張勝利 齊波 楊慶慧 陶華娟*

(1. 濰坊市婦幼保健院， 山東 濰坊 261011； 2. 浙江博圣生物技術(shù)股份有限公司， 浙江杭州 310007)

染色體是支配人類正常生長發(fā)育的遺傳物質(zhì)，若發(fā)生變異則會導(dǎo)致人類機(jī)體功能異常，且不易治愈，對患兒及家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，因此，通過產(chǎn)前診斷排查胎兒的健康狀況是最有效的防治策略。胎兒染色體異常的診斷方法包括核型分析、染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)和熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)等，其中核型分析是染色體疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)的核型分析無法檢出<10 Mb的染色體結(jié)構(gòu)異常[1]。伴隨著人類基因組計劃的完成及近年來分子遺傳學(xué)方向的迅速發(fā)展， CMA在臨床上的應(yīng)用得到快速的發(fā)展，已被推薦為兒童不明原因的發(fā)育遲緩及產(chǎn)前超聲異常的胎兒遺傳學(xué)檢測的首選診斷方法[2-4]，可用于檢測人類染色體微重復(fù)或微缺失引起的各種疾病，填補(bǔ)染色體核型分析不能檢測微缺失和微重復(fù)的不足[5]。臨床上應(yīng)用比較廣泛的CMA技術(shù)平臺包括單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism array，SNP array)和微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)[6]，相較于傳統(tǒng)的核型分析方法，它具有自動化程度高、準(zhǔn)確快速、靈敏度高及信息量大等優(yōu)勢[7]。產(chǎn)前診斷中常見的臨床指征都適用于CMA檢測，如B超異常、血清學(xué)篩查高風(fēng)險、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)高風(fēng)險、不良孕產(chǎn)史、高齡、夫妻一方染色體異常等，因此，對產(chǎn)前診斷臨床指征的準(zhǔn)確把握可能是困惑臨床一線醫(yī)生的主要原因。本研究通過探討CMA在高危妊娠人群中臨床應(yīng)用的可行性，指導(dǎo)臨床醫(yī)生準(zhǔn)確把握產(chǎn)前診斷的臨床指征，并充分做好遺傳咨詢，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018～2020年在濰坊市婦幼保健院行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦582例，所有孕婦各項輔助檢查無明顯禁忌證，且均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 核型分析 在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)抽取20 ml羊水，1500 rpm離心10 min，收集羊水細(xì)胞行常規(guī)培養(yǎng)，G顯帶，參考2016年人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體系(International System for Human Cytogenomic Nomenclature，ISCN)進(jìn)行核型分析及計數(shù)。

1.2.2 CMA 在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)抽取10 ml羊水，使用基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)提取gDNA，經(jīng)過SNP array 750K芯片(Affymetrix，美國)檢測，結(jié)合Chromosome Analysis Suite (ChAS) 3.2分析軟件和國際常用的公共數(shù)據(jù)庫(DECIPHER、OMIM、ClinGen、PubMed、DGV)進(jìn)行檢索和判讀。

1.3 CMA檢測結(jié)果的判讀及報告發(fā)放 在50kb/25marker缺失，100kb/25marker重復(fù)的分辨率水平對樣本進(jìn)行分析，報告致病變異、可能致病變異和臨床意義未明變異(variants of uncertain significance，VOUS)；不報告全基因組中已知屬于正常多態(tài)的拷貝數(shù)變化；提示3 Mb以上的雜合性缺失片段；對于判讀為VOUS的拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)片段，建議結(jié)合父母驗證結(jié)果明確CNV來源，若CNV遺傳自親代，判讀為偏良性的VOUS片段，若為新發(fā)變異則需進(jìn)一步的遺傳咨詢。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用EXCEL表格錄入數(shù)據(jù)，統(tǒng)計學(xué)處理582例高危妊娠產(chǎn)前羊水樣本的CMA檢測結(jié)果，使用計數(shù)和頻率描述統(tǒng)計結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 CMA檢測結(jié)果的異常類型分析 582例高危妊娠產(chǎn)前羊水中，CMA共檢出86例致病性和可能致病性變異，共占14.78%；其中常染色體數(shù)目異常病例39例，占比45.35%，常染色體雜合性缺失病例6例，占比6.98%，性染色體數(shù)目異常病例11例，占比12.79%，致病性CNV病例30例，占比34.88%。在致病性CNV病例中，小片段異常(<10 Mb)病例19例，占比22.09%，占總樣本數(shù)量的3.26%(表1)。

表1 CMA檢測結(jié)果的異常類型分析(n=86)

2.2 CMA與傳統(tǒng)核型分析檢出異常類型的對比分析 除去6例雜合性缺失病例，CMA檢出的80例異常病例中，常染色體數(shù)目異常病例39例，與核型分析檢出一致；性染色體數(shù)目異常檢出病例11例，相較于核型分析多檢出2例低比例嵌合病例，可能與培養(yǎng)后的細(xì)胞優(yōu)勢生長有關(guān)；致病性片段異常CMA檢出30例，核型分析檢出11例，CMA較核型分析多檢出19例致病性小片段異常(表2)。

