)過15～30 d密封發(fā)酵即可[5]。本研究在采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對南寧地區(qū)酸筍細菌類群結(jié)構(gòu)進行解析的基礎(chǔ)上，進一步預測其細菌類群的功能特性，并結(jié)合純培養(yǎng)方式對酸筍中的乳酸菌菌株進行分離、鑒定和保存。以期在相關(guān)產(chǎn)業(yè)對酸筍發(fā)酵條件進行優(yōu)化的過程中提供參考依據(jù)和菌株支持。

1 材料與分析

1.1 材料與試劑

5 個酸筍樣品均于2019年8月采集自廣西壯族自治區(qū)南寧市(E 108°22′，N 22°49′)北湖、淡村和五里亭菜市場，所有樣品均為當?shù)剞r(nóng)戶手工制作，編號依次為SS1～SS5。使用無菌自封袋包裝樣品并貼上標簽置于保溫采樣箱中運送回實驗室。

基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司；338F/806R和27F/1495R正反向引物，武漢天一輝遠生物科技有限公司；DNA聚合酶、rTaq酶、10×Buffer和dNTP，寶生物工程(大連)有限公司；MRS和LB瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

Veriti FAST梯度PCR儀，美國ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Protein Simple公司；Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺，美國Illumina公司；R930型機架式服務(wù)器，美國DELL公司；DG250型厭氧工作站，英國Don Whitley公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 宏基因組DNA的提取、PCR擴增和高通量測序

酸筍宏基因組DNA的提取：5份樣品各稱取2 g，參照提取試劑盒說明書提取酸筍宏基因組DNA。

PCR擴增和高通量測序：針對檢測合格的基因16S rRNA V3～V4區(qū)域進行PCR擴增和清潔。為方便后續(xù)進行序列配對，在正反引物中添加1組barcode(核苷酸標簽，含7個堿基)，PCR擴增體系和程序均參照王強等[6]的方法進行操作，將純化后的產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序。

1.3.2 序列質(zhì)控和生物信息學分析

參照崔夢君等[7]的方法對測序返回的fq序列文件進行質(zhì)控，質(zhì)控合格的序列上傳至QIIME(v1.9.1)分析平臺進行生物信息學分析。分別按照100%和97%相似度對有效序列進行序列歸并和構(gòu)建分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)[8]，同時將含有嵌合體序列的OTU進行刪除[9]，選擇余下OTU代表性序列在RDP[10]、SILVA[11]和Greengenes[12]數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，并注釋其分類學地位。在此基礎(chǔ)上，進一步使用PICRUSt軟件預測酸筍細菌的基因功能[13]，參照蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫(clusters of orthologous groups of proteins，COG)進行功能注釋[14]。

1.3.3 乳酸菌的分離鑒定

稱取10 g粉碎后的酸筍添加到90 mL生理鹽水(高溫高壓蒸汽滅菌)中混合均勻，37 ℃，220 r/min的搖床中振蕩30 min。參照倪慧等[15]的方法對酸筍中乳酸菌菌株進行初步分離、純化與鑒定，并對過氧化氫酶陰性且革蘭氏陽性的菌株進行保藏。菌株鑒定流程：(1)菌株DNA提?。?2)PCR擴增；(3)瓊脂糖凝膠檢測擴增產(chǎn)物；(4)PCR產(chǎn)物清潔；(5)連接轉(zhuǎn)化；(6)挑取陽性克隆子。將擴增成功的陽性克隆子送至天一輝遠(武漢)生物科技有限公司進行測序，返回的序列在NCBI網(wǎng)站進行比對[16]，并完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2017軟件繪制曲線圖與柱形圖，使用R(v4.0.1)軟件繪制菌群功能熱圖，使用在線作圖網(wǎng)址(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)繪制Venn圖，使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

納入本研究的5個酸筍樣品經(jīng)測序共得到219 111條高質(zhì)量序列，平均每個樣品含有43 822條序列。本研究首先基于香農(nóng)指數(shù)曲線和等級聚類曲線分析了樣本測序深度及物種豐富度(圖1)。

a-香農(nóng)指數(shù)；b-等級聚類圖1 香農(nóng)指數(shù)曲線和等級聚類曲線Fig.1 The curves of Shannon index and rank abundance

