董永鑫，衛(wèi)其巍,2，洪浩，黃瑩，趙延曉，馮明峰，竇道龍，徐毅，陶小榮

在中國(guó)大豆品種上創(chuàng)建ALSV誘導(dǎo)的基因沉默體系

董永鑫1，衛(wèi)其巍1,2，洪浩1，黃瑩1，趙延曉1，馮明峰1，竇道龍1，徐毅1，陶小榮1

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大豆病蟲(chóng)害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2四川省達(dá)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川達(dá)州 635000

【】在中國(guó)大豆品種上建立以蘋(píng)果潛隱球形病毒（apple latent spherical virus，ALSV）為載體的基因沉默體系，為中國(guó)大豆品種的基因功能和遺傳育種提供一種簡(jiǎn)便、省時(shí)、易操作的技術(shù)體系。構(gòu)建以農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種的ALSV病毒侵染性克隆載體。從大豆品種威廉姆斯82（Williams 82）中特異擴(kuò)增327 bp的八氫番茄紅素脫氫酶（）基因cDNA片段，插入病毒載體pALSV2。通過(guò)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法將病毒載體導(dǎo)入模式植物本氏煙（），17 d后富集病毒粒子，摩擦接種大豆第一輪真葉，以接種病毒空載作為對(duì)照組，持續(xù)觀察測(cè)試大豆植株系統(tǒng)葉表型，并結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）或熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)ALSV衣殼蛋白基因（）和的表達(dá)水平。ALSV﹕GmPDS接種大豆品種威廉姆斯82和南農(nóng)1138-2，20 d后，前者系統(tǒng)葉未見(jiàn)白化表型，而后者系統(tǒng)葉出現(xiàn)明顯的白化表型；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，發(fā)生白化的南農(nóng)1138-2植株中的表達(dá)水平顯著降低，未出現(xiàn)白化表型的威廉姆斯82中的表達(dá)水平?jīng)]有出現(xiàn)顯著變化。在此基礎(chǔ)上，采用相同的方法，測(cè)試了ALSV在其他9種大豆品種中誘導(dǎo)的沉默效率，發(fā)現(xiàn)在南農(nóng)47、安豆203、祥斗4號(hào)、中黃13、山寧29、齊黃34等大豆品種上接種ALSV﹕GmPDS后植株系統(tǒng)葉均產(chǎn)生白化表型，而菏豆12、中黃311和山寧16等3個(gè)品種的均不能誘導(dǎo)有效沉默。構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ALSV病毒載體，利用本氏煙擴(kuò)繁富集ALSV病毒，將提純的病毒粒體摩擦接種大豆真葉，在多個(gè)中國(guó)大豆品種上成功建立了基因沉默體系。

