谷懿寰，江正強，劉軍，楊紹青

(中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京，100083)

多糖是一類天然高分子聚合物，廣泛存在于植物、動物、藻類和微生物中，通常由10個以上單糖通過直鏈或支鏈糖苷鍵連接而成[1]。胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是微生物在生長過程中分泌到細胞外的多糖化合物，具有使細胞免受外界不利環(huán)境因素影響、參與黏附和定植等生理作用[2-4]。根據(jù)單糖組成的不同，EPS可分為由一種單糖組成的同多糖和由兩種及以上單糖組成的雜多糖。乳酸菌是發(fā)酵糖類產(chǎn)物主要為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱[5]。乳酸菌是傳統(tǒng)的發(fā)酵劑，在食品工業(yè)中有著悠久的應用歷史[6]，是公認的安全微生物(Generally Recognized as Safe, GRAS)[7]，其代謝所產(chǎn)的EPS也被普遍認為是食用安全的[8]。產(chǎn)EPS的乳酸菌可應用于酸乳的生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中原位產(chǎn)生的EPS可提高酸乳的黏度，改變酸乳的流變特性[9]。除此之外，乳酸菌所產(chǎn)EPS還具有多種有益健康的生理活性。

乳桿菌、乳球菌、鏈球菌和片球菌等乳酸菌均可以產(chǎn)生不同結構的EPS。戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)是重要的乳酸菌之一，目前關于戊糖片球菌EPS的研究較少，已有報道的戊糖片球菌EPS潛在生理活性包括抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等。從泰國熱帶水果中分離出產(chǎn)EPS的戊糖片球菌LY45[10]，所產(chǎn)EPS由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，能夠抑制透明質(zhì)酸酶活性，其IC50與抗炎劑色甘酸鈉和甘草酸二鉀相同。海洋來源的戊糖片球菌M41[11]所產(chǎn)EPS主要由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，分子質(zhì)量為682.07 kDa，有抗氧化能力(DPPH和ABTS)，能抑制與糖尿病有關的α-淀粉酶和α-葡糖苷酶活性，抑制結腸癌細胞Caco-2和乳腺癌細胞MCF-7生長。關于戊糖片球菌EPS影響益生菌生長的研究報道相對較少。本文從內(nèi)蒙古牧民自制的奶豆腐中分離鑒定出一株產(chǎn)EPS的戊糖片球菌，研究了該菌株對酸和膽鹽耐受性及模擬消化后的存活率，進一步探究了其所產(chǎn)EPS的結構，及其作為唯一碳源對乳桿菌增殖的影響。研究結果有望為乳酸菌資源的開發(fā)和EPS的應用提供一定的基礎和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶豆腐，內(nèi)蒙古家庭自制；MRS肉湯培養(yǎng)基、豬膽鹽，北京奧博星生物技術有限公司；瓊脂，北京拜爾迪生物技術有限公司；NaCl、CaCO3、三氯乙酸，上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸、硫酸，國藥集團化學試劑有限公司；葡聚糖標準品，美國聚合物標準品公司(APSC)；葡萄糖，現(xiàn)代東方(北京)科技發(fā)展有限公司；細菌通用引物27F和1492R，生工生物工程(上海)股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；HBI乳酸菌生化鑒定條(GB)，海博生物；透析袋，上海源葉生物技術有限公司。

干酪乳桿菌AS 1.62(BNCC 137633)、德氏乳桿菌NRRL B-548(ATCC 7993)、干酪乳桿菌NRRL B-1922(ATCC 393)、德氏乳桿菌AS 1.2625(AS 1.2132，JCM 1248)、棒狀乳桿菌NRRL B-4391(ATCC 25602)、羅伊氏乳桿菌CICC 6132(ATCC 23272)、嗜酸乳桿菌NRRL B-4495(ATCC 4356)、短乳桿菌NRRL B-4527(ATCC 14869)，中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院酶與發(fā)酵工程實驗室購買或保藏。

1.2 儀器與設備

DNP-905型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；DL-CJ-1 ND Ⅱ型潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司；UV-1200型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；Multiskan FC型酶標儀，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；LGJ-25D型冷凍干燥機，北京四環(huán)啟航科技有限公司；PB-10型pH計，德國Sartorius；LDZX-50KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SIGMA-3K15型臺式高速冷凍離心機，德國SIGMA；1260 Infinity Ⅱ LC型安捷倫液相色譜系統(tǒng)，美國安捷倫；IKA HB-10旋轉蒸發(fā)儀，德國IKA公司；T100型Thermal Cycler PCR儀，美國BIO-RAD公司；傅立葉紅外變換光譜，美國Perkin Elmer公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的分離與篩選

