黃演林 余麗華 丁紅珂 曾玉坤 劉玲 陳洽鑫 劉暢*

(1.廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511400；2.廣東省婦幼保健院 耳鼻喉科，廣東 廣州 511400)

耳聾是由聽覺系統(tǒng)中的聽神經(jīng)及各級中樞病變而引起的聽覺障礙，是最常見的人類感覺系統(tǒng)缺陷[1]。先天性因素(遺傳)和后天性因素均可導(dǎo)致耳聾。據(jù)調(diào)查，世界范圍內(nèi)約4.66億人患中度以上聽力殘疾，我國聽力言語殘疾者達(dá)2780萬，約占中國殘疾人總數(shù)的33%，居我國各類殘疾之首[2]。非綜合型耳聾是指除聽力障礙外不涉及外耳畸形或其他器官系統(tǒng)的異常表現(xiàn)，約80%為常染色體隱性遺傳，20%為常染色體顯性遺傳[3]。目前，已發(fā)現(xiàn)超過25個基因與常染色體顯性非綜合征型聽力障礙相關(guān)，大部分為晚發(fā)型聽力障礙[4]。常染色體隱性非綜合征型障礙具有較大的遺傳異質(zhì)性，在大多數(shù)人群中，重度至極重度常隱非綜合征型聽力障礙的最常見原因是GJB2突變，輕度至中度常隱聽力障礙的最常見原因是STRC突變[5]。

由于非綜合征型耳聾存在臨床表現(xiàn)的差異及致病基因的不明確性，Sanger測序不適用于非綜合征型耳聾的基因診斷。在二代測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)的推動下，耳聾基因NGS檢測包發(fā)展迅速，可通過耳聾相關(guān)基因的目標(biāo)序列捕獲，進行高通量測序，達(dá)到很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，為耳聾分子診斷提供了新的方法[6]。本研究利用遺傳性耳聾精選基因檢測包對一耳聾先證者進行基因檢測，并對檢測到的突變位點進行Sanger測序驗證，同時收集家系其他成員進行Sanger測序。不僅成功鑒定了一種導(dǎo)致Joubert綜合征的新突變，豐富了Joubert綜合征的病因信息，同時為罕見疾病的產(chǎn)前診斷及臨床確診提供了一套可行的新方法。不僅成功鑒定了一種導(dǎo)致晚發(fā)型非綜合征型耳聾的致病變異，豐富了遺傳性耳聾的病因信息，同時為耳聾分子診斷提供一套可行的新方法。

1 材料與方法

1.1 病歷資料 譚CY，XX歲，因“家族中有多人耳聾”于廣東省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診。家族史：本人及父母、哥哥、大姑、二姑均體健，未見聽力障礙，其爺爺、三姑和小姑患有耳聾多年；曾爺爺也患有耳聾(已故)，其姑婆、大表姑、二表叔和小表叔均患有耳聾，二表叔女兒為耳聾成員中年齡最小者(21歲)，患有輕度聽力損失，詳見該家系圖(圖1)。本研究共收集該家系36個成員(3人已故)的資料，由于就診者本人及父母均無聽力障礙表現(xiàn)，首次實驗室檢查抽取其三姑譚JZ(44歲，耳聾30年)外周血，行遺傳性耳聾精選基因包檢測，測序結(jié)果經(jīng)Sanger測序驗證。耳聾基因包檢測及Sanger驗證結(jié)果均顯示存在致病基因位點，后收集該家系33人外周血進行Sanger測序。本研究獲得了廣東省婦幼保健院機構(gòu)審查委員會及廣州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。所有樣品的采集均取得了參與者的書面知情同意書。

圖1 GSDME基因突變致聾大家系圖

1.2 實驗方法

1.2.1 外周血DNA提取 用QIAGEN公司基因組DNA提取試劑盒QIAGEN DNA Blood Mini Kit按試劑盒說明書提取外周血DNA，使用Nanodrop2000超微量分光光度計進行提取DNA的定量，要求DNA樣本純度OD A260/280介于1.8～2.0之間。

1.2.2 遺傳性耳聾基因包檢測與分析 質(zhì)檢合格的基因組DNA經(jīng)超聲破碎儀打斷、末端修復(fù)、擴增、純化等操作制備測序文庫，采用特異性的捕獲探針(Roche NimbleGen, Madison, WI, USA)雜交富集目標(biāo)區(qū)域的DNA序列，目標(biāo)區(qū)域包括204個耳聾相關(guān)基因，3148個編碼區(qū)總共含有497507個堿基。采用Illumina NovaSeq 6000平臺進行測序。應(yīng)用商業(yè)軟件SoftGenetics NextGENe V2.4.1.2進行數(shù)據(jù)分析和變異檢測。參考基因組版本為GRCh37/hg19。根據(jù)gnomAD數(shù)據(jù)庫中次等位基因頻率(MAF)進行變異初篩(即過濾掉MAF>0.01的變異，GJB2 NM004004.5:c109G>A等高頻致病位點除外)。采用VarCards在線預(yù)測網(wǎng)站(包含SIFT、Polyphen2、MutationTaster和REVEL等23種預(yù)測算法)以及SpliceAI、varSEAK等工具對變異進行有害性預(yù)測，結(jié)合ClinVar、HGMD、Varsome和變異類型、文獻病例報道等信息，并根據(jù)ACMG/AMP指南對變異進行綜合評級和分類[7]。本文GSDME基因使用的轉(zhuǎn)錄本為NM_001127453.2。

