左 超，孫東雷，趙田禾，王靜靜，張遵真

四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院/四川大學(xué)華西第四醫(yī)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，成都 610041

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種波及全人群的慢性肝臟疾病，而全世界尚無(wú)藥物獲批用于NAFLD臨床治療[1]，尋求NAFLD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵靶點(diǎn)和有效干預(yù)藥物已成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。肝臟脂肪酸合成增加與脂肪酸分解減少被認(rèn)為是NAFLD發(fā)生發(fā)展的罪魁禍?zhǔn)譡2]，其中脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)是肝臟從頭合成脂肪酸的關(guān)鍵限速酶，F(xiàn)ASN表達(dá)增加會(huì)引起肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積導(dǎo)致肝臟脂肪變性[2]，因此，將FASN抑制劑用于改善NAFLD是藥物研發(fā)的新方向。三氯生(C4H7Cl3O2)是一種常見的廣譜抗菌劑，最初被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)抑制細(xì)菌FASN發(fā)揮抗菌作用[3]，近年研究顯示三氯生還可以抑制多種人源性細(xì)胞的FASN[4- 5]，不難推測(cè)三氯生可能通過(guò)抑制FASN減少肝細(xì)胞脂合成，可能具有治療NAFLD的潛力。但迄今為止并無(wú)將三氯生用于改善NAFLD的研究，三氯生是否能夠治療NAFLD的效果尚不清楚。此外，單一靶點(diǎn)藥物不足以改善NAFLD[1]，三氯生是否能夠作用于多靶點(diǎn)改善NAFLD同樣存疑。若能尋找到除FASN外三氯生改善NAFLD的其他靶點(diǎn)，可以為三氯生改善NALFD的研究提供更加全面的理論依據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年發(fā)展的、基于計(jì)算機(jī)的預(yù)測(cè)技術(shù)，可快速、高效預(yù)測(cè)化合物作用于疾病的多個(gè)靶點(diǎn)，可為探究化合物的成藥潛力與分子機(jī)制提供線索。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)三氯生對(duì)NAFLD的作用靶點(diǎn)，分析靶點(diǎn)富集的信號(hào)通路，并進(jìn)行初步的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，為未來(lái)深入研究三氯生治療NAFLD的作用與機(jī)制提供思路與依據(jù)。

材料和方法

數(shù)據(jù)庫(kù)三氯生的化學(xué)結(jié)構(gòu)資料和結(jié)構(gòu)信息SMILES式來(lái)自小分子化學(xué)物數(shù)據(jù)庫(kù)Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)?；衔镒饔冒悬c(diǎn)的預(yù)測(cè)與疾病靶點(diǎn)的獲取通常利用多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行交集分析，避免單一數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確性。因此，本研究使用PharmMapper(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)、HTDocking(https：//www.cbligand.org/AD/)、HitPick(http：//mips.helmholtz-muenchen.de/hitpick/cgi-bin/index.cgi?content=help.html)、SuperTarget(https：//bioinformatics.charite.de/supertarget/index.php?site=targets) 4個(gè)化合物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)三氯生的作用靶點(diǎn)，利用TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https：//omim.org/)和Genecards(https：//www. genecards.org/) 3個(gè)經(jīng)典的疾病數(shù)據(jù)庫(kù)獲取NAFLD疾病靶點(diǎn)，通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot(https：//www. uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB(http：//www1.rcsb.org/)中獲取蛋白三維結(jié)構(gòu)編碼(即PDB ID)。

藥品與試劑三氯生(純度≥97%)和羧甲基纖維素鈉購(gòu)于大連美侖生物有限公司，三氯生混懸液每日現(xiàn)配現(xiàn)用。60%高脂飼料購(gòu)于南通特洛菲飼料科技有限公司。10%中性甲醛組織固定液購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司。蛋白質(zhì)裂解液購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)α抗體購(gòu)于艾博抗生物有限公司。β-actin抗體購(gòu)于博士德生物有限公司。