病毒誘導(dǎo)的基因沉默；大豆；蘋(píng)果潛隱球形病毒；大豆八氫番茄紅素脫氫酶基因

0 引言

【研究意義】大豆（(L.) Merr.）起源于中國(guó)，已有五千年栽培歷史，是中國(guó)重要糧食作物之一，也是世界上最重要的豆類(lèi)作物。大豆含有豐富的植物蛋白質(zhì)，是植物油和蛋白的重要來(lái)源，在世界各地廣泛種植。中國(guó)既是大豆原產(chǎn)地，又曾是全球大豆貿(mào)易最大出口國(guó)，然而由于國(guó)內(nèi)對(duì)于大豆的需求與日俱增，中國(guó)的大豆產(chǎn)量難以滿足國(guó)內(nèi)日益增多的消費(fèi)，超過(guò)八成的大豆消費(fèi)依賴進(jìn)口，目前，全球超過(guò)一半的大豆進(jìn)口來(lái)自中國(guó)[1-2]。大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系難度大，周期長(zhǎng)，是阻礙大豆基因功能研究的主要瓶頸之一[3]；此外，中國(guó)大豆品種多，在不同品種大豆上建立快速鑒定基因功能的手段和工具，對(duì)于進(jìn)一步挖掘中國(guó)大豆重要農(nóng)藝性狀基因，研究大豆品種中與產(chǎn)量和抗病相關(guān)的基因功能，提高中國(guó)大豆產(chǎn)量和質(zhì)量，促進(jìn)大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的理論科學(xué)意義[4-5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是一種研究基因功能的重要方法，通過(guò)將插入植物cDNA片段的重組病毒載體接種植物，利用病毒產(chǎn)生的雙鏈RNA被植物中的RNA沉默元件識(shí)別，切割產(chǎn)生大量針對(duì)植物目的基因的小干擾RNA（small interference RNA），這些小干擾siRNA靶向植物內(nèi)源目的基因mRNA，通過(guò)目的基因表達(dá)量降低后的植物表型或者生理指標(biāo)的變化可以鑒定該基因的功能[6-7]。VIGS具有操作簡(jiǎn)單、周期短、同時(shí)沉默多個(gè)靶標(biāo)基因及不依賴植物遺傳轉(zhuǎn)化體系等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于不同植物基因功能的研究[8-10]。在大豆上的VIGS載體有菜豆莢斑駁病毒（bean pod mottle virus，BPMV）為基礎(chǔ)構(gòu)建的沉默載體，但該病毒需要用粒子轟擊的方法將BPMV載體導(dǎo)入大豆的子葉中，或用體外轉(zhuǎn)錄的方法進(jìn)行接種，方法復(fù)雜且BPMV侵染會(huì)在大豆上產(chǎn)生如褪綠、壞死等癥狀，影響表型觀察[11-12]。蘋(píng)果潛隱球形病毒（apple latent spherical virus，ALSV）載體也被報(bào)道用于沉默大豆基因[13-14]。ALSV屬于櫻桃銼葉病毒屬病毒（），具有直徑約25 nm的等軸形病毒顆粒，病毒粒體內(nèi)包含2條單鏈基因組RNA（RNA1和RNA2）[15]。與其他報(bào)道的病毒載體相比，ALSV作為VIGS載體有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：第一，ALSV作為一種潛隱性病毒，在大部分寄主上不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的癥狀[13]；第二，ALSV載體具有較高的穩(wěn)定性，可以在被接種植物的整個(gè)生長(zhǎng)周期持續(xù)存在[16]；第三，ALSV的寄主范圍廣，除了模式植物擬南芥（）[17]、本氏煙（）[18]外，還可應(yīng)用于辣椒（）[19]、菎諾藜（）[20]、豇豆（）、黃瓜（）、葡萄（）和柑橘（）等多個(gè)不同科植物的基因沉默[21-24]。【本研究切入點(diǎn)】目前，ALSV介導(dǎo)的VIGS體系只在國(guó)外多個(gè)大豆品種中進(jìn)行了VIGS的測(cè)試[14]，發(fā)現(xiàn)在國(guó)外不同大豆品種中ALSV沉默靶標(biāo)基因的效率存在顯著差異，只有部分品種可以誘導(dǎo)高效的基因沉默。中國(guó)是大豆的起源地，大豆品種種類(lèi)多，但目前還沒(méi)有利用ALSV誘導(dǎo)的基因沉默體系對(duì)中國(guó)大豆品種進(jìn)行沉默效率的評(píng)估，到底哪些品種能夠利用該病毒載體進(jìn)行高效的靶標(biāo)基因沉默仍不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究基于ALSV病毒載體能夠侵染大豆誘導(dǎo)基因沉默的能力，擬利用ALSV病毒載體在中國(guó)大豆品種中建立有效的基因沉默體系，通過(guò)構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)法接種的ALSV載體，在本氏煙上擴(kuò)繁病毒，快速分離高濃度的病毒粒子，建立穩(wěn)定的病毒接種大豆方法，在中國(guó)多個(gè)大豆品種上建立高效的基因沉默體系，為進(jìn)一步研究中國(guó)大豆品種的基因功能和重要農(nóng)藝性狀基因挖掘提供重要的研究工具。

1 材料與方法

1.1 植物材料和生長(zhǎng)環(huán)境

大豆種子：南農(nóng)1138-2由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆工程改良中心李凱教授提供，齊黃34、安豆203、南農(nóng)47、祥斗4號(hào)、中黃13、山寧29、威廉姆斯82（Williams 82）、山寧16、菏豆12和中黃311等10種大豆品種由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院葉文武副教授惠贈(zèng)。

本氏煙種子：由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)分子植物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

本氏煙和大豆的生長(zhǎng)環(huán)境均為溫度25℃，日長(zhǎng)16 h/黑暗8 h的隔離溫室。本氏煙基因沉默生長(zhǎng)環(huán)境為溫度22℃，日長(zhǎng)8 h/黑暗16 h的隔離溫室。

