劉玉芳，陳玉林，周祖陽(yáng)，儲(chǔ)明星

miR-221-3p靶向調(diào)控小尾寒羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056001

【】在哺乳動(dòng)物中能夠促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡，同時(shí)參與繁殖性狀相關(guān)組織器官的發(fā)育及疾病治療，文章利用分子生物學(xué)方法探究miR-221-3p靶向調(diào)控對(duì)小尾寒羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究在卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖過(guò)程中的調(diào)控作用提供依據(jù)。在前期課題組卵巢組織全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的基礎(chǔ)上，獲得了候選基因及其調(diào)控元件miR-221-3p，利用半定量和組織熒光定量（RT-qPCR）分析在小尾寒羊不同組織中的表達(dá)情況；通過(guò)RT-qPCR定量試驗(yàn)在小尾寒羊卵泡期和黃體期卵巢組織中鑒定了及miRNA-221-3p的表達(dá)情況；構(gòu)建3’UTR野生型和突變型載體，在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-221-3p mimic和野生型和突變型及陰性對(duì)照，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)確定miR-221-3p與靶向性關(guān)系；在綿羊卵巢原代顆粒細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221-3p mimic及陰性對(duì)照實(shí)現(xiàn)miR-221-3p過(guò)表達(dá)，使用RT-qPCR技術(shù)在mRNA水平上檢測(cè)miR-221-3p對(duì)以及卵巢顆粒細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因和表達(dá)水平的影響；同時(shí)利用EdU試驗(yàn)分析miR-221-3p過(guò)表達(dá)和陰性對(duì)照組中顆粒細(xì)胞的增殖變化。半定量和組織RT-qPCR分析均表明在卵巢組織中表達(dá)量高于其他組織；RT-qPCR定量結(jié)果顯示miR-221-3p和在小尾寒羊卵泡期和黃體期卵巢組織中差異表達(dá)，miR-221-3p在卵泡期卵巢中的表達(dá)量高于黃體期，而在卵泡期卵巢中的表達(dá)量低于黃體期，表現(xiàn)出負(fù)調(diào)控的現(xiàn)象；雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證分析顯示，過(guò)表達(dá)miR-221-3p mimic顯著抑制了3’UTR熒光素酶的活性（＜0.05），陰性對(duì)照組則沒(méi)有顯著影響；過(guò)表達(dá)miR-221-3p，靶基因mRNA表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)，卵泡顆粒細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因和的表達(dá)量也顯著降低（＜0.05）；EdU試驗(yàn)分析顯示，過(guò)表達(dá)miR-221-3p的顆粒細(xì)胞增殖率為18.9%，極顯著高于陰性對(duì)照組的10.43%（＜0.01）。和miR-221-3p是調(diào)控綿羊卵巢發(fā)育的重要基因及調(diào)控元件，是miR-221-3p的靶基因之一，miR-221-3p過(guò)表達(dá)可抑制顆粒細(xì)胞凋亡，該作用結(jié)果可能通過(guò)抑制靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響了綿羊卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡。