動(dòng)物與飼養(yǎng)8周齡雄性C57BL/6J小鼠購(gòu)于四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2018- 026。C57BL/6J雄鼠喂養(yǎng)于四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證：SYXK(川)2018- 011，晝夜交替時(shí)間10/14 h，溫度26 ℃，相對(duì)濕度60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心倫理審查(編號(hào)：K2021027)。

三氯生作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取三氯生三維結(jié)構(gòu)與SMILES式，導(dǎo)入PharmMapper、HTDocking、HitPick和SuperTarget，預(yù)測(cè)三氯生的作用靶點(diǎn)。

非酒精性脂肪性肝病靶點(diǎn)的獲取以NAFLD的ICD- 10代碼 “K76.001”、“Non-alcoholic fatty liver diseases”作為關(guān)鍵詞，限定種屬“Homo sapiens(人類)”，在TTD、OMIM、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行疾病靶點(diǎn)的檢索，篩選NAFLD疾病靶點(diǎn)。

三氯生與NAFLD共同靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將三氯生作用蛋白與NAFLD疾病靶點(diǎn)通過(guò)蛋白-基因名稱轉(zhuǎn)換后進(jìn)行交集分析獲取共同靶點(diǎn)，使用R Project作韋恩圖。使用String平臺(tái)對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行“蛋白-蛋白”相互作用分析，利用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建共同靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出三氯生治療NAFLD潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。

三氯生治療NAFLD潛在靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證使用UCSF Chimera與Auto Dock Tool兩種分子對(duì)接軟件進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。將三氯生治療NAFLD潛在靶點(diǎn)的PDB ID輸入U(xiǎn)CSF Chimera與Auto Dock Tool軟件，計(jì)算三氯生與各蛋白的結(jié)合能，篩選能與三氯生穩(wěn)定結(jié)合的靶點(diǎn)。

三氯生與NAFLD共同靶點(diǎn)的生物過(guò)程與通路分析對(duì)篩選出的三氯生與NAFLD共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，使用R Project進(jìn)行可視化，探究靶點(diǎn)富集的生物過(guò)程和信號(hào)通路，結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(n=10)、模型組(n=10)和三氯生組(n=10)，小鼠自由攝食和飲水?？瞻讓?duì)照組使用普通飼料，模型組與三氯生組使用高脂飼料，飼養(yǎng)12周。建立NAFLD模型后三氯生組每日灌胃400 mg/(kg·d)劑量的三氯生混懸液；模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，按0.01 ml/g的灌胃體積連續(xù)灌胃8周；空白對(duì)照組繼續(xù)飼喂普通飼料。給藥結(jié)束，禁食不禁水12 h，處死小鼠，收集小鼠肝臟。每只小鼠剪取肝臟相同部位，10%中性甲醛組織固定液中固定24 h后由武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行HE染色與油紅O染色。稱取133 mg肝臟組織，加入1000 μl蛋白裂解液提取蛋白，并采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)小鼠肝組織中PPARα蛋白水平。

結(jié) 果

三氯生治療NAFLD潛在靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析本文探究三氯生治療NAFLD靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究流程見圖1。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)共獲得319個(gè)三氯生作用靶點(diǎn)和351個(gè)NAFLD疾病靶點(diǎn)，取交集后獲得34個(gè)共同靶點(diǎn)(表1)。將34個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入String并使用Cytoscape3.7.1計(jì)算每個(gè)靶點(diǎn)的Degree值并進(jìn)行可視化。Degree值表示靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中與其他靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，數(shù)值越大表明靶點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)具有更核心的地位，更具研究?jī)r(jià)值。結(jié)果顯示34個(gè)靶點(diǎn)的平均Degree值為10.38，其中ALB、AKT1、PPARG、IGF1、F2、MAPK8、FABP4、HMOX1、MPO、CASP3、ACE、APP、PPARA、STAT1、FASN、EGFR、SOD2、TTR、MMP2這19個(gè)基因的Degree值大于均值，節(jié)點(diǎn)更大、顏色更紅(圖2)，表明它們可能是三氯生治療NAFLD的潛在靶點(diǎn)，需要通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)一步驗(yàn)證。

