王淑莉 邵靜 宋一麗 徐志文 劉明媚 佟香艷

(黑龍江省大慶油田總醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心，黑龍江 大慶 163001)

我國(guó)是一個(gè)世界人口大國(guó)，也是出生缺陷的高發(fā)國(guó)家。尤其是隨著“二孩政策”的開(kāi)放后，高齡孕婦在逐漸增多，導(dǎo)致出生缺陷防控壓力也在不斷增大。大慶市位于黑龍江省西部地區(qū)，其中黑龍江省每年約有出生缺陷患者1萬(wàn)人左右，其出生缺陷人口數(shù)量較大。部分出生缺陷可以通過(guò)治療干預(yù)緩解或改善疾病的不良后果，但重大的出生缺陷目前缺乏有效的治療措施，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)。因此研發(fā)出有效的技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷對(duì)于降低新生兒出生缺陷率具有重要意義[1]。在所有新生兒出生缺陷的疾病中，染色體疾病是其中最為嚴(yán)重的一類[2]。在以前的產(chǎn)前診斷中，本院利用染色體核型分析和熒光原位雜交技術(shù)對(duì)羊水進(jìn)行分析和檢測(cè)，但是無(wú)法滿足當(dāng)前的工作需求[3]。對(duì)此，本文主要分析低深度全基因組測(cè)序在大慶地區(qū)產(chǎn)前診斷的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)將研究?jī)?nèi)容報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇大慶油田總醫(yī)院于2020年1月1日至2020年12月31日的200例行羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷的妊娠孕婦和50例流產(chǎn)物絨毛組織進(jìn)行檢測(cè)分析。妊娠孕婦納入標(biāo)準(zhǔn)：胎兒超聲顯示結(jié)構(gòu)異常；產(chǎn)前篩查高風(fēng)險(xiǎn)；高齡孕婦(預(yù)產(chǎn)期年齡≥35周歲)；孕婦及其配偶任意一方具有染色體疾病的家族史；孕婦具有染色體疾病患兒的生育史；孕婦曾生育過(guò)死胎，或具有多次不明原因流產(chǎn)史[4]；同意接受隨訪至產(chǎn)后6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并感染性疾病或凝血功能障礙疾病、陰道流血、流液或腹痛、胎盤(pán)前置伴出血、羊水過(guò)少、孕婦當(dāng)日體溫≥37.3 ℃。流產(chǎn)物絨毛組織納入標(biāo)準(zhǔn)：患者身體健康，單胎，自愿接受流產(chǎn)病因?qū)W檢測(cè)，年齡在20～40歲，孕齡<12周患者。該研究獲大慶油田總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法 為本次研究中的所有孕婦均實(shí)施染色體核型分析聯(lián)合低深度全基因組測(cè)序(copy number variation sequencing，CNV-seq)技術(shù)，首先進(jìn)行樣本的采集，羊水取樣在超聲監(jiān)測(cè)下穿刺入羊膜腔，并利用15ml螺口離心管收集25～35ml，密閉后在4℃下保存，并于48h運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。流產(chǎn)物取樣需取黃豆粒大小(50～100g)，線平團(tuán)隊(duì)用生理鹽水多次沖洗，漂洗至無(wú)血液成分，并放入EP管中密封保存[5]，于4℃保存及運(yùn)輸，48h以內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室處理。將采集部分標(biāo)本送檢至北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)。

1.2.1 染色體核型分析技術(shù) 取羊水20ml將羊水經(jīng)37℃培養(yǎng)后收獲，經(jīng)過(guò)消化、低滲、固定等步驟制片編號(hào)[6]，做G顯帶(320～400條帶)進(jìn)行核型分析，必要時(shí)加做C顯帶、N顯帶。每例患者每線滴3張玻片，分別計(jì)數(shù)10個(gè)核型，對(duì)結(jié)構(gòu)異常核型計(jì)數(shù)至少30個(gè)核型，對(duì)數(shù)目異常的核型則分析數(shù)量加倍。按照《細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際體制ISCN2016標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行描述及診斷。所有操作均雙線進(jìn)行。

1.2.2 CNV-seq 技術(shù)染色體拷貝數(shù)變異檢測(cè)(可逆末端終止測(cè)序法)[7]，基于自主創(chuàng)新的快速簡(jiǎn)易建庫(kù)方法EZ-GALO保證100%建庫(kù)成功率。測(cè)序采用Hiseq2500快速檢出結(jié)果，不受平臺(tái)限制。生物信息學(xué)分析采用RUPA對(duì)比法快速檢測(cè)。孕婦羊水樣本及流產(chǎn)物樣本中全部染色體非整倍體以及大于100kb的DNA拷貝數(shù)異常情況。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察染色體核型分析聯(lián)合CNV-seq技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果(表1)。