miR-221-3p；小尾寒羊；卵巢顆粒細(xì)胞凋亡；

0 引言

【研究意義】產(chǎn)羔數(shù)一直是制約綿羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心問(wèn)題，影響產(chǎn)羔數(shù)的決定因素是排卵率和卵泡發(fā)育。卵泡顆粒細(xì)胞為卵泡發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，顆粒細(xì)胞的增殖或凋亡是影響卵泡發(fā)育和排卵數(shù)增減的重要因素[1]。多種影響因素調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡，包括遺傳、營(yíng)養(yǎng)、激素等[2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，揭示其增殖或凋亡的分子機(jī)制成為新的研究熱點(diǎn)。microRNA作為近年來(lái)研究成熟的表觀遺傳學(xué)調(diào)控元件，在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起到重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[3]。顆粒細(xì)胞直接影響卵泡發(fā)育，了解其增殖的內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制可為提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)和排卵率提供研究基礎(chǔ)[4]。本研究將miRNA-mRNA調(diào)控作用作為探究卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育的重要調(diào)控通路，通過(guò)RT-qPCR試驗(yàn)在組織中檢測(cè)了miRNA及mRNA的表達(dá)情況，確定了其作為影響小尾寒羊卵巢發(fā)育的重要候選基因及調(diào)控元件參與卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育，為進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA-mRNA的靶向性關(guān)系及在細(xì)胞水平上該調(diào)控通路的功能提供了理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自從1985年，Piper等在Booroola美利奴羊中發(fā)現(xiàn)多羔主效基因以來(lái)，在遺傳上對(duì)綿羊多羔性狀的研究從沒(méi)有停止過(guò)[5]。此外，和基因也被發(fā)現(xiàn)與綿羊多羔性狀相關(guān)[6-7]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的技術(shù)應(yīng)用于綿羊多羔性狀的研究，例如，利用GWAS、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等多種高通量測(cè)序技術(shù)篩選與綿羊多羔性狀相關(guān)的重要候選基因，并對(duì)篩選后的基因進(jìn)行功能驗(yàn)證[8-10]。編碼BCL2L11蛋白，屬于BCL-2蛋白家族的一員，位于線粒體的外膜，該蛋白在介導(dǎo)興奮性細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)基因序列易位和線粒體去極化的過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，BCL2L11與BCL2、BCL2L1和BCL2L3相互作用，是細(xì)胞凋亡的激活劑[13]，當(dāng)細(xì)胞被有毒物質(zhì)刺激時(shí)，BCL2L11從DYNLL1中釋放出來(lái)，通過(guò)BCL2失活和BCL-2相關(guān)蛋白（BAX）-BCL2拮抗劑的激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。參與治療子宮內(nèi)膜異位癥，研究表明，LINC00261通過(guò)直接與miR-132-3p結(jié)合來(lái)充當(dāng)調(diào)節(jié)表達(dá)的分子海綿，該通路可能是子宮內(nèi)膜異位癥的新型治療靶標(biāo)[15]。在妊娠前期癲癇患者的胎盤(pán)中發(fā)現(xiàn)miR-222通過(guò)上調(diào)靶基因來(lái)促進(jìn)子癇前期患者對(duì)缺氧的應(yīng)答，進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡[16]。研究發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡，且該基因參與繁殖性狀相關(guān)組織器官的發(fā)育及疾病治療，但目前在綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中的作用仍不清楚。miRNAs 是有機(jī)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控的主要表觀遺傳學(xué)修飾方法之一，在綿羊多羔性狀的研究中發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNAs參與調(diào)控該性狀。let-7和oar-miRNA-200家族成員，不僅在綿羊中具有物種特異性，而且還具有階段特異性或繁殖力特異性[17]。miR-221-3p 在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌臨床標(biāo)本的miRNA芯片中高表達(dá)，且miR-221-3p可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)移到人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中可促進(jìn)淋巴管生產(chǎn)和淋巴轉(zhuǎn)移，并可作為子宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者早期治療的新型診斷生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)[18]，miR-221-3p與子宮頸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其受轉(zhuǎn)錄因子TWIST2的上調(diào)，從而抑制了的表達(dá)，該通路可能促進(jìn)子宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而影響雌性動(dòng)物的繁殖[19]。綜上可知，miR-221-3p可能通過(guò)抑制其靶基因的表達(dá)調(diào)控雌性繁殖相關(guān)性能?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期通過(guò)對(duì)小尾寒羊卵泡期和黃體期的卵巢組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選到與綿羊多羔性狀相關(guān)候選基因及其調(diào)控元件miR-221-3p?；谇捌谠囼?yàn)結(jié)果與已有報(bào)道，可以調(diào)控細(xì)胞凋亡，并且與雌性動(dòng)物繁殖有關(guān)，miR-221-3p也可作為重要的調(diào)控元件調(diào)控與生殖有關(guān)的疾病變化，推測(cè)miR-221-3p可通過(guò)抑制的表達(dá)影響卵泡顆粒細(xì)胞的增殖或凋亡，這有助于進(jìn)一步闡述卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)育的分子生物學(xué)機(jī)制。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以小尾寒羊卵巢組織和卵泡顆粒細(xì)胞為試驗(yàn)材料，在組織和細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平鑒定miR-221-3p和靶基因的表達(dá)情況，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)miR-221-3p調(diào)控靶基因表達(dá)，并通過(guò)鑒定卵泡顆粒細(xì)胞凋亡標(biāo)志因子和的表達(dá)、EdU分析等進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)所用小尾寒羊均飼養(yǎng)于天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)羊場(chǎng)，選取3周歲經(jīng)產(chǎn)、健康狀況良好的母羊6只（卵泡期和黃體期各3只），所有試驗(yàn)羊飼養(yǎng)環(huán)境均相同。屠宰后，取其心臟、肝臟、脾臟、肺、胃、下丘腦、垂體、子宮、卵巢、輸卵管等組織，取樣后迅速裝入2 mL RNase-Free凍存管中，所有組織樣品采集均在屠宰后半小時(shí)內(nèi)完成，采完后迅速放入液氮，最后于-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。綿羊卵巢顆粒細(xì)胞由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期分離保存獲得，HEK293T細(xì)胞從北京綠源博德公司購(gòu)買(mǎi)所得，細(xì)胞儲(chǔ)存于液氮中，備用。