樣品SS1～SS5分別測得48 177、34 600、45 896、38 194和52 244條高質(zhì)量序列，且當測序深度達到10 000條左右時，所有樣品的香農(nóng)指數(shù)曲線就均已到達平臺期(圖1-a)，表明若測序深度繼續(xù)增加，酸筍的細菌多樣性不會再發(fā)生較大變化，說明本研究的測序深度合理，能夠滿足后續(xù)分析要求。樣品SS5的曲線最平緩且跨度最大，樣品SS2的曲線最陡峭且跨度最小(圖1-b)。表明相較于其他樣品，樣品SS5的物種豐富度最高也最均勻，樣品SS2的物種豐富度最低，不同樣品在物種豐富度上呈現(xiàn)出一定的差別。

2.2 基于細菌門和屬水平細菌多樣性分析

本研究進一步基于門和屬水平對酸筍的細菌類群進行分析，5個酸筍樣品中的細菌類群共鑒定到了8個門和77個屬，其中平均相對含量>0.5%的門和屬見圖2。酸筍中含有2個平均相對含量>0.5%的門，分別為硬壁菌門(Firmicutes，99.05%)和放線菌門(Actinobacteria，0.53%)(圖2-a)。其中Actinobacteria在除SS1(0.65%)和SS5(1.74%)外的其他樣品中占比均<0.25%。顯然，F(xiàn)irmicutes為酸筍中的優(yōu)勢門。乳桿菌屬(Lactobacillus)為酸筍中唯一的平均相對含量>0.5%的細菌屬，其平均相對含量高達98.41%。除此之外，在樣品SS4中相對含量>0.5%的屬還包括魏斯代菌屬(Weissella，0.84%)，樣品SS5中包括棒狀桿菌屬(Corynebacterium，0.65%)和異常球菌屬(Deinococcus，0.58%)(圖2-b)。由此可見，酸筍中的細菌類群主要為隸屬于Firmicutes的Lactobacillus。陳曉東等[17]采用第2代測序技術(shù)解析廣西壯族自治區(qū)柳州市和桂林市等6個地區(qū)的酸筍樣品時得到了類似的結(jié)論。而鮑偉等[18]在使用同種方法解析浙江傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜(如臭冬瓜、臭莧菜梗、酸筍和酸茭白等)的微生物類群過程中卻發(fā)現(xiàn)，酸筍汁和酸筍固形物中的優(yōu)勢細菌屬分別為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和埃希菌屬(Escherichia)。這表明不同地域，其環(huán)境等因素的不同可能導致當?shù)厮峁S中微生物類群亦有較大的差別，因而解析不同地區(qū)的酸筍細菌類群有助于全面認識酸筍中的微生物種類及特征。

a-細菌門；b-細菌屬圖2 酸筍中相對含量>0.5%的細菌門和細菌屬Fig.2 The phylum and genus with relative abundance more than 0.5% in fermented bamboo shoots

2.3 基于OTU水平細菌類群分析

本研究進一步從OTU水平來解析酸筍中的細菌類群，并利用韋恩圖展示各樣品中OTU的分布情況(圖3)。檢測出的全部有效序列經(jīng)97%相似度劃分得到1 333個OTU，每個樣品平均包含533個OTU，樣品SS1～SS5中分別含有547、237、421、425和1 037個OTU，特有OTU數(shù)分別為68、9、20、92和355個，包含的序列數(shù)占總序列數(shù)的比例依次為0.39%、0.05%、0.10%、1.14%和3.95%，而5個樣品中共有的OTU數(shù)量為65個，所包含的序列數(shù)占總序列數(shù)的90.63%。由此可見，盡管不同樣品間共有的物種種類并不多，但其在數(shù)量上卻占到了極大的優(yōu)勢。

圖3 各酸筍樣品中的OTU分布韋恩圖Fig.3 OTU Venn diagram of fermented bamboo shoots

所有樣品共同含有的平均相對含量>0.5%的核心OTU共有6個，分別為OTU4296、OTU5648、OTU1388、OTU220、OTU4815和OTU2404，平均相對含量分別為79.99%、1.96%、0.95%、0.78%、0.70%和0.68%(圖4)。

圖4 平均相對含量>0.5%的核心OTUFig.4 Analysis of core OTU with average relative abundance more than 0.5%

