朱麗燕,占路娟,盧吉英

朱麗燕,占路娟,浙江衢化醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省衢州市 324000

盧吉英,金華市中心醫(yī)院肛腸科 浙江省金華市 321099

0 引言

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,預(yù)測顯示,到2030年CRC年新增病例將超過220萬例,年死亡病將超過110萬例.CRC患者預(yù)后不良與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān).因此,明確CRC轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)于開發(fā)新的治療策略、改善CRC患者預(yù)后意義重大.環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是非編碼RNA家族成員,具有閉環(huán)結(jié)構(gòu),缺少5’端和3’端.circRNA表達(dá)異常與CRC等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān).資料顯示,環(huán)狀RNA VANGL1(circRNA VANGL1,circ_VANGL1)在膀胱癌中表達(dá)升高,其高表達(dá)與患者預(yù)后不良以及癌細(xì)胞異常增殖和侵襲有關(guān).靶基因預(yù)測顯示,微小RNA(microRNA,miR)-493-5p是circ_VANGL1的潛在靶點(diǎn).miR-493-5p在CRC中表達(dá)水平降低,miR-493-5p的上調(diào)可降低CRC細(xì)胞惡性增殖和遷移能力.靶基因預(yù)測還顯示,脆性X相關(guān)基因1(fragile X-related gene 1,FXR1)是miR-493-5p的潛在靶點(diǎn).此前研究表明,FXR1高表達(dá)與CRC患者預(yù)后差相關(guān),它可增強(qiáng)CRC細(xì)胞增殖、侵襲能力,發(fā)揮腫瘤啟動(dòng)子作用.基于上述文獻(xiàn),本研究以miR-493-5p、FXR1為切入點(diǎn),探討circ_VANGL1在CRC中的作用和分子機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源:CRC組織和對(duì)應(yīng)癌旁組織為2017-06/2019-06在我院接受手術(shù)治療的29例CRC患者的組織樣本.其中,男性18例,女性11例,年齡45-75歲,中位年齡64歲.入組患者術(shù)前均未接受化療或放療,且將急性或慢性感染、其他原發(fā)惡性腫瘤患者排除在外.本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并獲得每位患者的知情同意.CRC組織樣本在液氮中冷凍,并在-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.1.2 細(xì)胞和試劑:CRC細(xì)胞Caco-2購自美國ATCC;SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自大連Takara公司;TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自北京百奧萊博生物公司;放射免疫沉淀測定(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)、磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)兔多抗(ab9485)、FXR1兔多抗(ab155124)、山羊抗兔IgG抗體(ab205718)購自中國Abcam公司;Transwell室(24孔)購自美國Corning公司;重組熒光素酶報(bào)告載體購自廣州銳博生物公司.

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測CRC組織circ_VANGL1和miR-493-5p表達(dá):為檢測circ_VANGL1表達(dá)用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA.為檢測miR-493-5p表達(dá)用TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA.采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測組織樣品中circ_VANGL1和miR-493-5p表達(dá).2法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量.GAPDH為circ_VANGL1的內(nèi)參,U6為miR-493-5p的內(nèi)參.引物序列:circ_VANGL1上游5′-CTACAGCC TGGGACACCTGAG-3′,下游5′-CCTCTGCCGTCTTTATTG-3′;GAPDH上游5′-GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3′,下游5′-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3′;miR-493-5p上游5′-TCCTACGGAGAGGCTCAG-3′,下游5′-TCCTCGTAGTCCAACACG-3′;U6上游5′-CTCGCTTC GGCAGCACA-3,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′.1.2.2 Western blot檢測CRC組織FXR1蛋白表達(dá):RIPA裂解液提取CRC組織和癌旁組織樣本中總蛋白.取50 μg變性蛋白上樣到10%凝膠上進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,隨后濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上.膜用5%脫脂牛奶封閉后,分別進(jìn)行一抗反應(yīng)、二抗反應(yīng).向PVDF膜滴加化學(xué)發(fā)光溶液顯影.GAPDH作為內(nèi)參,應(yīng)用Image J軟件分析FXR1蛋白相對(duì)表達(dá)量.