表1 染色體核型分析聯(lián)合CNV-seq技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果

2 結(jié)果

本次研究中共有250例樣本，其中200例羊水樣本，50例流產(chǎn)物樣本，對(duì)200例羊水樣本進(jìn)行染色體核型分析聯(lián)合CNV-seq技術(shù)檢測(cè)，50例流產(chǎn)物樣本僅行CNV-seq技術(shù)檢測(cè)。30例陽(yáng)性羊水樣本中9例非整倍體染色體CNV-seq和核型分析均發(fā)現(xiàn)異常，CNV-seq相比于核型分析多檢出21例微缺失微重復(fù)綜合征胎兒：其中7例為明確致病性CNV；10例為致病性未知CNV，夫妻雙方知情同意驗(yàn)證。結(jié)果顯示母源性4人，父源性4人，2人未明確片段來(lái)源，經(jīng)夫妻雙方?jīng)Q定10個(gè)胎兒保留，隨訪至生后6個(gè)月未見(jiàn)明顯異常；2例可能良性胎兒保留，隨訪至產(chǎn)后6個(gè)月未見(jiàn)明顯異常；1例可疑致病夫妻雙方拒絕驗(yàn)證隨訪至妊娠26周，超聲發(fā)現(xiàn)胎兒咽腭部發(fā)育不良經(jīng)夫妻雙方協(xié)商終止妊娠。50例流產(chǎn)物樣本中，14例致病性CNV，可致胚胎結(jié)構(gòu)畸形，發(fā)育異常以及胚胎停育，進(jìn)一步夫妻雙方行染色體模型分析及CNV-seq檢測(cè)。既可以明確流產(chǎn)的遺傳學(xué)病因，可為再次妊娠提供指導(dǎo)意義。

3 討論

大慶市位于黑龍江西南部，是黑龍江省的地級(jí)市，隨著其人口素質(zhì)、經(jīng)濟(jì)水平的不斷提高，婚前檢查、生殖健康檢查、產(chǎn)前檢查及新生兒疾病篩查等方面的檢查率得到了大大提升。但由于大慶市處于東北地區(qū)，大部分人們對(duì)于出生缺陷的認(rèn)知不足及對(duì)產(chǎn)前診斷意識(shí)的淡薄，因此為了做好大慶市的先天性出生缺陷的防治工作，還需要更多的技術(shù)支持和深入研究[8]。

其中染色體疾病作為新生兒出生缺陷中最為嚴(yán)重的疾病，僅僅依靠核型分析和熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)等技術(shù)，無(wú)法涉及染色體微小結(jié)構(gòu)變異的遺傳病診斷，導(dǎo)致不能夠滿足臨床需求。CNV-seq是指應(yīng)用下一代測(cè)序技術(shù)對(duì)樣本DNA進(jìn)行低深度全基因組測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與人類參考基因組堿基序列實(shí)施對(duì)比后，以此來(lái)發(fā)現(xiàn)受檢樣本中存在的基因組拷貝數(shù)變異。將CNV-seq應(yīng)用在染色體疾病的產(chǎn)前診斷中，可以得到較好的診斷效果。第一點(diǎn)是由于CNV-seq具有較高的分辨率，可以檢出100kb以上的全基因組拷貝數(shù)變異。對(duì)于產(chǎn)前染色體病的診斷價(jià)值大于核型分析；第二點(diǎn)是由于在已經(jīng)具備自主開(kāi)展無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(non-invasive prenatal testing，NIPT)的機(jī)構(gòu)，測(cè)序設(shè)備已有，技術(shù)方法成熟；第三是其通量高，成本低，其中一張芯片最高可有效檢測(cè)80個(gè)樣本；第四是無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，具有易操作的優(yōu)勢(shì)，相比于核型分析來(lái)說(shuō)其報(bào)告周期較短[9]。同時(shí)在實(shí)施具體的產(chǎn)前診斷中，還可以將染色體核型分析與CNV-seq技術(shù)進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，這樣可有效提高大慶地區(qū)的染色體異常患病率以及異常疾病檢出率，并能夠幫助患者選擇最佳的產(chǎn)前診斷方案，最終有利于降低大慶地區(qū)的新生兒出生缺陷發(fā)生率。

綜上所述，低深度全基因組測(cè)序在大慶地區(qū)產(chǎn)前診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，可有效提高出生缺陷高危人群的異常染色體檢出率，與染色體核型分析聯(lián)合應(yīng)用后能夠提高其檢查效率[10]，最終可以為降低新生兒出生缺陷打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。