1.2 序列和引物設(shè)計(jì)

運(yùn)用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 本研究所使用的引物

劃線部分序列為載體pALSV2上的序列The underlined sequence from pALSV2

1.3 ALSV-VIGS載體的構(gòu)建

1.3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ALSV載體

參考Huang等[17]方法構(gòu)建ALSV RNA1和RNA2的侵染性克隆載體pALSV1、pALSV2（圖1）和pALSV2-CH42（Chlorata42），pALSV2-CH42用于指示ALSV病毒在本氏煙中的侵染情況。

1.3.2 pALSV2-GmPDS載體構(gòu)建

1.3.2.1 GmPDS沉默片段克隆 用NCBI（http://www. ncbi.nlm.nih.gov）已公布的擬南芥PDS基因（GenBank登錄號(hào)為NM_001340908.1）序列進(jìn)行大豆序列blast，選取大豆PDS基因的3條同源基因，序列號(hào)分別為M64704.1、XM_003538489.4和NM_001249840.2。3個(gè)同源大豆PDS基因用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)（圖1），選取編碼區(qū)保守區(qū)域1 520—1 846 nt為目的片段。選用（GenBank登錄號(hào)AW350943.1）作為內(nèi)參基因。以Williams 82大豆品種的葉片為植物材料，利用天根生化科技（北京）有限公司的總RNA抽提試劑盒提取RNA，具體操作方法依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成大豆cDNA。以大豆cDNA為模板，按照Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase反應(yīng)體系，用特異性引物（表1）進(jìn)行片段擴(kuò)增（圖1）。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃ 3 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

1.3.2.2 pALSV2-GmPDS重組載體的構(gòu)建 pALSV2載體經(jīng)Ⅰ酶切后，用瓊脂糖電泳檢測(cè)（圖1），參考生工生物工程（上海）股份有限公司的DnaSpin柱式DNA膠回收試劑盒步驟進(jìn)行純化回收，將GmPDS RT-PCR產(chǎn)物按照同樣的純化方法純化后，通過(guò)南京諾唯贊生物科技有限公司的同源重組試劑盒與Ⅰ酶切的pALSV2載體進(jìn)行同源重組，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH，挑取陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)后，進(jìn)行測(cè)序鑒定，驗(yàn)證正確的克隆提取質(zhì)粒保存。

1.4 農(nóng)桿菌浸潤(rùn)

將pALSV1、pALSV2、pALSV2-CH42、pALSV2- GmPDS以及病毒基因沉默抑制子P19（tomato bushy stunt virus P19）等載體通過(guò)電擊法分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，在含有25 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落，在YEP液體培養(yǎng)基中28℃過(guò)夜培養(yǎng)，5 000 r/min離心8 min，棄上清液，加入適量的農(nóng)桿菌浸潤(rùn)緩沖液（10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2和150 μmol·L-1乙酰丁香酮）重新懸浮菌體，在28℃恒溫培養(yǎng)箱避光放置3 h后，調(diào)菌液濃度至OD600=1，將攜帶pALSV1與pALSV2、pALSV2- GmPDS、pALSV2-CH42的農(nóng)桿菌等比例混合，同時(shí)每個(gè)組合中加入等比例的含有P19的農(nóng)桿菌，注射6—8葉期的本氏煙。由pALSV1和pALSV2構(gòu)成的病毒命名為ALSV，由pALSV1、pALSV2-AtCH42構(gòu)成的病毒命名為ALSV﹕CH42，由pALSV1、pALSV2-GmPDS構(gòu)成的病毒命名為ALSV﹕GmPDS。

A：pALSV2-GmPDS載體構(gòu)建示意圖。P35S：35S啟動(dòng)子；Tnos：終止子；PRO-co：蛋白酶輔因子；HEL：NTP結(jié)合解旋酶；C-PRO：半胱氨酸蛋白酶；POL：RNA聚合酶；MP：42K運(yùn)動(dòng)蛋白；Vp25、Vp20和Vp24：衣殼蛋白。B：GmPDS cDNA擴(kuò)增區(qū)域序列比對(duì)

1.5 RT-PCR驗(yàn)證ALSV、ALSV﹕CH42、ALSV﹕GmPDS侵染本氏煙

分別對(duì)表達(dá)pALSV1、pALSV2和P19，pALSV1、pALSV2-CH42和P19，pALSV1、pALSV2-GmPDS和P19的本氏煙提取植物系統(tǒng)葉總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用表1中的相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.6 病毒粒子富集