采用無菌生理鹽水(8.5 g/L)對奶豆腐樣品(1.0 g)進行梯度稀釋后涂布于含10 g/L CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24～48 h后挑取具有溶鈣圈的單菌落，接種至液體MRS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h(30 ℃)，菌株培養(yǎng)液離心(4 000 r/min，4 min)，棄上清液，沉淀加入與原培養(yǎng)液相同體積的甘油與脫脂乳混合液(1∶3，v/v)后于-80 ℃冷凍保藏。

菌株經(jīng)兩代活化后按接種量2%接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h后沸水浴處理10 min。冷卻后向發(fā)酵液中加入800 g/L的三氯乙酸至終濃度40 g/L，充分混勻后4 ℃靜置過夜，離心(10 000×g，20 min)除去菌體和蛋白。收集上清液并加入3倍體積無水乙醇，充分混勻后4 ℃靜置過夜，離心(10 000×g，20 min)后收集沉淀。沉淀加入適量水溶解，經(jīng)透析(截留分子質(zhì)量8 000～14 000 Da)后用去離子水定容到原體積，采用苯酚—硫酸法測定多糖含量，以葡萄糖為標準品做標準曲線，選取EPS產(chǎn)量高的菌株進行后續(xù)鑒定。

1.3.2 菌株的鑒定

菌落形態(tài)和生理生化鑒定：選取高產(chǎn)EPS菌株連續(xù)平板劃線后30 ℃培養(yǎng)獲得單菌落，觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色后顯微鏡觀察微生物細胞顏色及形態(tài)。參照《伯杰細菌鑒定手冊》第八版及GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》對菌株進行生理生化分析。

16S rDNA測序分析：采用試劑盒提取菌株DNA，設計通用引物(上游引物27F：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)對DNA進行PCR擴增。PCR擴增反應體系25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，水9.5 μL，目的基因1 μL，2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix(with blue dye)12.5 μL。反應條件為95 ℃預變性3 min，94 ℃變性25 s，55 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃最終延伸10 min，12 ℃保溫10 min。采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物分析并送上海擎科生物科技有限公司測序。測定的16S rDNA序列通過NCBI進行Blast分析比對，利用Mega10構建系統(tǒng)進化樹。

1.3.3 戊糖片球菌S28的酸、膽鹽耐受性及模擬胃腸道消化

耐酸性分析：戊糖片球菌 S28經(jīng)兩代活化后接種于不同pH(鹽酸調(diào)節(jié)pH為6.2，6.0，5.5，5.0，4.5，4.0，3.5，3.0)的MRS培養(yǎng)基(2%，體積分數(shù))，37 ℃培養(yǎng)72 h，采用酶標儀監(jiān)測培養(yǎng)過程中OD595變化。

耐膽鹽分析：制備含膽鹽的MRS培養(yǎng)基(3,5,10 g/L)并接種兩代活化后的戊糖片球菌 S28(2%，體積分數(shù))，37 ℃培養(yǎng)3 h后測定活菌數(shù)。

模擬胃腸道消化：兩代活化后的戊糖片球菌S28與模擬胃液(6.9 mmol/L KCl，0.9 mmol/L KH2PO4，25 mmol/L NaHCO3，47.2 mmol/L NaCl，0.1 mmol/L MgCl2, 0.5 mmol/L(NH4)2CO3，0.15 mmol/L CaCl2，4 000 U/mL胃蛋白酶，pH 3.0)體積比1∶1混合，37 ℃條件下處理2 h后取樣，混合液與模擬腸液(6.8 mmol/L KCl，0.8 mmol/L KH2PO4，85 mmol/L NaHCO3，38.4 mmol/L NaCl，0.33 mmol/L MgCl2，0.6 mmol/L CaCl2，200 U/mL 胰酶，膽鹽0.3%，pH 7.0)體積比1∶1混合，37 ℃條件下繼續(xù)處理2 h后取樣,測定消化前后混合液中活菌數(shù)，按公式(1)計算存活率：

(1)