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組:Caco-2細(xì)胞在37 ℃、含95%空氣、含5% CO的培養(yǎng)箱中,用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng).取1×10個(gè)第3代對(duì)數(shù)期Caco-2細(xì)胞接種24孔板.將脂質(zhì)體Lip2000、待轉(zhuǎn)染序列分別溶于50 μL無血清培養(yǎng),孵育5 min后將Lip2000與待轉(zhuǎn)染序列混勻,并在室溫靜置20 min.當(dāng)細(xì)胞50%匯合時(shí),棄去培養(yǎng)液,加入100 μL混合物和400 μL無血清培養(yǎng)基,孵育6 h更換為500 μL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基.收集轉(zhuǎn)染48 h Caco-2細(xì)胞,RT-qPCR檢測細(xì)胞中circ_VANGL1和/或miR-493-5p相對(duì)水平.根據(jù)轉(zhuǎn)染序列不同,Caco-2細(xì)胞分為si-circ_VANGL1組、si-NC組、miR-NC組、miR-493-5p mimic組、si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor組.1.2.4 CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖:CCK-8實(shí)驗(yàn):每組取5×10個(gè)Caco-2細(xì)胞接種96孔板,培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入90 μL DMEM培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)孵育2.5 h.酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度(A)值.抑制率=(1-A/A)×100%.

克隆形成實(shí)驗(yàn):每組取4×10個(gè)Caco-2細(xì)胞接種到6孔板,晃動(dòng)平板使細(xì)胞均勻分散.培養(yǎng)箱孵育約2 w直到現(xiàn)細(xì)胞克隆.取出6孔板,棄去培養(yǎng)液.磷酸鹽緩沖液小心漂洗2次,室溫下用甲醇固定20 min,用0.1%結(jié)晶紫染色20 min.顯微鏡下拍照,計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù).1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲:每組取1×10個(gè)Caco-2細(xì)胞懸浮在200 μL無血清培養(yǎng)基中,并接種到Transwell裝置上室.Transwell裝置下室加入500 μL含有20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為Caco-2轉(zhuǎn)移的化學(xué)誘導(dǎo)劑.將Transwell裝置放入培養(yǎng)箱孵24 h.取出Transwell裝置,用棉簽將上室擦去上室非遷移細(xì)胞,用甲醇固定膜下表面遷移細(xì)胞,0.1%結(jié)晶紫染色后,置于倒置顯微鏡下拍照,隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)染色數(shù),以平均值表示細(xì)胞遷移數(shù)量.侵襲測定時(shí)先用基質(zhì)膠包被Transwell裝置上室膜,其與步驟同遷移檢測.

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):將包含miR-493-5p

結(jié)合位點(diǎn)的circ_VANGL1或FXR1-3’-非編碼區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)野生型(wild type,WT)序列以及不含miR-493-5p結(jié)合位點(diǎn)的circ_VANGL1或FXR1-3’-UTR突變型(mutant type,MUT)序列克隆到雙熒光素酶報(bào)告基因pmirGLO載體中,構(gòu)建成重組載體WT-circ_VANGL1、WT-FXR1、MUT-circ_VANGL1、MUT-FXR1.將上述重組載體分別與miR-493-5p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞.轉(zhuǎn)染48 h裂解細(xì)胞,雙熒光素酶報(bào)告物檢測系統(tǒng)評(píng)估Caco-2細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性.

用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以mean±SD表示.兩組數(shù)據(jù)的差異采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)分析,多組間的數(shù)據(jù)差異采用單因素方差分析和-檢驗(yàn).＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 CRC組織中circ_ VANGL1、miR-493-5p和FXR1表達(dá)的檢測 CRC組織中circ_ VANGL1相對(duì)水平、FXR1蛋白表達(dá)顯著高于癌旁組織(＜0.05),miR-493-5p相對(duì)水平顯著低于癌旁組織(＜0.05).見圖1和表1.