1個(gè)圓形代表1個(gè)節(jié)點(diǎn)，在蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖中，Degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大、越紅

三氯生與潛在靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果潛在靶點(diǎn)與三氯生結(jié)合越穩(wěn)定，成藥潛力越大，因此，本文采用分子對(duì)接技術(shù)分析三氯生與上述19個(gè)潛在靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能。結(jié)合能<0 kcal/mol表明三氯生可與受體蛋白自發(fā)結(jié)合，能量越低結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定。三氯生與19個(gè)潛在靶點(diǎn)蛋白均能自發(fā)穩(wěn)定結(jié)合，其中UCSF Chimera對(duì)接得分顯示，PPARA、ALB對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)與三氯生的結(jié)合能最低，Auto Dock Tool結(jié)果顯示MAPK8對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)合能最低(表2)，表明PPARA、ALB、MAPK8對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白與三氯生結(jié)合構(gòu)象最穩(wěn)定。

表2 三氯生與潛在靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接得分

三氯生與NAFLD共同靶點(diǎn)的GO分析與KEGG通路分析為確定三氯生發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路，對(duì)篩選出的34個(gè)三氯生和NAFLD的共同靶點(diǎn)分別進(jìn)行KEGG通路和GO分析。KEGG通路分析顯示，34個(gè)共同靶點(diǎn)富集在PPAR信號(hào)通路、癌癥通路和丙型肝炎相關(guān)通路等10條信號(hào)通路(圖3)。其中，PPAR信號(hào)通路主要參與脂肪酸氧化分解代謝，是共同靶點(diǎn)高度富集的通路。GO分析表明，34個(gè)靶點(diǎn)的生物過(guò)程包含機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的敏感度、羧酸代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞脂質(zhì)分解等(圖4)；此外，這些靶點(diǎn)還與細(xì)胞和脂質(zhì)及激素的結(jié)合、核受體的活性、抗氧化能力等生物功能相關(guān)。

圖3 三氯生與NAFLD共同靶點(diǎn)的KEGG分析

圖4 三氯生與NAFLD共同靶點(diǎn)的GO分析

三氯生對(duì)NAFLD小鼠肝臟組織學(xué)形態(tài)與脂肪沉積的影響HE染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組小鼠肝臟細(xì)胞正常，肝索清晰；模型組可見肝臟細(xì)胞出現(xiàn)大量氣球樣變，細(xì)胞邊界模糊，肝索消失，可見大量脂肪空泡；三氯生給藥8周后，三氯生組小鼠肝臟細(xì)胞氣球樣變與脂滴空泡逐漸減少(圖5)。油紅O染色結(jié)果可見，空白對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核藍(lán)染；模型組小鼠肝細(xì)胞核藍(lán)染，胞質(zhì)內(nèi)聚集大量紅染的脂滴，三氯生給藥后小鼠肝臟中紅色脂滴顆粒顯著變小、變少(圖5)。使用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算油紅O染色脂滴面積與總面積的比值(即脂滴面積比)，結(jié)果顯示空白對(duì)照組小鼠肝臟脂滴面積比為0.01%，模型組小鼠肝臟脂滴面積比為59.99%，三氯生組小鼠肝臟的脂滴面積比為10.26%。與模型組相比，三氯生干預(yù)后小鼠肝臟的脂滴面積比下降了82.90%(F=96.952，P<0.001)。

圖5 小鼠肝臟HE染色與油紅O染色結(jié)果(×200)

三氯生對(duì)NAFLD小鼠肝臟組織中PPARα蛋白水平的影響與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠PPARα蛋白水平增加了62.66%(F=44.233，P<0.001)；與模型組相比，三氯生給藥后小鼠肝臟PPARα蛋白水平增加了133.90%(F=26.460，P<0.001)(圖6)。

PPARα：過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α；Mr：相對(duì)分子質(zhì)量