1.3.4 EPS組成及結構分析

按照1.3.1濃縮凍干后制備EPS。

分子質(zhì)量測定：EPS溶于去離子水(1 mg/mL)，經(jīng)膜過濾(0.22 μm)后采用凝膠排阻色譜測定EPS分子質(zhì)量。色譜條件如下：色譜柱TSK gel GMPWXL(7.8 mm×300 mm)，示差折光檢測器，柱溫35 ℃，流動相為去離子水，流速0.6 mL/min，進樣量10 μL。以不同分子質(zhì)量葡聚糖為標準品(重均分子質(zhì)量分別為1 200、4 300、36 300、97 000、275 900、821 700和3 755 000 Da)制作標準曲線并計算EPS分子質(zhì)量。

單糖組成測定：8.02 mg干燥的EPS，加入三氟乙酸(2 mol/L，2.0 mL)后封管，110 ℃酸解8 h。氮吹干后加入2.0 mL去離子水復溶。取250 μL水解產(chǎn)物溶液樣品，加入250 μL NaOH 溶液(0.6 mol/L)及500 μL 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP)-甲醇(0.4 mol/L)，70 ℃反應1 h。冷卻后加入500 μL HCl溶液(0.3 mol/L)中止反應。用1 mL氯仿對PMP衍生物進行萃取(重復3次)，高效液相色譜分析EPS單糖組成。色譜條件如下：島津LC-20AD HPLC，色譜柱為Xtimate C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，紫外檢測器，波長250 nm，流動相為0.05 mol/L KH2PO4溶液(pH 6.7)∶乙腈=83∶17(體積比)，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL。甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰-氨基葡萄糖及N-乙酰-氨基半乳糖為標準品，分析EPS的組成及含量。

紅外光譜分析：EPS經(jīng)冷凍干燥后研磨制成粉末，采用衰減全反射-傅立葉紅外光譜儀對EPS的結構進行分析，波長范圍為4 000～500 cm-1，掃描次數(shù)32，分辨率4，數(shù)據(jù)間隔2 cm-1，記錄EPS紅外光譜圖。

1.3.5 EPS對益生菌生長的影響

選擇8株乳桿菌，活化后接種至以20 g/L EPS為唯一碳源的MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)過程中發(fā)酵液OD595變化并制作生長曲線，以無糖培養(yǎng)基作為空白對照，以菊粉為唯一碳源的培養(yǎng)基作為陽性對照。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)學和生理生化鑒定

從奶豆腐樣品中分離出32株具有溶鈣圈的菌株，采用苯酚-硫酸法測定其發(fā)酵液中EPS產(chǎn)量。分析結果表明，菌株S28的發(fā)酵液中EPS產(chǎn)量最高，達(126.43±4.32) mg/L。對該菌株進行形態(tài)學觀察，如圖1-a所示，菌株S28革蘭氏染色后顯微鏡觀察呈球狀，成對排列，為革蘭氏陽性。如圖1-b所示， 菌株在加入CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上為白色圓形，菌落凸起，邊緣整齊，表面有光澤。菌落周圍有透明的溶鈣圈，表明菌株S28在生長過程中產(chǎn)酸。

a-革蘭氏染色(30 ℃培養(yǎng)14 h)，b-菌落形態(tài)(30 ℃培養(yǎng)48 h)圖1 菌株S28革蘭氏染色及菌落形態(tài)Fig.1 Gram staining and colony morphology of strain S28

如表1所示，菌株S28能夠在4～45 ℃，pH 9.0和9.6的堿性環(huán)境和濃度為2%～4%的NaCl中生長，但不能在6%的NaCl中生長。在菌株S28的碳水化合物反應中乳糖、麥芽糖、七葉苷、纖維二糖、水楊苷呈陽性，山梨醇、甘露醇、蔗糖、棉子糖、菊糖呈陰性，過氧化氫酶、尿素酶、明膠液化、吲哚實驗、V-P均呈陰性，MR和淀粉水解實驗呈陽性。菌株S28在固體培養(yǎng)基中能夠沿刺穿線擴散生長，具有一定的運動性。

表1 菌株S28的生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical characterizations of strain S28

2.1.2 菌株16S rDNA鑒定

菌株S28進行16S rDNA測序后繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，多序列同源性對比結果如圖2所示。菌株S28與P.pentosaceusDSM 20336同源性達99%。因此，將菌株S28命名為戊糖片球菌S28。