表1 circ_ VANGL1、miR-493-5p和FXR1表達(dá)的檢測

圖1 bP＜0.01與癌旁組織組相比.CRC組織:結(jié)直腸癌組織;FXR1:脆性X相關(guān)基因1.

2.2 沉默circ_VANGL1對(duì)Caco-2增殖、遷移、侵襲的影響 轉(zhuǎn)染si-circ_VANGL1后Caco-2細(xì)胞circ_VANGL1相對(duì)水平顯著低于si-NC組(＜0.05),表明轉(zhuǎn)染si-circ_VANGL1可抑制circ_VANGL1表達(dá).與si-NC組比較,sicirc_VANGL1組Caco-2細(xì)胞miR-493-5p相對(duì)水平、抑制率顯著升高(＜0.05),FXR1蛋白表達(dá)、克隆形成數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著降低(＜0.05).見圖2和表2.

表2 沉默circ_VANGL1抑制Caco-2增殖、遷移、侵襲(mean±SD,n=9)

圖2 沉默circ_VANGL1抑制Caco-2遷移、侵襲、克隆及細(xì)胞FXR1蛋白的表達(dá).A:si-circ_VANGL1組 vs si-NC組Caco-2細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)減少;B:si-circ_VANGL1組 vs si-NC組Caco-2細(xì)胞克隆數(shù)減少;C:si-circ_VANGL1組 vs si-NC組Caco-2細(xì)胞總FXR1蛋白表達(dá)降低.FXR1:脆性X相關(guān)基因1.

2.3 circ_VANGL1、miR-493-5p靶向關(guān)系 Starbase預(yù)測到circ_VANGL1和miR-493-5p存在互補(bǔ)序列,見圖3.與miR-NC和WT-circ_VANGL1共轉(zhuǎn)染比較,miR-493-5p mimic和WT-circ_VANGL1共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(＜0.05),與miR-NC和MUT-circ_VANGL1共轉(zhuǎn)染比較,miR-493-5p mimic和MUT-circ_VANGL1共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性差異不顯著,見表3.

圖3 circ_VANGL1和miR-493-5p的互補(bǔ)序列.WT-VANGL1:野生型VANGL1;MUT-VANGL1:突變型VANGL1.

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(mean±SD,n=9)

2.4 miR-493-5p對(duì)Caco-2增殖、遷移、侵襲的影響 轉(zhuǎn)染miR-493-5p mimic后Caco-2細(xì)胞miR-493-5p相對(duì)水平顯著高于miR-NC組(＜0.05),表明轉(zhuǎn)染miR-493-5p mimic可促進(jìn)miR-493-5p表達(dá).與miR-NC組比較,miR-493-5p mimic組Caco-2細(xì)胞抑制率顯著升高(＜0.05),FXR1蛋白表達(dá)、克隆形成數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著降低(＜0.05).見圖4和表4.

圖4 miR-493-5p抑制Caco-2遷移、侵襲、克隆及細(xì)胞中FXR1蛋白的表達(dá).A:miR-493-5p mimic組 vs miR-NC組Caco-2細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)減少;B:miR-493-5p mimic組 vs miR-NC組Caco-2細(xì)胞克隆數(shù)減少;C:miR-493-5p mimic組 vs miR-NC組Caco-2細(xì)胞中FXR1蛋白表達(dá)減少.FXR1:脆性X相關(guān)基因1.

表4 miR-493-5p抑制Caco-2增殖、遷移、侵襲(mean±SD,n=9)

2.5 miR-493-5p和FXR1靶向關(guān)系 Targetscan預(yù)測到miR-493-5p和FXR1-3’-UTR存在互補(bǔ)序列,見圖5.與miR-NC和WT-FXR1共轉(zhuǎn)染比較,miR-493-5p mimic和WT-FXR1共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(＜0.05),與miR-NC和MUT-FXR1共轉(zhuǎn)染比較,miR-493-5p mimic和MUT-circ_FXR1共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性差異不顯著,見表5.