值得注意的是，上述6個OTU均隸屬于Lactobacillus，累計相對含量達85.07%，這一結(jié)果表明南寧地區(qū)酸筍中的核心細菌類群為Lactobacillus。有研究指出，隸屬于Lactobacillus的部分種，例如L.plantarum所產(chǎn)生的乳酸和乙酸等能夠破壞細菌的細胞膜從而產(chǎn)生抑菌效果，這一特性可能對酸筍的食用安全品質(zhì)起到了一定的積極作用[19]。

2.4 酸筍細菌類群的功能預測分析

在對酸筍細菌類群結(jié)構(gòu)進行解析的基礎(chǔ)上，本研究還預測了其細菌類群所具有的潛在功能，全部有效序列通過PICRUSt預測共得到4 045個COG，分別注釋到了22個功能大類(圖5)。酸筍中的細菌類群除了在翻譯、轉(zhuǎn)錄和細胞膜生物發(fā)生等維持細胞自身生長繁殖的功能上具有較高的表達以外，在氨基酸和碳水化合物的轉(zhuǎn)運與代謝上也具有較高表達。這可能是由于蛋白質(zhì)和糖類常被作為微生物發(fā)酵的營養(yǎng)物質(zhì)來源，而微生物類群在消耗營養(yǎng)物質(zhì)的過程中會引發(fā)一系列的產(chǎn)物轉(zhuǎn)運和代謝反應(yīng)。朱照華[20]比較了新鮮與發(fā)酵過的毛竹筍(后面統(tǒng)稱為酸筍)的營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)酸筍中的蛋白質(zhì)和總糖含量相對新鮮竹筍大幅減少，而膳食纖維含量有所上升，這表明酸筍中的微生物類群對其本身營養(yǎng)物質(zhì)的含量變化有著較大的推動作用。

圖5 不同酸筍中細菌類群基因功能分析熱圖Fig.5 Heat map of gene function analysis of bacterial communities in different fermented bamboo shoots

2.5 乳酸菌多樣性分析

測序結(jié)果顯示酸筍中乳酸菌含量豐富，為進一步明確其中乳酸菌類群，本研究結(jié)合了傳統(tǒng)微生物學方法對其乳酸菌進行了選擇性培養(yǎng)。不同分離株的菌落形態(tài)如表1所示，分離株的菌落形態(tài)均為圓形，表面光滑；過氧化氫酶多為陰性，革蘭氏染色均為陽性，鏡檢發(fā)現(xiàn)其細胞形狀均為桿狀。

從酸筍中分離的菌株SS-1、SS-2、SS-3和SS-4分別被鑒定為發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、黑氏乳桿菌(L.hammesii)、沙克乳桿菌(L.sakei)和副蕈狀芽胞桿菌(Bacillusparamycoides)，隸屬于Lactobacillus的分離株含量占到75%(圖6)。

表1 不同分離株的形態(tài)學特征Table 1 Morphological characteristics of different strains

圖6 酸筍中分離株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strains isolated from fermented bamboo shoots

MiSeq高通量測序結(jié)果顯示Lactobacillus在酸筍中的平均相對含量高達98.41%，但通過純培養(yǎng)卻只分離出3株乳桿菌。導致這種數(shù)量上的差異原因可能有2個：一是由于即使樣品基質(zhì)中的微生物已經(jīng)失去活性或者死亡，但只要其DNA沒有降解，MiSeq高通量測序技術(shù)就仍可以實現(xiàn)序列擴增[21]；另一個可能是MRS培養(yǎng)基成分中缺少了酸筍中大部分乳酸菌所必需的營養(yǎng)元素，使其無法被培養(yǎng)出來。因而在后續(xù)研究中可以考慮采用培養(yǎng)組學的方法對酸筍中乳酸菌進行分離培養(yǎng)。

除此之外，測序結(jié)果并未顯示出酸筍中含有芽胞桿菌屬，但在純培養(yǎng)過程中卻分離出了1株芽胞桿菌。原因可能為芽胞桿菌屬是空氣中的常見菌屬之一，樣品在預處理過程中接觸了外界空氣，從而使其進入樣品，繼而被分離出來。

3 結(jié)論

MiSeq高通量測序結(jié)果顯示南寧地區(qū)酸筍的細菌類群主要隸屬于Lactobacillus，且在氨基酸和碳水化合物的轉(zhuǎn)運與代謝功能上有著較高表達；同時乳酸菌分離鑒定結(jié)果顯示分離株亦主要隸屬于Lactobacillus?？梢姀V西南寧地區(qū)的酸筍中細菌菌群主要為乳桿菌。