圖2 基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

2.2 戊糖片球菌S28的耐受性及模擬胃腸道消化

戊糖片球菌S28在pH 4.5～6.2范圍內(nèi)均能夠正常生長(圖3-a)，當pH<4.0時，發(fā)酵液OD595與初始時無明顯增加，說明戊糖片球菌S28無法正常生長繁殖。戊糖片球菌S28經(jīng)活化后接種于含膽鹽MRS培養(yǎng)基(初始活菌數(shù)為8.26×105CFU/mL)。戊糖片球菌S28在較高濃度的膽鹽中培養(yǎng)3 h均能存活(圖3-b)，說明該菌株對膽鹽具有一定的耐受性。

戊糖片球菌S28(初始活菌數(shù)1.46×109CFU/mL)在胃液消化后存活率為(56.26±11.72)%，在腸液消化后存活率為(35.01±10.91)%。

2.3 戊糖片球菌S28 EPS的分子質(zhì)量

凝膠過濾測定分子質(zhì)量，EPS在色譜圖中呈現(xiàn)出較為對稱的尖銳單峰，由葡聚糖標準曲線計算得出EPS的分子質(zhì)量為9.82×105Da。

a-pH；b-膽鹽濃度圖3 戊糖片球菌S28在不同pH和膽鹽中的生長情況Fig.3 Growth of P.pentosaceus S28 in different pHs and bile salts

2.4 戊糖片球菌S28 EPS的單糖組成及初步結構分析

戊糖片球菌S28 EPS為雜多糖，主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其峰面積分別占32.38%、33.20%、26.16%，比例超過91%(圖4)。戊糖片球菌S28 EPS還含有少量葡萄糖醛酸(4.82%)、木糖(0.76%)、阿拉伯糖(0.90%)及巖藻糖(1.78%)。

圖4 戊糖片球菌S28 EPS單糖組成分析Fig.4 Monosaccharide composition analysis of EPS from P.pentosaceus S28

戊糖片球菌S28產(chǎn)EPS在3 277 cm-1處強烈的拉伸帶(圖5)，說明EPS中存在大量羥基。在2 925 cm-1處的伸縮帶是C—H鍵(—CH2—或—CH3—)伸縮振動產(chǎn)生的。在1 640 cm-1和1 308 cm-1處的吸收表示戊糖片球菌S28 EPS中存在羧基。在1 542 cm-1處的吸收可能是由C—O振動所產(chǎn)生。1 200～800 cm-1是多糖的指紋圖譜區(qū)，1 214 cm-1處的峰是O—H鍵的伸縮振動峰。1 028 cm-1的吸收可能是C—O—C的伸縮振動產(chǎn)生的。

2.5 EPS在體外對益生菌生長的影響

采用體外單菌培養(yǎng)方法對EPS的益生活性進行分析。戊糖片球菌S28 EPS對益生菌的增殖具有菌株特異性(圖6)。德氏乳桿菌NRRL B-548、羅伊氏乳桿菌CICC 6132、干酪乳桿菌AS 1.62、干酪乳桿菌NRRL B-1922能夠利用戊糖片球菌S28所產(chǎn)EPS作為唯一碳源生長繁殖，發(fā)酵24 h后，發(fā)酵液OD595雖然低于陽性對照菊粉，但顯著高于陰性對照組。而短乳桿菌NRRL B-4527、棒狀乳桿菌NRRL B-4391、嗜酸乳桿菌NRRL B-4495和德氏乳桿菌AS 1.2625不能利用EPS生長，培養(yǎng)24 h后發(fā)酵液OD595與陰性對照無糖培養(yǎng)基相近。

圖5 戊糖片球菌S28 EPS的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum of EPS from P.pentosaceus S28

a-德氏乳桿菌NRRL B-548；b-羅伊氏乳桿菌CICC 6132；c-干酪乳桿菌 AS 1.62；d-干酪乳桿菌 NRRL B-1922， e-短乳桿菌NRRL B-4527；f-棒狀乳桿菌NRRL B-4391；g-嗜酸乳桿菌NRRL B-4495；h-德氏乳桿菌 AS 1.2625圖6 戊糖片球菌S28 EPS對益生菌生長的影響Fig.6 Effects of EPS from P.pentosaceus S28 on the growth of probiotics