1.2 主要試劑

組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒（天根，北京）、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根，北京）、SYBR Green qPCR Mix試劑盒（天根，北京）；miRNA定量引物、mimic及inhibitor由廣州銳博生物科技有限公司（中國(guó)）合成；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶購(gòu)自Gbico（美國(guó)）；Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen（美國(guó)）；雙熒光素酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自Promega（美國(guó)），其他均為常規(guī)化學(xué)試劑。

1.3 小尾寒羊卵巢組織RNA提取及cDNA合成

將采集的卵泡期和黃體期小尾寒羊各組織在液氮中進(jìn)行研磨，然后用Trizol（Invitrogen，美國(guó)）進(jìn)行裂解，并根據(jù)動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（天根，北京）的說(shuō)明進(jìn)行總RNA的提取，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測(cè)提取RNA的質(zhì)量和濃度。經(jīng)檢驗(yàn)合格的組織總RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肨aKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系總體積為20 μL：PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer（for Real Time）4.0 μL，RNA 1.0 μg，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足至20 μL，全程在冰上操作。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后，用持家基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)合格的cDNA置于-20℃保存，備用。

1.4 miR-221-3p和BCL2L11小尾寒羊卵巢組織表達(dá)量檢測(cè)

根據(jù)GenBank提供的綿羊和基因序列（登錄號(hào)分別為XM_012173883.3和XM_ 004012836.3），利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，miR-221-3p及U6引物由廣州銳博生物科技有限公司（中國(guó)）合成。各引物濃度均為10 μmol·L-1，其他詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 引物的序列、擴(kuò)增片段大小及退火溫度

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的綿羊的3′UTR序列，設(shè)計(jì)相關(guān)引物以擴(kuò)增與miR-221-3p種子序列完全匹配的基因片段。使用載體為pmiR-RB- Report，在PCR上下游引物的5′端分別添加I和I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，同時(shí)合成了野生型及突變位點(diǎn)，序列見(jiàn)圖1，紅色字體為miR-221-3p種子序列核心結(jié)合區(qū)（載體由廣州銳博生物公司構(gòu)建）。PCR擴(kuò)增體系：模板1 μL，2×Taq PCR Mastermix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，加ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

將HEK293T細(xì)胞復(fù)蘇后，傳至2代以上，以1×104個(gè)/孔的密度接種到24孔板中，每孔放500 μL DMEM完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%—90%匯合，更換無(wú)血清的Opti-MEM優(yōu)化培養(yǎng)基。分別將2 μL Lipo 2000 和pmiR-RB--WT（野生型）/ pmiR- RB--MT（突變型）載體和1 μL 50 nmol·L-1的oar-miR-221-3p mimic或mimic NC進(jìn)行混合，混勻后轉(zhuǎn)染到鋪好的293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染4 h后換成含有10%血清的完全培養(yǎng)基，48 h后收細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

圖1 miR-221-3p與靶基因BCL2L11結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)及載體構(gòu)建

1.6 卵泡顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將卵巢顆粒細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種到6孔板中（每組3個(gè)重復(fù)），每孔中放2 mL DMEM完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%—90%密度時(shí)，更換培養(yǎng)基為Opti-MEM優(yōu)化培養(yǎng)基（不含血清）。將10 μL 的Lipo 2000和4 μL 100 ng·μL-1的oar-miR-221-3p mimic/inhibitor及NC（由廣州銳博生物科技有限公司（中國(guó)）合成）分別添加到250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，混合后，室溫下孵育20min，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。4 h后更換為完全培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞。

1.7 卵泡顆粒細(xì)胞RNA提取及RT-qPCR檢測(cè)