圖5 miR-493-5p和FXR1的互補(bǔ)序列.FXR1:脆性X相關(guān)基因1;WT-FXR1:野生型FXR1;MUT-FXR1:突變型FXR1.

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(mean±SD,n=9)

2.6 抑制miR-493-5p對(duì)沉默circ_VANGL1處理的Caco-2增殖、遷移、侵襲的影響 與si-circ_VANGL1組比較,si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor組Caco-2細(xì)胞miR-493-5p相對(duì)水平、抑制率顯著降低,FXR1蛋白表達(dá)、克隆形成數(shù)、遷移數(shù)、侵襲數(shù)顯著升高(＜0.05),見圖6和表6.

圖6 抑制miR-493-5p可逆轉(zhuǎn)沉默circ_VANGL1對(duì)Caco-2遷移、侵襲、克隆及細(xì)胞中FXR1蛋白表達(dá)的抑制作用.A:si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor組 vs si-circ_VANGL1組Caco-2細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)增加;B:si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor組 vs si-circ_VANGL1組Caco-2細(xì)胞克隆數(shù)增加;C:si-circ_VANGL1+miR-493-5p Inhibitor組 vs si-circ_VANGL1組Caco-2細(xì)胞中FXR1蛋白表達(dá)增高;FXR1:脆性X相關(guān)基因1.

表6 抑制miR-493-5p可逆轉(zhuǎn)沉默circ_VANGL1對(duì)Caco-2增殖、遷移、侵襲的抑制作用(mean±SD,n=9)

3 討論

越來越多的證據(jù)表明,circRNA在CRC組織、細(xì)胞系和血漿中異常表達(dá),與結(jié)直腸癌的臨床惡性特征密切相關(guān),如hsa_circ_0005273,circRNA_0000392.然而CRC中circ_VANGL1的表達(dá)及潛在功能仍然未知.circ_VANGL1在人非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中表達(dá)增加,其高表達(dá)與NSCLC患者總生存期縮短、較差的臨床病理特征相關(guān),且circ_VANGL1通過與miR-195相互作用促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和其遷移,加速NSCLC進(jìn)展.circ_VANGL1在膀胱癌中表達(dá)上調(diào),circ_VANGL1沉默通過調(diào)節(jié)miR-1184/胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2分子軸抑制膀胱癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為.胃癌中circ_VANGL1表達(dá)增加,慢病毒載體介導(dǎo)的circ_VANGL1下調(diào)可激活線粒體凋亡通路,誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡.本研究首次揭示了CRC組織中circ_VANGL1相對(duì)水平升高,提示circ_VANGL1可能在CRC進(jìn)展中發(fā)揮促癌作用.功能實(shí)驗(yàn)顯示,沉默circ_VANGL1表達(dá)可降低Caco-2細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力,表明circ_VANGL1在CRC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移中具有致癌作用.