利用侵染ALSV空載和ALSV﹕GmPDS的本氏煙系統(tǒng)侵染葉進(jìn)行病毒粒子富集。具體步驟如下（圖2）：

1）農(nóng)桿菌浸潤(rùn)17 d后，稱取0.4 g系統(tǒng)侵染葉片，在研缽中加入液氮充分研磨成粉末，加入800 μL 0.01 mol·L-1pH=7.5的PB緩沖液，混勻后置冰上孵育30 min；

2）4℃，8 500 r/min離心10 min后取上清，加入相應(yīng)體積的40% PEG/NaCl溶液（每100 μL上清液加入23 μL 40% PEG/NaCl），混勻后置冰上孵育1 h；

3）4℃，13 000 r/min離心15 min后棄上清，用100 μL 0.01 mol·L-1pH=7.0的PB緩沖液懸浮沉淀，即得到富集的病毒粒子。通過(guò)OD260測(cè)得病毒粒子濃度，將病毒終濃度調(diào)至2 μg·μL-1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 本氏煙中ALSV病毒粒子的提取和富集流程

1.7 ALSV病毒粒子摩擦接種大豆

選擇8—10日齡大豆幼苗，將金剛砂均勻撒在大豆葉片上，用移液槍吸取20 μL提取的病毒粒子，用一次性手套均勻涂抹在大豆真葉葉片上，每片真葉摩擦40 μg病毒。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)大豆GmPDS的沉默效率

當(dāng)接種ALSV﹕GmPDS的大豆系統(tǒng)葉出現(xiàn)白化表型時(shí)，采集大豆頂部白化葉提取總RNA，同時(shí)用摩擦接種ALSV空載體的大豆系統(tǒng)葉作為對(duì)照，按照南京諾唯贊生物科技有限公司的快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix定量試劑盒進(jìn)行定量PCR，用作為內(nèi)參基因，按照表1中的相應(yīng)引物檢測(cè)的沉默效率。

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ALSV侵染性克隆構(gòu)建及通過(guò)侵染本氏煙擴(kuò)繁病毒

ALSV載體在初始感染階段病毒RNA積累量少，需要接種到菎諾藜上進(jìn)行擴(kuò)增繁殖[18, 25]。為了能夠在實(shí)驗(yàn)室常用病毒寄主本氏煙中進(jìn)行ALSV的擴(kuò)增繁殖，人工合成了ALSV基因組RNA1和RNA2的全長(zhǎng)cDNA，將病毒2條基因組分別克隆到pCB301-2x35S- RZ-NOS，構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pALSV1和pALSV2的侵染性克隆載體（圖1）[17]。將含有pALSV1、pALSV2和P19載體的農(nóng)桿菌懸浮液等比例混合后浸潤(rùn)本氏煙，同時(shí)用含空載體的農(nóng)桿菌浸潤(rùn)本氏煙作為陰性對(duì)照。在農(nóng)桿菌接種后17 d，受感染的植株沒(méi)有出現(xiàn)明顯的病毒癥狀（圖3-A）；RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，pALSV1、pALSV2和P19共處理的本氏煙的系統(tǒng)葉可檢測(cè)到ALSV病毒的表達(dá)，表明通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ALSV載體不誘導(dǎo)任何病癥但可成功侵染本氏煙（圖3-B）。

為了測(cè)試農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ALSV載體是否能夠在本氏煙上誘導(dǎo)基因沉默，首先選取了（），該基因編碼葉綠素產(chǎn)生所必需的鎂螯合酶復(fù)合物的組分之一，作為指示基因被廣泛應(yīng)用于病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系研究[26]。在pALSV2載體上插入了的cDNA片段，構(gòu)建成pALSV2-CH42載體[17]。將攜帶pALSV1、pALSV2-CH42和P19的農(nóng)桿菌等比例混合后注射本氏煙，浸潤(rùn)17 d后，pALSV1、pALSV2-CH42和P19共表達(dá)的植株系統(tǒng)葉片出現(xiàn)黃化表型，結(jié)果表明，構(gòu)建的ALSV載體能夠在本氏煙上誘導(dǎo)有效的基因沉默（圖3-C）。進(jìn)一步測(cè)試不加沉默抑制子P19時(shí)，將攜帶pALSV1和pALSV2-CH42農(nóng)桿菌等比例混合后注射本氏煙能否實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)侵染。結(jié)果顯示，在不加入P19時(shí)，系統(tǒng)葉并沒(méi)有出現(xiàn)黃化的表型（圖3-C），表明不加基因沉默抑制子P19，ALSV載體不能有效侵染本氏煙。以上研究結(jié)果表明構(gòu)建的ALSV載體可通過(guò)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的方式侵染本氏煙，并能夠誘導(dǎo)高效的基因沉默，基因沉默抑制子P19對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ALSV侵染本氏煙是必需的。