使用細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取卵泡顆粒細(xì)胞總RNA，用PrimeScript RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)步驟同1.4中組織定量步驟。用于RT-qPCR的引物序列見(jiàn)表1。

1.8 EdU檢測(cè)

按照1.6中顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)（碧云天，北京）配置EdU工作液，向每孔加500 μL 10 μmol·L-1EdU工作液，將細(xì)胞再培養(yǎng)3 h。然后用PBS清洗細(xì)胞，用4%的多聚甲醛固定30 min。為了中和多余的醛基，每孔加入50 μL 2 mg·mL-1的甘氨酸孵育15 min。每孔中加入100 μL 0.5% Triton X-100孵化15 min。沖洗后，加入100 μL Apollo試劑，室溫下避光孵化30 min。用PBS清洗細(xì)胞，然后用Hoechst 33342反應(yīng)液在暗房中對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色30 min。使用熒光顯微鏡對(duì)EdU染色的細(xì)胞進(jìn)行觀察和量化。隨機(jī)選擇3個(gè)區(qū)域進(jìn)行量化和用ImageJ軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。熒光定量PCR測(cè)定數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)分析，雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)通過(guò)單因素ANOVA方差分析進(jìn)行評(píng)估，*＜0.05，**＜0.01代表組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 BCL2L11組織表達(dá)譜分析

利用半定量和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)在小尾寒羊各個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，在小尾寒羊心臟、肝臟、脾臟、肺、胃、下丘腦、垂體、卵巢、子宮和輸卵管10個(gè)組織中均有表達(dá)，RT-qPCR和半定量表達(dá)譜均顯示在卵巢組織中表達(dá)量最高（圖2）。

A: BCL2L11半定量分析；B: BCL2L11相對(duì)表達(dá)量分析。M: Marker; 1—10分別為心臟、肝臟、脾臟、肺、胃、下丘腦、垂體、卵巢、子宮、輸卵管

2.2 miR-221-3p和BCL2L11在小尾寒羊卵巢組織中表達(dá)量情況

通過(guò)對(duì)卵泡期和黃體期小尾寒羊卵巢組織中miR-221-3p和RT-qPCR定量試驗(yàn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在黃體期卵巢組織中的表達(dá)量顯著高于卵泡期，而miR-221-3p的表達(dá)量則相反（＜0.05）（圖3）。推測(cè)是miR-221-3p的靶基因之一，并且該基因與綿羊卵泡期到黃體期的轉(zhuǎn)變有關(guān)。

2.3 miR-221-3p與BCL2L11靶向性驗(yàn)證

為了進(jìn)一步研究miR-221-3p與靶向性關(guān)系，通過(guò)Targetscan在線軟件預(yù)測(cè)了miR-221-3p在基因上結(jié)合位置，發(fā)現(xiàn)基因的3′UTR區(qū)存在miR-221-3p的特異性結(jié)合位點(diǎn)，隨后以NCBI中提供的3′UTR為模板設(shè)計(jì)了包含miR-221-3p種子序列結(jié)合位點(diǎn)片段的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。構(gòu)建了野生型重組質(zhì)?！皃miR-RB--WT”和突變型重組質(zhì)?！皃miR-RB--MT”。試驗(yàn)分為4組，分別是pmiR-RB--WT、miR-221-3p mimic；pmiR-RB--WT、mimic NC；pmiR-RB--MT、miR-221-3p mimic；pmiR-RB-- MT、mimic NC，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-221-3p顯著降低了野生型質(zhì)粒的熒光活性（＜0.05）；但對(duì)突變型質(zhì)粒沒(méi)有顯著作用（＞0.05）；陰性對(duì)照對(duì)各組質(zhì)粒的熒光活性都沒(méi)有顯著影響（＞0.05）（圖4）。結(jié)果表明miR-221-3p可與3′UTR區(qū)的種子序列結(jié)合，是其靶基因之一。

LP：黃體期；FP：卵泡期LP: luteal phase; FP: follicular phase *P＜0.05 下同The same as below

2.4 過(guò)表達(dá)miR-221-3p對(duì)BCL2L11表達(dá)的影響

為了確定miR-221-3p是否能夠調(diào)控的表達(dá)，本試驗(yàn)利用miR-221-3p mimic和mimic NC轉(zhuǎn)染綿羊卵泡顆粒細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行靶基因RT-qPCR定量檢測(cè)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)miR-221-3p組中mRNA表達(dá)量顯著降低（＜0.05）；陰性對(duì)照組（mimic NC）中對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響（圖5），表明miR-221-3p與之間存在靶向性關(guān)系，并且在轉(zhuǎn)錄水平是負(fù)調(diào)控的。