討 論

本研究初步預(yù)測(cè)到34個(gè)三氯生與NAFLD的共同靶點(diǎn)，通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用分析篩選出19個(gè)潛在靶點(diǎn)，并通過(guò)分子對(duì)接與KEGG分析的進(jìn)一步篩選，發(fā)現(xiàn)PPARα是三氯生治療NAFLD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。蛋白質(zhì)相互作用篩選出的19個(gè)潛在靶點(diǎn)中，SOD2與MPO參與細(xì)胞氧化應(yīng)激，MMP2、EGFR參與NAFLD進(jìn)展形成肝纖維化[6]，PPARG、PPARA、AKT1、MAPK8、ACE、ALB等基因與糖脂代謝紊亂有關(guān)[5，7- 9]，F(xiàn)ASN促進(jìn)肝臟脂肪酸合成[2]，表明三氯生可能是一個(gè)多靶點(diǎn)藥物。分子對(duì)接可根據(jù)三氯生與各靶點(diǎn)蛋白結(jié)合的穩(wěn)定程度判斷更易結(jié)合并發(fā)揮作用的靶點(diǎn)，結(jié)果提示PPARA、ALB以及MAPK8相應(yīng)靶蛋白與三氯生結(jié)合穩(wěn)定。PPARA翻譯出PPARα，參與調(diào)控肝臟脂肪酸氧化分解[10]，是肝臟脂肪含量減少的重要途徑。白蛋白(albumin，ALB)可作為NAFLD肝纖維化早期預(yù)測(cè)的血清標(biāo)志物，用于評(píng)估肝臟功能受損情況[11]，由于ALB變化不具有特異性[12]，難以作為NAFLD的治療靶點(diǎn)。MAPK8參與高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠糖脂代謝紊亂，是治療肥胖的潛在靶點(diǎn)[13]，但MAPK8可否改善NAFLD仍待確證。KEGG通路分析結(jié)果高度集中于PPAR信號(hào)通路，提示三氯生最可能通過(guò)PPAR信號(hào)通路發(fā)揮治療NAFLD作用，ALB與MAPK8未參與該通路，表明PPARα可能是所有潛在靶點(diǎn)中最具希望的靶點(diǎn)。PPAR信號(hào)通路包含3種不同的類型，其中PPARα主要在肝臟組織表達(dá)，是肝臟脂肪酸氧化分解的關(guān)鍵調(diào)控分子[2]。有研究顯示PPARα可以激活下游酶體如肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶- 1使脂肪酸進(jìn)入線粒體氧化分解，減少肝臟脂肪酸含量[2]。高脂飼料飼喂C57BL/6雌鼠8周，子代雄鼠肝臟PPARα蛋白表達(dá)均降低，肝臟出現(xiàn)脂肪變性[5]；使用添加PPARα激活劑的高脂飼料飼養(yǎng)子代雄鼠，肝臟脂肪變性明顯改善[5]。這些結(jié)果充分表明激活PPARα可以增強(qiáng)脂肪酸氧化分解、降低肝臟脂肪含量，達(dá)到治療NAFLD的作用。研究顯示三氯生可以激活小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1c1c7中的PPARα[4]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示三氯生能夠激活小鼠肝臟中的PPARα，增加細(xì)胞色素P4504A等參與脂肪酸代謝的酶的表達(dá)[14]，表明三氯生可能通過(guò)激活PPARα改善NAFLD。