A：農(nóng)桿菌介導(dǎo)ALSV侵染本氏煙。將含有pALSV1和pALSV2空載體、pALSV2-CH42、pALSV2-GmPDS和P19的農(nóng)桿菌1﹕1﹕1混合后注射本氏煙，在侵染17 d后，對(duì)侵染植株的表型進(jìn)行拍照。MOCK：空載體對(duì)照；P19：基因沉默抑制子；B：RT-PCR檢測(cè)本氏煙系統(tǒng)葉ALSV CP積累量；C：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ALSV﹕GmPDS侵染本氏煙以及P19對(duì)ALSV侵染本氏煙的作用測(cè)定，CH42：葉綠素合成相關(guān)基因；D：RT-PCR檢測(cè)C圖ALSV插入片段CH42、GmPDS和CP在本氏煙系統(tǒng)葉中的表達(dá)

隨后，將327 bp大豆的cDNA片段插入pALSV2，構(gòu)建pALSV2-GmPDS（圖1）。通過(guò)pALSV2-GmPDS、pALSV1和P19農(nóng)桿菌懸浮液等比例混合后注射本氏煙，以pALSV1、pALSV2-CH42和P19農(nóng)桿菌懸浮液浸潤(rùn)的植株作為陽(yáng)性對(duì)照。待浸潤(rùn)ALSV﹕CH42的植株系統(tǒng)葉黃化后，采集ALSV﹕GmPDS侵染本氏煙植株的系統(tǒng)葉，經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證，ALSV﹕GmPDS本氏煙成功實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)侵染（圖3-D）。

2.2 ALSV載體在南農(nóng)1138-2大豆品種上的基因沉默體系的建立

為了在大豆上建立基因沉默的體系，通過(guò)一種快速提純病毒的方法，對(duì)ALSV空載體和ALSV2﹕GmPDS的病毒粒子進(jìn)行富集（圖2）。將富集后的病毒粒子，摩擦接種到南農(nóng)1138-2和威廉姆斯82大豆品種的第一輪真葉上，每片真葉摩擦40 μg提純的病毒粒體。

以提純的ALSV空載體病毒粒子摩擦接種的大豆為對(duì)照組，以ALSV﹕GmPDS病毒粒子摩擦接種的大豆為試驗(yàn)組。結(jié)果顯示，在南農(nóng)1138-2大豆品種上接種ALSV﹕GmPDS病毒粒子20 d后，在接種植株第二輪和第三輪以上的真葉上均出現(xiàn)了完全白化的表型，而接種ALSV空載病毒粒子的對(duì)照組大豆則沒(méi)有出現(xiàn)白化（圖4-A—圖4-C），接種的6棵植物中全部出現(xiàn)白化表型（表2）。為明確ALSV﹕GmPDS在1138-2大豆品種中誘導(dǎo)的沉默效率，采集ALSV空載體大豆系統(tǒng)葉片和ALSV﹕GmPDS誘導(dǎo)白化的葉片，提取總RNA，qRT-PCR檢測(cè)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在ALSV﹕GmPDS處理的南農(nóng)1138-2大豆品種中，與對(duì)照組相比，出現(xiàn)白化表型的表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）（圖4-D）。在威廉姆斯82大豆品種，接種的8棵威廉姆斯82中都沒(méi)有出現(xiàn)白化表型，qRT-PCR顯示并沒(méi)有被沉默（圖4-E和圖4-F）。對(duì)未出現(xiàn)沉默的植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ALSV病毒在威廉姆斯82中的病毒積累量非常低或不能侵染該大豆品種（圖5）。結(jié)果表明，利用ALSV在南農(nóng)1138-2大豆品種上成功建立了基因沉默的體系（圖4）。