1.2.3 Sanger測序 根據(jù)高通量測序結(jié)果用Sanger測序?qū)ο茸C者DNA及其他33個家系成員外周血DNA進行突變位點的檢測和驗證。采用Primer5軟件設(shè)計引物，擴增GSDME基因第8號外顯子及上下游10個bp的序列。引物序列為：GSDME-E8F:CACCAAGGATTAGCAATTTCAG,GSDME-E8R:AGAAGGGAAGGACCTGTAT。PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)；延伸72℃ 5min。

2 結(jié)果

2.1 二代測序結(jié)果 先證者耳聾基因包檢測及Sanger驗證結(jié)果顯示：GSDME基因第7號內(nèi)含子上(距離第8號外顯子2bp)發(fā)生了堿基替換，即c.991-2A>G，形成剪接位點變異，為雜合突變，通過外周血Sanger測序證實，該變異來源于先證者父親，其父親也為耳聾患者(先證者母親已故，未行基因檢測，生前未見耳聾)。變異信息見表1。GSDME基因相關(guān)疾病為常顯遺傳性耳聾5型，是常染色體顯性遺傳。臨床表現(xiàn)主要為語后、高頻率、進行性聽力損傷，一般在第一個10年發(fā)病[8]。

表1 GSDME突變家系二代測序結(jié)果

2.2 Sanger測序結(jié)果 本家系33個成員針對GSDME:c.991-2A>G致病位點進行了Sanger測序。結(jié)果顯示：所有耳聾家系成員均檢出該雜合致病位點(8/33，24.2%)，所有聽力正常者均未檢出(25/33，75.8%)，即約1/4的家系成員患病，Sanger測序結(jié)果詳見圖2。其中，首次就診者的表妹雖檢出該剪接位點變異，但由于其年齡相對較小，目前僅有輕度的聽力損失，符合該病進行性聽力損傷的特點。

3 討論

遺傳性非綜合型耳聾是指除聽力障礙外不涉及外耳畸形或其他器官系統(tǒng)的異常表現(xiàn)，約80%為常染色體隱性遺傳，20%為常染色體顯性遺傳[8]，目前， 已發(fā)現(xiàn)超過25個基因與常染色體顯性非綜合征型聽力障礙相關(guān)，大多數(shù)會導(dǎo)致語后聽力障礙，如ACTG1、CCDC50、EYA4、COL11A2、DIAPH1、MYH9、GSDME、MYO1A、MYO6等等，一般在生后第一個10年內(nèi)發(fā)病，以高頻率、進行性聽力損失為特征[4]。GSDME基因相關(guān)耳聾為常顯遺傳性耳聾5型(deafness, autosomal dominant 5，DFNA5; OMIM#600994)是一種常染色體顯性遺傳疾病，是由染色體7p15.3上的GSDME基因發(fā)生雜合突變引起的。GSDME基因包含10個外顯子，跨度約為60kb[9]。GSDME編碼Gasdermin-E蛋白，該蛋白是將非炎癥性細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)化為細(xì)胞焦亡的成孔蛋白的前體，在進行蛋白切割時，釋放的N末端部分(Gasdermin-E，N端)與膜結(jié)合并形成孔，引發(fā)細(xì)胞焦亡[10]。DFNA5患者多發(fā)病于兒童早期。此疾病是進行性的，臨床癥狀表現(xiàn)為感知性耳聾，雙耳在高頻率聲波波段聽力受損，隨著時間推移，聽力損失擴大到較低頻率聲波波段并迅速加重[8]。

圖2 GSDME基因Sanger測序峰圖(傳代數(shù)和成員編號與家系圖一致)

本文我們描述了一個包含36個成員的超大家系，首先對“耳聾30年”的先證者行遺傳性耳聾精選基因包檢測，發(fā)現(xiàn)一個剪接位點致病變異GSDME:c.991-2A>G，后針對33個成員進行了Sanger測序驗證，共發(fā)現(xiàn)8個家系成員攜帶該致病位點，且8位成員有7為重度或極重度耳聾，年齡最小的攜帶者則表現(xiàn)出輕度聽力損失，符合GSDME基因異常引起的DFNA5特征。已故的3個成員中有一個亦是耳聾患者。另有25位家系成員未檢出該剪接致病變異，且均未耳聾表現(xiàn)。所有陽性位點均為雜合突變，符合孟德爾顯性遺傳的特點。該家系為GSDME:c.991-2A>G位點所報道的最大家系，同時也是GSDME基因突變所報道的最大家系，家系中包含的患者人數(shù)最多(9個)。

本研究發(fā)現(xiàn)的位點GSDME:c.991-2A>G是一個新型的剪接位點變異，位于mRNA剪接區(qū)域，核苷酸序列高度保守，并且多種計算輔助算法也預(yù)測這個變化可能會影響剪接功能。這個變異在中國一個晚發(fā)型進行性非綜合征耳聾家系的多個患者中被檢出，臨床表現(xiàn)為高頻聽力受影響，并隨著年齡增長而加重，突變攜帶者有表現(xiàn)差異性[11]。到目前為止，這個變異在我們的參考人群基因數(shù)據(jù)庫(gnomAD)中未見人群頻率記錄。綜上所述，進一步結(jié)合送檢者的臨床表現(xiàn)和家系分析，依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)變異分類指南，這個變異暫定為“Ⅱ類-可能致病”。即具有較為充分的證據(jù)表明該變異是引起該家系成員耳聾的病因。

綜上所述，本研究利用二代測序技術(shù)成功鑒定了一種導(dǎo)致晚發(fā)型非綜合征型耳聾的剪接位點變異，并利用Sanger測序技術(shù)，從33個家系成員中確診了8個DFNA5患者，并且根據(jù)變異致病性分析，確認(rèn)此突變即為上文所述家系的遺傳學(xué)病因。此家系為迄今報道的最大家系，豐富了遺傳性耳聾的病因信息。二代測序技術(shù)為耳聾分子診斷提供一套可行的新方法。