3 結論與討論

本研究從自然界中分離出一株產(chǎn)胞外多糖的菌株S28，根據(jù)其有溶鈣圈、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性等特征，初步判斷其為乳酸菌[12]，經(jīng)16S rDNA測序分析后鑒定為戊糖片球菌。乳酸菌要發(fā)揮其功能則需要定植于腸道中[5]，乳酸菌進入消化道后不僅要面對胃部低pH(進食后上升到3.0以上)[13]與腸道膽鹽(質(zhì)量分數(shù)0.03%～0.3%)[14]的脅迫，還要抵御各種消化酶的消化。戊糖片球菌S28能在pH 4.5～6.2的酸性條件下大量生長，不能在pH 4.0的條件下生長。在ABID等[15]的研究中，戊糖片球菌DPS也無法在pH 3.6的條件下生長，與本研究中戊糖片球菌S28的情況相似。戊糖片球菌S28對腸道中的不利環(huán)境具有耐受性，在3～10 g/L的高濃度膽鹽條件下仍能夠存活，在連續(xù)模擬胃腸道消化后仍有一定數(shù)量的活菌。

本研究對戊糖片球菌S28 EPS的結構進行初步研究，測定其分子質(zhì)量為9.82×105Da。不同乳酸菌EPS的分子質(zhì)量差異很大，乳酸菌所產(chǎn)雜多糖的分子質(zhì)量在4×104～9×106Da，同多糖分子質(zhì)量常常高于106Da[16]，戊糖片球菌EPS的分子質(zhì)量從4×104～1.2×106Da不等[15,17]。戊糖片球菌S28所產(chǎn)EPS分子質(zhì)量較高，高分子質(zhì)量的EPS在改善食品結構方面有巨大潛力[9,18]。目前已報道的戊糖片球菌EPS單糖組成包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖以及N-乙酰-氨基葡萄糖[10,17]。戊糖片球菌S28 EPS主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖等組成，與戊糖片球菌LY45[10]所產(chǎn)EPS單糖組成相同。

國際益生菌和益生元科學協(xié)會(ISAPP)將益生元定義為能被宿主體內(nèi)微生物選擇性利用并有益于宿主健康的物質(zhì)[19]。目前關于乳酸菌EPS的報道多集中于抗氧化等活性研究，關于其作為潛在益生元影響益生菌生長的研究報道相對較少。ZHU等[20]采用體外發(fā)酵模型研究發(fā)現(xiàn)，來自健康志愿者糞便樣本中的腸道微生物可以發(fā)酵鼠李糖乳桿菌ZFM231產(chǎn)生EPS，增加Ruminococcus，Dorea,Butyricicoccus和Blautia的豐度，并產(chǎn)生短鏈脂肪酸。瑞士乳桿菌MB2-1所產(chǎn)EPS能夠促進10種益生菌(1株腸球菌和9株乳桿菌)生長，與普通碳源培養(yǎng)基相比，該EPS還一定程度上抑制了2株大腸桿菌的生長[5]。益生菌對EPS的利用通常具有菌株特異性。例如，兩歧雙歧桿菌能夠利用戊糖片球菌5S4所產(chǎn)EPS，但植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌則不能代謝該EPS[21]。益生活性分析結果表明，植物乳桿菌突變菌株所產(chǎn)EPS對親本菌株、突變菌株、乳酸片球菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、德氏乳桿菌乳酸亞種的益生活性為陽性，對其余乳酸菌均為陰性[22]。EPS的組成、結構和分子質(zhì)量等可能會影響乳酸菌對其利用。9株乳桿菌在單糖組成相同但比例不同的3個EPS組分(德氏乳桿菌保加利亞亞種SRFM-1所產(chǎn)EPS)中的生長情況分析表明，大多數(shù)菌株首先選擇利用β(1-4)糖苷鍵連接的β-半乳糖殘基，這可能是由于菌株所產(chǎn)相關酶在與由α/β(1-6)糖苷鍵連接而成的EPS的接觸過程中存在空間阻礙導致的[23]。本研究中乳桿菌對戊糖片球菌S28所產(chǎn)EPS利用情況與已報道結果不同，可能是由于不同乳桿菌所產(chǎn)的與糖代謝相關的酶不同。

對戊糖片球菌S28的耐受性及其EPS的研究表明，戊糖片球菌S28可作為潛在益生菌，且其發(fā)酵產(chǎn)EPS還可作為益生元應用于功能食品中。