2.3 ALSV介導(dǎo)的基因沉默在中國(guó)其他9種大豆品種的沉默效率測(cè)定

利用ALSV在南農(nóng)1138-2品種建立基因沉默體系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選擇了國(guó)內(nèi)其他9種大豆品種包括齊黃34、安豆203、南農(nóng)47、祥斗4號(hào)、中黃13、山寧29等進(jìn)行了沉默效率的測(cè)定。通過(guò)前面在南農(nóng)1138-2誘導(dǎo)基因沉默相同的策略對(duì)供試大豆進(jìn)行了ALSV﹕GmPDS病毒接種。結(jié)果顯示，ALSV﹕GmPDS侵染2周后，在齊黃34、安豆203、南農(nóng)47、祥斗4號(hào)、中黃13、山寧29等大豆品種中均誘導(dǎo)產(chǎn)生了白化的表型（圖6），齊黃34中8棵接種植株有3棵出現(xiàn)了白化，安豆203中8棵接種的植株有3棵出現(xiàn)白化，南農(nóng)47中接種8棵植株有3棵出現(xiàn)白化，祥斗4號(hào)的8棵接種植株有4棵出現(xiàn)白化，中黃13中6棵接種植株有4棵出現(xiàn)白化，山寧29中6棵接種植株有4棵出現(xiàn)白化（表2）。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，在接種的8棵齊黃34中，3棵出現(xiàn)白化表型的植株中都能檢測(cè)到病毒，而在其余未出現(xiàn)PDS沉默的植株中，并沒(méi)有檢測(cè)到病毒侵染，表明未出現(xiàn)PDS沉默的植株是ALSV病毒未能夠成功侵染引起的（圖7-A）。此外，在ALSV﹕GmPDS接種的國(guó)內(nèi)大豆品種菏豆12、中黃311、山寧16上，病毒接種后均沒(méi)有產(chǎn)生白化表型（圖6）。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)ALSV可以在這些大豆品種產(chǎn)生系統(tǒng)侵染，表明ALSV在這些大豆品種中不足以誘導(dǎo)PDS的沉默（圖7-B—圖7-D）。這些研究結(jié)果表明，ALSV介導(dǎo)的基因沉默體系在中國(guó)不同大豆品種的上誘導(dǎo)的基因沉默表型有差異，ALSV在一些大豆品種可以實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)侵染，但是沉默效率存在差異。

表2 ALSV誘導(dǎo)的基因沉默在11個(gè)大豆品種上的沉默效率

√：ALSV能夠系統(tǒng)侵染/ALSV﹕GmPDS侵染后能夠誘導(dǎo)系統(tǒng)葉變白；×：ALSV不能系統(tǒng)侵染/ALSV﹕GmPDS侵染后不能夠?qū)е孪到y(tǒng)葉變白

√: ALSV can infect systematically/ALSV:GmPDS can cause photo-bleaching; ×: ALSV can’t infect systematically/ALSV:GmPDS can’t cause photo-bleaching

A：ALSV空載體病毒粒體接種南農(nóng)1138-2 20 d后的表型；B：ALSV﹕GmPDS病毒粒體接種南農(nóng)1138-2 20 d后的表型；C：A、B圖中對(duì)應(yīng)南農(nóng)1138-2系統(tǒng)葉GmPDS沉默表型，左邊為接種ALSV空載對(duì)照，右邊為接種ALSV﹕GmPDS上部白化葉片；D：qRT-PCR檢測(cè)ALSV空載體和ALSV﹕GmPDS病毒粒體處理的南農(nóng)1138-2大豆品種系統(tǒng)葉中PDS基因的沉默效率（n=3，**：p＜0.01）；E：ALSV﹕GmPDS接種威廉姆斯82大豆品種20 d后的表型；F：qRT-PCR檢測(cè)ALSV空載體和ALSV﹕GmPDS病毒粒體處理的威廉姆斯82大豆品種系統(tǒng)葉中PDS基因的沉默效率（n=3，ns：p＞0.05）