表2 80例染色體異常病例的對比分析

2.3 不同羊水穿刺指征的CMA檢出率分析 高危妊娠孕婦的臨床指征可分為B超異常、血清學(xué)篩查高風(fēng)險、NIPT高風(fēng)險、不良孕產(chǎn)史、夫妻一方染色體異常、高齡和其他(包括孕期服藥、試管嬰兒和孕婦要求等)共7個部分。在不區(qū)分多種臨床指征共存的情況下，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)高齡和NIPT高風(fēng)險為CMA診斷率最高的臨床指征，共占52.63%；CMA診斷率較低的產(chǎn)前診斷指征包括夫妻一方染色體異常、不良孕產(chǎn)史和其他類型(表3)。

表3 不同羊水穿刺指征的CMA檢出率分析

2.4 CMA與NIPT的對照研究分析 NIPT檢出的173例異常病例中，CMA共確診40例，占比23.12%；統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)性染色體數(shù)目異常的符合度最高，假陽性率最低，另外，非目標(biāo)區(qū)域的常染色體數(shù)目異常假陽性率最高(表4)。

表4 CMA與NIPT的對照研究分析

2.5 不同B超異常病例的CMA檢出率分析 582例產(chǎn)前羊水中，B超異常病例共有300例，其中CMA確診病例45例(含1例雜合性缺失病例)。按照B超系統(tǒng)分類統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，多系統(tǒng)異常病例(包含2個及2個以上的B超異常指征)43例，CMA檢出異常病例9例，占比20.93%；單系統(tǒng)B超異常病例257例，CMA檢出異常病例35例，占比13.62%。在不區(qū)分B超多系統(tǒng)異常和單統(tǒng)異常的情況下進(jìn)行常見B超異常指征分類，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)胸腹部異常(40%)、生長受限(37.5%)、腸管異常(27.27%)、脈絡(luò)叢囊腫(22.22%)和胎兒頸部透明帶(NT)異常(21.28%)的CMA檢出率較高，腎臟異常沒有異常病例檢出(表5)。

表5 不同B超異常病例的CMA檢出率分析(例，n=300)

2.6 高危妊娠孕婦的臨床結(jié)局分析 隨訪480例病例中，45例隨訪失敗(無致病性病例，致病性病例隨訪率100%)。在隨訪病例中，正?；町a(chǎn)胎兒CMA檢出非整倍體異常病例4例(均為性染色體異常病例)，檢出臨床意義未明CNV(VOUS)異常病例33例，CMA檢測正常病例268例，無致病性CNV病例檢出；引產(chǎn)胎兒CMA檢測非整倍體38例，檢出VOUS異常病例5例，CMA檢測正常病例31例，檢出致病性CNV病例26例；出生異常胎兒CMA檢出非整倍體1例(性染色體異常病例)，檢出VOUS異常病例4例，CMA檢測正常病例20例，檢出致病性CNV病例1例(表6)。

表6 435例隨訪病例的妊娠結(jié)局分析[例(%)]

3 討論

孕期檢測發(fā)現(xiàn)的血清學(xué)篩查高風(fēng)險、NIPT高風(fēng)險及B超異常等病例，通過羊水穿刺術(shù)，結(jié)合產(chǎn)前診斷技術(shù)實(shí)現(xiàn)對染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常的準(zhǔn)確分辨是非常有臨床價值的；同時，在確定染色體異常來源的情況下，明確的診斷結(jié)果可以更好地評估再發(fā)風(fēng)險，指導(dǎo)下一胎生育。本研究的結(jié)果顯示，CMA可檢出的染色體異常類型包括非整倍體異常、雜合性缺失異常和染色體微缺失/微重復(fù)異常等。另外，CMA相較于傳統(tǒng)的核型分析，可多檢出19例病例，將產(chǎn)前診斷率提升3.26%。與本研究相似，已有很多相關(guān)的報道也提到了CMA在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的臨床應(yīng)用，肯定了CMA在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的應(yīng)用價值[8，9]。

高危妊娠孕婦的CMA診斷率較高的臨床指征為高齡和NIPT高風(fēng)險，分別為29.51%和23.12%，其中部分高齡孕婦合并其他異常，這可能是導(dǎo)致高齡孕婦診斷率較高的原因之一；此外，已有大量研究報道表明高齡是主要的產(chǎn)前診斷指征之一[10，11]。NIPT檢測采用新一代高通量測序技術(shù)，結(jié)合生物信息分析，用于評估胎兒患染色體疾病的風(fēng)險[12]，準(zhǔn)確度較高，是產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷的有效補(bǔ)充。本研究顯示，性染色體異常的病例確診率較高，甚至已經(jīng)超過了NIPT目標(biāo)疾病(21、18、13染色體數(shù)目異常)的診斷率，同時也有研究肯定了NIPT對于性染色體非整倍體的檢測效能[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)NIPT檢出的85例胎兒染色體片段異常中，經(jīng)過CMA驗證有20例確診為致病性片段。Pei等[14]的研究顯示NIPT檢測染色體片段異常的陽性預(yù)測值(positive predictive value，PPV)為14.89%，提示NIPT可作為胎兒染色體片段異常的篩查方法，CMA是確診胎兒染色體異常片段的最佳方法，NIPT與CMA的聯(lián)合應(yīng)用將會進(jìn)一步提升染色體異常的檢測效率，進(jìn)一步奠定其在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值。