2.5 過(guò)表達(dá)miR-221-3p對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡標(biāo)志因子X(jué)IAP和Fas表達(dá)的影響

為了確定綿羊miR-221-3p是否通過(guò)調(diào)控表達(dá)影響卵泡顆粒細(xì)胞凋亡，本試驗(yàn)利用miR-221-3p mimic和mimic NC轉(zhuǎn)染到綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞提取總RNA，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡標(biāo)志基因和在mRNA水平上的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-221-3p mimic后，和的mRNA表達(dá)量顯著降低（＜0.05）（圖6-A）。EdU分析顯示，過(guò)表達(dá)miR-221-3p的顆粒細(xì)胞增殖率為18.9%，極顯著高于陰性對(duì)照組的10.43%（**＜0.01，圖6-B）。

圖4 miR-221-3p與BCL2L11靶向關(guān)系的雙熒光素酶活性檢測(cè)

圖5 過(guò)表達(dá)miR-221-3p抑制了BCL2L11的表達(dá)

3 討論

綿羊繁殖性狀十分復(fù)雜，受到卵泡發(fā)育、排卵率、發(fā)情周期轉(zhuǎn)變等的影響。卵泡顆粒細(xì)胞為卵泡提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其增殖和凋亡直接影響卵母細(xì)胞的閉鎖、發(fā)育和成熟。在雌性哺乳動(dòng)物中，單層的卵泡顆粒細(xì)胞包裹著卵母細(xì)胞，隨著卵泡的不斷發(fā)育，顆粒細(xì)胞形態(tài)也隨之發(fā)生變化，由扁平生長(zhǎng)為柱狀，由單層生長(zhǎng)為多層，在此過(guò)程中顆粒細(xì)胞不斷為卵母細(xì)胞提供能量，包括氨基酸、核苷酸、谷胱甘肽和糖代謝物等[20]。在單胎哺乳動(dòng)物中，每個(gè)發(fā)情周期卵巢組織中只有1個(gè)卵泡可以發(fā)展為優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育成熟并排卵，其余卵泡均閉鎖凋亡，有研究發(fā)現(xiàn)卵泡閉鎖是由于卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡造成的[21-22]。在小尾寒羊群體中存在單羔和多羔個(gè)體現(xiàn)象，在排卵過(guò)程中很好地體現(xiàn)了多個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡同時(shí)發(fā)育成熟并排卵形成多羔，該群體可為研究多羔性狀產(chǎn)生的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)和試驗(yàn)材料。前人研究結(jié)果顯示，可通過(guò)的反式激活參與人顆粒細(xì)胞凋亡，是參與顆粒細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因[23]。在本研究中發(fā)現(xiàn)在綿羊各組織中廣泛存在（圖2），但是在卵巢組織中高表達(dá)，因此，該結(jié)論與前人的研究結(jié)果一致，參與卵巢組織發(fā)育。

A：過(guò)表達(dá)miR-221-3p抑制XIAP和Fas表達(dá)；B: EdU檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡

miRNA作為目前研究比較成熟的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件，參與有機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖及衰亡的各個(gè)環(huán)節(jié)。在細(xì)胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNAs參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。研究表明，miR-1275、let-7家族、miR-23a等，均參與了卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖過(guò)程，其中l(wèi)et-7家族在豬卵泡閉鎖過(guò)程中高水平表達(dá)，可以顯著提高豬卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡率[24-26]。作為影響卵泡顆粒細(xì)胞發(fā)育的重要候選基因，miRNA如何調(diào)控該基因表達(dá)的報(bào)道較少。本研究通過(guò)前期全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-221-3p是調(diào)控表達(dá)的miRNA之一，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在miR-221-3p的靶向性結(jié)合位點(diǎn)，在模式化細(xì)胞293T細(xì)胞系中其mimic能夠結(jié)合到的3′UTR區(qū)域。此外，研究發(fā)現(xiàn)，miR-221-3p主要參與治療癌癥及炎癥反應(yīng)，抑制miR-221-3p的表達(dá)則可能促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，表明低表達(dá)的miR-221-3p更有可能造成細(xì)胞凋亡[27]。該文獻(xiàn)佐證了miR-221-3p低表達(dá)對(duì)靶基因的抑制作用不足，會(huì)影響卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，與目前所發(fā)現(xiàn)的功能一致。