+：用已白化的南農(nóng)1138-2系統(tǒng)葉cDNA為陽(yáng)性對(duì)照；—：健康大豆cDNA為陰性對(duì)照

ALSV﹕GmPDS病毒純化粒體接種國(guó)內(nèi)其他九種不同大豆品種20 d后的表型。ALSV﹕GmPDS在齊黃34、南農(nóng)47、祥斗4號(hào)、中黃13、山寧29以及安豆203系統(tǒng)葉誘導(dǎo)白化表型；山寧16、菏豆12以及中黃311系統(tǒng)葉未能誘導(dǎo)出現(xiàn)白化表型

A：接種ALSV空載體的齊黃34在8棵植物系統(tǒng)葉都能夠檢測(cè)到病毒CP RNA的積累，接種ALSV﹕GmPDS的齊黃34在8棵植物有3棵發(fā)生沉默的植物系統(tǒng)葉能檢測(cè)到CP；B：ALSV空載體和ALSV﹕GmPDS接種的菏豆12檢測(cè)不到或只能檢測(cè)到很低的CP RNA積累量；C：ALSV空載體和ALSV﹕GmPDS接種的中黃311只能檢測(cè)到很低的CP積累量；D：ALSV空載體和ALSV﹕GmPDS接種的山寧16只能檢測(cè)到很低的CP積累量。+：用已白化的南農(nóng)1138-2系統(tǒng)葉cDNA為陽(yáng)性對(duì)照，—：健康大豆cDNA為陰性對(duì)照

3 討論

3.1 利用ALSV載體在中國(guó)多種大豆品種中成功建立有效的基因沉默體系

目前廣泛應(yīng)用于大豆基因沉默的載體主要是BPMV，該載體在大豆上應(yīng)用方法較為復(fù)雜且會(huì)導(dǎo)致植物產(chǎn)生癥狀[27-29]。原始的ALSV需摩擦到菎諾藜上，并且要進(jìn)行基因槍轟擊到大豆上進(jìn)行基因沉默，這一操作對(duì)一般的實(shí)驗(yàn)室較難熟練掌握。本研究將ALSV改造為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒載體，極大地方便了病毒誘導(dǎo)基因沉默的操作?；贏LSV病毒在植物中積累量少的特點(diǎn)，創(chuàng)立了富集本氏煙中擴(kuò)繁的ALSV病毒粒子的方法，用富集的病毒粒子接種大豆。改進(jìn)的方法在大豆上誘導(dǎo)的基因沉默效果穩(wěn)定，可重復(fù)性好。這些改進(jìn)顯著簡(jiǎn)化了ALSV用于大豆基因沉默和基因功能的過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)使用基因沉默抑制子P19對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的ALSV在本氏煙上的侵染是必需的，ALSV在植物中的積累量較低，基因沉默抑制子P19的加入顯著促進(jìn)了ALSV在本氏煙的侵染和積累，這為大量富集病毒粒子用于后續(xù)有效接種大豆創(chuàng)造了有利條件?；诖?，本研究利用ALSV載體在南農(nóng)1138-2、安豆203、齊黃34等中國(guó)多種大豆品種中建立了有效的基因沉默體系。

3.2 ALSV在不同大豆品種中誘導(dǎo)基因的沉默效率存在差異

發(fā)現(xiàn)ALSV-VIGS載體在不同大豆品種中沉默基因的效率存在顯著差異，這種差異可能是由于大豆的基因型決定的。對(duì)于Williams 82、菏豆12、中黃311、山寧16這4個(gè)品種，ALSV雖然可以系統(tǒng)侵染，但是沒(méi)有出現(xiàn)白化表型，RT-PCR結(jié)果表明，這些大豆品種系統(tǒng)葉中，病毒的積累量與對(duì)照組（1138-2品種）相比顯著較低，這暗示ALSV并不能很好地侵染一些大豆品種，或ALSV在這些品種中較難誘導(dǎo)基因沉默。之前報(bào)道中，ALSV在不同的國(guó)外大豆品種上誘導(dǎo)基因沉默效率也有較大的差異[14]。此外，為了排除PDS在不同大豆品種中沉默效率存在差異是由沉默片段的保守性差異造成的，本研究擴(kuò)增了11個(gè)大豆品種的沉默區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示不同大豆品種之間并無(wú)明顯差異。對(duì)于能夠產(chǎn)生白化表型的大豆品種，沉默效率也有差異，其中比較敏感的南農(nóng)1138-2品種，沉默效率可以達(dá)到100%，而對(duì)于其他沉默效率稍低的大豆品種，未來(lái)可以對(duì)這個(gè)體系進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，例如通過(guò)提高病毒接種濃度和接種量、嘗試不同的沉默片段長(zhǎng)度或調(diào)整植物生長(zhǎng)溫度[30]，以提高ALSV在這些大豆品種的基因沉默效率。因此，利用該病毒在新的大豆品種中進(jìn)行基因沉默和功能研究時(shí)，應(yīng)先對(duì)供試大豆品種進(jìn)行基因沉默效率的測(cè)定。