肝臟脂肪酸合成是肝臟脂肪的主要來(lái)源，F(xiàn)ASN直接調(diào)控肝臟脂肪酸合成，因此，抑制FASN可以減少肝臟脂肪含量。重組腺病毒介導(dǎo)miRNA- 27a的過(guò)表達(dá)可以抑制肝臟中FASN mRNA的表達(dá)，從而抑制油酸鈉誘導(dǎo)的小鼠原代肝細(xì)胞三酰甘油的積累，降低雄性C57BL/6J小鼠肝臟中三酰甘油的含量[15]；此外，生物信息學(xué)分析提示FASN可能是NAFLD的治療靶點(diǎn)[16]，提示抑制FASN可以降低肝臟脂肪含量。筆者前期的體外實(shí)驗(yàn)顯示三氯生可以抑制肝細(xì)胞FASN mRNA和蛋白水平，減少細(xì)胞內(nèi)脂肪含量[17]，表明三氯生可以通過(guò)抑制FASN改善NAFLD肝臟脂肪變性。但KEGG分析并未富集到FASN等與脂肪酸合成途徑相關(guān)的通路，但分子對(duì)接結(jié)果顯示三氯生可以與FASN穩(wěn)定結(jié)合，因此不能簡(jiǎn)單否定三氯生對(duì)FASN的抑制作用。肝臟脂肪酸代謝主要包含脂肪酸的來(lái)源與排出兩個(gè)重要環(huán)節(jié)，其中FASN介導(dǎo)肝臟脂肪酸從頭合成，是肝臟脂肪重要來(lái)源；PPARα調(diào)控脂肪酸氧化，是肝臟脂肪減少的關(guān)鍵途徑；脂肪酸合成與氧化的紊亂則被認(rèn)為是NAFLD的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[2]。若能抑制脂肪酸攝取與合成、增強(qiáng)脂肪酸氧化代謝，理論上可以達(dá)到治療NAFLD的效果。然而，單獨(dú)激活PPARα增強(qiáng)脂肪酸氧化會(huì)導(dǎo)致脂肪酸過(guò)氧化物酶體β氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ω氧化代償性增加，產(chǎn)生活性氧加速疾病進(jìn)展[2]；而肝臟從頭合成的脂肪酸是激活PPARα的重要配體，完全敲除肝臟FASN會(huì)導(dǎo)致小鼠肝內(nèi)脂肪酸生成障礙，使PPARα因缺乏配體無(wú)法被激活，脂肪酸因此無(wú)法被正常氧化分解，引起肝臟脂肪變性[18]，因此，同時(shí)抑制FASN和激活PPARα，可避免上述單靶點(diǎn)治療NAFLD的不足，是極具希望的聯(lián)合靶點(diǎn)治療方向。

肝細(xì)胞氣球樣變、肝臟脂肪變性是NAFLD基本病理改變[19]，本研究模型組小鼠肝臟HE染色顯示肝臟出現(xiàn)大量脂滴空泡伴氣球樣變，三氯生組小鼠肝臟脂滴空泡幾乎消失。油紅O可將肝臟脂滴染為橘色，以此可直接觀察肝臟脂肪沉積，本研究模型組可見大面積的大顆粒橘紅色脂滴，三氯生干預(yù)后脂滴面積減少、顆粒顯著減小，表明三氯生可以有效降低肝臟脂肪含量。這些結(jié)果提示三氯生可以有效改善NAFLD小鼠肝臟病變。進(jìn)一步對(duì)PPARα的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示高脂飲食增加NAFLD小鼠肝臟PPARα蛋白水平的表達(dá)，表明NAFLD小鼠肝臟脂肪酸分解加強(qiáng)，這是由脂肪過(guò)度沉積引起的代償反應(yīng)[2]；在三氯生處理后，小鼠肝臟的PPARα蛋白水平與模型組相比增加，表明三氯生可以促進(jìn)PPARα水平增加，可能通過(guò)激活PPARα改善NAFLD。

借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，本研究預(yù)測(cè)到三氯生可能激活脂肪酸氧化的新的關(guān)鍵調(diào)控蛋白PPARα，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中首次揭示三氯生治療NAFLD的作用，驗(yàn)證三氯生可以提高PPARα蛋白表達(dá)水平。這些結(jié)果提示三氯生可能具有“雙管齊下”減少肝臟脂肪含量的潛力，是既可減少脂肪酸合成還可能增加脂肪酸氧化分解的雙靶點(diǎn)藥物候選。事實(shí)上，雙靶點(diǎn)藥物是更具價(jià)值和希望的NAFLD治療藥物的開發(fā)方向，本研究為將三氯生開發(fā)成為NAFLD雙靶點(diǎn)藥物提供了重要依據(jù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘的靶點(diǎn)僅為理論的作用靶點(diǎn)，必須進(jìn)行嚴(yán)格的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床檢驗(yàn)[20]，因此，在臨床中闡明三氯生的治療效果是未來(lái)的必經(jīng)之路。