和是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可作為檢測(cè)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡重要標(biāo)志[28-29]。在本研究中，過(guò)表達(dá)miR-221-3p后表達(dá)量顯著降低，而標(biāo)志因子和的mRNA表達(dá)量也顯著降低，這與前人在豬卵泡顆粒細(xì)胞中所得到的結(jié)果相似[30]，說(shuō)明miR-221-3p能夠通過(guò)抑制的表達(dá)顯著影響顆粒細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)miR-221-3p靶向調(diào)控表達(dá)對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡有顯著影響。過(guò)表達(dá)miR-221-3p可以抑制的表達(dá)從而調(diào)控綿羊顆粒細(xì)胞凋亡，表明具有調(diào)控綿羊顆粒細(xì)胞凋亡的作用，為進(jìn)一步研究在綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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miR-221-3p Regulates Ovarian Granulosa Cells Apoptosis by TargetingSmall-Tail Han Sheep

1Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100193;2College of Life Science and Food Engineering, Hebei University of Engineering, Handan056001, Hebei

【】could promote apoptosis in mammals and is involved in the development of tissues and organs related to reproductive traits and in disease treatment. The aim of this study was to explore the effect of miR-221-3p on the regulation of granulosa cell apoptosis in Small-Tail Han sheep by targeting, so as to provide evidence for further study of the regulation ofgranulosa cell apoptosis and atresia of follicles.【】Based on the whole transcriptome sequencing analysis of the ovarian tissue of the previous study in our group, the differentially expressed geneand its regulatory element miR-221-3p were obtained in this study. Analysis of the expression ofdifferent tissues of the Small-Tail Han sheep by using semi-quantitative and tissue fluorescence quantification (RT-qPCR). The expression ofand miRNA-221-3p was identified in the ovarian tissues of the Small-Tail Han sheep in the follicular and luteal phase by RT-qPCR. The miR-221-3p mimic,wild-type andmutant-type were co-transfected in HEK293T cells with negative control, the dual luciferase reporter gene detection system was used to determine the targeting relationship between miR-221-3p and. The miR-221-3p mimic and negative control were transfected into ovarian granulosa cells to achieve the overexpression of miR-221-3p. RT-qPCR was used to detect the effect of miR-221-3p on the expression levels ofand the marker genes of the apoptosis of ovarian granulosa cell geneandat the mRNA level. At the same time, the changes in proliferation of granulocytes in the miR-221-3p overexpression and negative control groups were also analyzed using the EdU assay. 【】The results showed that the expression ofovarian tissue was the highest, followed by spleen and lung tissues. RT-qPCR results showed that the expression of miR-221-3p andwas significantly different in the ovarian tissues of Small-Tail Han sheep between follicular and luteal phases. The expression of miR-221-3p was higher in follicular than that in luteal phase ovaries, whereaswas less expressed in follicular than that in luteal phase ovaries, which showed the phenomenon of a negative regulation. Dual luciferase reporter analysis showed that overexpression of miR-221-3p significantly inhibited the activity of3’UTR vector (＜0.05). The overexpression of miR-221-3p significantly reduced the mRNA level expression of target gene, while follicular granulosa cell apoptosis expression of marker genesandwere also significantly reduced (＜0.05). Analysis of the EdU assay showed that the proliferation rate of granulosa cells overexpressing miR-221-3p was 18.9%, which was significantly higher than that of the negative control group at 10.43% (＜0.01). 【】and miR-221-3p were important genes and regulatory elements that regulate ovarian development in Small-Tail Han sheep.was one of the target genes of miR-221-3p, and overexpression of miR-221-3p could inhibit granulosa cell apoptosis by target.

miR-221-3p; Small-Tail Han Sheep; granulosa cells apoptosis;

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.09.015

2021-03-04；

2021-10-31

國(guó)家自然科學(xué)基金（32172704）、河北省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（C2019402261）、國(guó)家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-38）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS13）

劉玉芳，E-mail：aigaiy@126.com。通信作者儲(chǔ)明星，E-mail：mxchu@263.net

（責(zé)任編輯 林鑒非）