4 結(jié)論

將ALSV載體改造為農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的病毒載體，以常用的本氏煙作為繁殖寄主，根據(jù)ALSV病毒在植物中積累量少的特點(diǎn)，創(chuàng)造性地采用了富集本氏煙中擴(kuò)繁的ALSV病毒粒子的方法，創(chuàng)新了基于ALSV載體誘導(dǎo)的大豆基因沉默體系，并應(yīng)用該體系在中國(guó)10種大豆品種上進(jìn)行了沉默測(cè)試，明確了該病毒載體在國(guó)內(nèi)不同大豆品種上的沉默效率。

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Establishment of ALSV-Induced Gene Silencing in Chinese Soybean Cultivars

DONG YongXin1, WEI QiWei1,2, HONG Hao1, HUANG Ying1, ZHAO YanXiao1, FENG MingFeng1, DOU DaoLong1, XU Yi1, TAO XiaoRong1

1College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Soybean Disease and Pest Control of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanjing 210095;2Dazhou Academy of Agricultural Sciences in Sichuan Province, Dazhou 635000, Sichuan

【】 The establishment of apple latent spherical virus (ALSV)-induced gene silencing on domestic soybean cultivars will offer a simple, time-saving and operable system for gene function and genetic breeding of soybean cultivars in China.【】The infectious clones of ALSV which was used to infect plant through agro-infiltration was constructed. A 327 bp cDNA fragment of phytoene desaturase () cDNA was amplified from soybean cultivar Williams 82 and inserted into the pALSV2 vector.The pALSV1 and pALSV2-were used to co-infectplant throughAgroinfiltration, and the ALSV virus particle was purified from systemic infected leaves ofplants at 17 days post infiltration (dpi). The purified virions were mechanically inoculated onto the first-round true leaves of soybean and photobleaching phenotype on the upper non-inoculated leaves was monitored from 10 to 30 dpi. Using the empty ALSV vector as a control, the gene expression levels of ALSV coat protein () gene andin ALSV:GmPDS infected soybean were examined by RT-PCR and quantitative RT-PCR analysis, respectively. 【】At 20 dpi, soybean cultivar Nannong 1138-2 inoculated with ALSV:GmPDS showed photobleaching phenotype in the systemic infected leaves, however Williams 82 did not show gene silencing phenotype of PDS in the systemic infected leaves. The results of qRT-PCR confirmed that the RNA expression level ofin Nannong 1138-2 was significantly reduced but ALSV:was unable to silencein Williams 82. By using the same method, the gene silencing efficiency of other 9 domestic soybean cultivars mediated by ALSV:was examined. Soybean cultivars including Nannong 47, Andou 203, Xiangdou 4, Zhonghuang 13, Shanning 29 and Qihuang 34 all displayed photobleaching phenotype in plant systemic infected leaves after inoculation with ALSV:GmPDS, whilewas not silenced in Hedou 12, Zhonghuang 311 and Shanning 16.【】In this study, an-mediated ALSV viral VIGS vector was constructed. ALSV virions was propagated and purified fromplant. The purified virions were rub inoculated onto the first-round true leaves of soybean. Finally, an efficient gene silencing system was established on a number of domestic soybean cultivars in China.

virus-induced gene silencing (VIGS); soybean; apple latent spherical virus; phytoene desaturase ()

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.09.002

2021-11-23；

2022-01-10

國(guó)家自然科學(xué)基金杰出青年基金（31925032）、海南省重大科技計(jì)劃（ZDKJ2021007）

董永鑫，E-mail：2019102035@njau.edu.cn。衛(wèi)其巍，E-mail：675815483@qq.com。董永鑫與衛(wèi)其巍為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者陶小榮，E-mail：taoxiaorong@njau.edu.cn。通信作者徐毅，E-mail：xuyiqdpd@njau.edu.cn。通信作者竇道龍，E-mail：ddou@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）