目前研究認(rèn)為circ_VANGL1可作為miRNA“海綿”抑制miRNA對(duì)其靶mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過程和疾病進(jìn)展,例如circ_VANGL1通過靶向miR-217上調(diào)核心結(jié)合因子α1表達(dá)能夠調(diào)控成骨分化和骨質(zhì)疏松進(jìn)展.本研究證實(shí)circ_VANGL1可靶向負(fù)調(diào)控miR-493-5p.研究表明miR-493-5p靶向DKK2可抑制CRC細(xì)胞有氧糖酵解和血管生成.miR-493-5p通過靶向FUT4能夠減弱人乳腺癌的侵襲性和致瘤性.長鏈非編碼RNA NR2F1-AS1充當(dāng)miR-493-5p的“分子海綿”上調(diào)整合素β1的表達(dá)促進(jìn)NSCLC發(fā)生和轉(zhuǎn)移.本研究發(fā)現(xiàn)CRC組織中miR-493-5p表達(dá)降低,轉(zhuǎn)染miR-493-5p mimic過表達(dá)miR-493-5p可降低Caco-2細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力,這與Cui等報(bào)道吻合.FXR1是脊椎動(dòng)物中高度保守的胞漿RNA結(jié)合蛋白,其腫瘤發(fā)生中作用已被研究.FXR1在膠質(zhì)瘤中表達(dá)增加,下調(diào)FXR1可抑制膠質(zhì)瘤進(jìn)展.前列腺癌細(xì)胞中FXR1表達(dá)缺失與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的減弱有關(guān).FXR1通過與circ_0000079相互作用降低NSCLC細(xì)胞的侵襲性和耐藥性.本研究發(fā)現(xiàn)CRC組織中FXR1蛋白表達(dá)增加,并證實(shí)FXR1為miR-493-5p的直接靶點(diǎn).由于沉默circ_VANGL1表達(dá)、過表達(dá)miR-493-5p均可下調(diào)FXR1蛋白表達(dá)、抑制CRC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為,本研究推測在CRC中存在circ_VANGL1/miR-493-5p/FXR1調(diào)控途徑.為證實(shí)沉默circ_VANGL1在CRC中的抗癌作用依賴于上調(diào)miR-493-5p/FXR1軸,本研究將si-circ_VANGL1和miR-493-5p Inhibitor共轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞,結(jié)果顯示,抑制miR-493-5p表達(dá)顯著減弱沉默circ_VANGL1對(duì)FXR1蛋白表達(dá)的抑制作用以及對(duì)Caco-2細(xì)胞的抗增殖、抗遷移和抗侵襲作用,這表明circ_VANGL1至少通過調(diào)控miR-493-5p/FXR1軸在CRC中發(fā)揮作用.

4 結(jié)論

總之,CRC組織中circ_VANGL1和FXR1蛋白表達(dá)上調(diào),miR-493-5p表達(dá)下調(diào).沉默circ_VANGL1通過調(diào)控miR-493-5p/FXR1軸抑制CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲.因此,靶向抑制circ_VANGL1/miR-493-5p/FXR1途徑有可能成為CRC治療的新方向.

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)已逐漸成為全球人類健康和生命最致命的威脅之一.盡管有報(bào)道表明circRNA與CRC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān),但在這些過程中,circRNA的生物學(xué)功能仍然很大程度上未知,包括circ_VANGL1.

探討circ_VANGL1在CRC中的表達(dá)情況,以及是否通過調(diào)控miR-493-5p/FXR1軸影響CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲.這對(duì)于明確CRC轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)于開發(fā)新的治療策略、改善CRC患者預(yù)后意義重大.

確定circ_VANGL1在CRC中的表達(dá),并闡明circ_VANGL1是否通過調(diào)控miR-493-5p/FXR1軸影響CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲.

采用RT-qPCR檢測CRC組織中circ_VANGL1表達(dá),采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估沉默circ_VANGL1對(duì)Caco-2增殖能力、遷移和侵襲能力的影響.雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測miR-493-5p和circ_VANGL1、FXR1之間的靶向關(guān)系.

研究達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo),本研究首次發(fā)現(xiàn)CRC組織中circ_VANGL1表達(dá)增強(qiáng),而沉默circ_VANGL1表達(dá)使CRC Caco-2細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力被抑制.此外,circ_VANGL1通過充當(dāng)miR-493-5p的分子海綿,調(diào)控Caco-2細(xì)胞中FXR1的表達(dá).

circ_VANGL1通過靶向miR-493-5p調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞中FXR1的表達(dá),來促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,作為致癌circRNA促進(jìn)CRC進(jìn)展.

因此,靶向抑制circ_VANGL1/miR-493-5p/FXR1途徑有可能成為CRC治療的新方向.未來將進(jìn)一步利用動(dòng)物模型探討circ_VANGL1/miR-493-5p/FXR1在CRC中的功能.