本研究中B超異常是主要的產(chǎn)前診斷臨床指征，通過CMA實(shí)現(xiàn)對B超異常病例的及時診斷是非常有臨床意義的。通過對B超異常病例的分類分析發(fā)現(xiàn)，多系統(tǒng)異常病例的陽性率明顯高于單系統(tǒng)異常病例的陽性率，提示遺傳咨詢中需更加關(guān)注B超多系統(tǒng)異常病例，合理開展相關(guān)的檢查。此外，相較于傳統(tǒng)的核型分析，針對B超異常病例，CMA可多檢出2.67%的異常胎兒，大大提高異常胎兒的檢出率。隨著CMA在產(chǎn)前診斷中的深入應(yīng)用，中外權(quán)威機(jī)構(gòu)先后出臺了相應(yīng)指南規(guī)范，推薦CMA為產(chǎn)前B超異常胎兒遺傳學(xué)檢測的首選方法[4,15]。然而，目前國內(nèi)相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)仍需要更多的積累，來進(jìn)一步證實(shí)CMA在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價值。

雖然CMA可以檢出更多的染色體異常，但是CMA的高分辨率也會檢出較多的臨床意義未明CNV，又稱VOUS，給孕婦造成巨大的精神壓力，可能會導(dǎo)致不必要的引產(chǎn)。因此，應(yīng)嚴(yán)格界定產(chǎn)前診斷的臨床指征，且在進(jìn)行產(chǎn)前診斷前充分做好遺傳咨詢[16]。本研究中約有9.11%為臨床意義未明CNV病例，高于國外研究VOUS占比不超過5.00%的報道[17]。對本研究VOUS占比高于國外的一些報道進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)，需要通過及時結(jié)合新指南調(diào)整VOUS片段的報告標(biāo)準(zhǔn)，減少不必要的VOUS片段報告；進(jìn)一步完善父母驗證的臨床路徑，排除家族良性的可能；另外，需要多中心合作，積累中國人群的檢測數(shù)據(jù)，完善基于中國人群的本地化數(shù)據(jù)庫，提高國內(nèi)產(chǎn)前診斷基因芯片診斷的質(zhì)量。

本研究435例隨訪病例中，正常活產(chǎn)的胎兒VOUS病例占10.82%(33/305),提示CMA檢出VOUS病例有些是沒有致病意義的，因此，檢測后的遺傳咨詢?yōu)橹陵P(guān)重要的環(huán)節(jié)，需謹(jǐn)慎對待，本研究為產(chǎn)前遺傳咨詢指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。出生異常胎兒CMA檢測正常的病例占76.92%(20/26)，一是考慮CMA不能檢測點(diǎn)突變和平衡性結(jié)構(gòu)重排等異常，二是考慮遺傳因素為胎兒缺陷的主要原因，不能排除環(huán)境污染、病毒感染、濫用藥物、生活習(xí)慣等其他因素導(dǎo)致的胎兒缺陷。提示產(chǎn)前遺傳咨詢需結(jié)合孕婦的生活工作環(huán)境等因素綜合評估胎兒的生長情況，切實(shí)做好出生缺陷防控工作。

4 結(jié)論與展望

染色體異常是導(dǎo)致胎兒畸形的重要原因之一，針對染色體異常檢測發(fā)展出了不同的檢測方法，如核型分析可檢出大片段染色體異常和平衡性結(jié)構(gòu)重排，CMA可檢出小片段的染色體變異，全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)可檢出基因點(diǎn)突變，這些技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用基本可以檢出常見的遺傳性變異，而CMA在其中扮演著非常重要的角色。同時也說明每項技術(shù)都有其局限性，正如NIPT檢測準(zhǔn)確性較高，但仍屬于篩查，不能替代羊膜腔穿刺術(shù)[18]，同樣也不能取代血清學(xué)篩查。因此，實(shí)現(xiàn)多技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，可為孕婦提供更全面客觀的臨床信息，有助于臨床醫(yī)生做出更準(zhǔn)確的判斷，提出更合理的建議，進(jìn)而為降低出生缺陷貢獻(xiàn)力量，同樣這也為臨床實(shí)驗室提出了更高的要求，想必也是大勢所趨。

本研究由于樣本量有限，部分結(jié)果可能與現(xiàn)有報道存在一定的差異，為進(jìn)一步提高數(shù)據(jù)的可信度，未來需要統(tǒng)計更多的臨床病例或者開展多中心合作。