溫國琴

（朔州師范高等?？茖W(xué)校 自然科學(xué)系，山西 朔州 036002）

在基因技術(shù)不斷發(fā)展的時代背景下，對生物攜帶的遺傳信息進(jìn)行編輯已經(jīng)成為一種可實(shí)現(xiàn)的操作[1-2]，在對生物遺傳信息進(jìn)行定向操控時，其操作的對象也逐漸由原本大范圍的核酸酶[3]、鋅指核酸酶（Zinc Finger Ncleases，ZFNs）逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)小的類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（Transcription-like Activator Effector Nucleases，TALENs）[4]，直至現(xiàn)階段，已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)的對CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Nuclease9，Cas9）進(jìn)行相應(yīng)的編輯操作[5]。這種操作方式不僅更加簡單，表現(xiàn)出的應(yīng)用潛力也是巨大的，可以在極大程度上縮短水稻定向基因培育的時間成本。因此，將其應(yīng)用到遺傳育種領(lǐng)域的研究之中是十分具有潛力的[6]。

為此，本文提出了基因編輯技術(shù)在培育抗病毒水稻育種中的應(yīng)用研究，并通過試驗(yàn)測試驗(yàn)證了設(shè)計(jì)方法在提高水稻抗病毒能力方面的價值。通過本文的研究，也希望可以為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供有價值的參考。

1 利用CRISPR/Cas9進(jìn)行基因敲除處理

在自然條件下，水稻細(xì)胞在針對病毒的攻擊進(jìn)行DSBs修復(fù)時，HDR出現(xiàn)的概率相對較低，因此利用CRISPR/Cas9對水稻育種進(jìn)行研究時，首先就是敲除水稻上的致死基因[7]。在病毒的攻擊作用下，決定水稻抵抗能力的因素是水稻中奔達(dá)松敏致死基因BEL對病毒的抗性。結(jié)合該基本原理，去除染色體中表現(xiàn)出相關(guān)病毒的抗性功能缺失的基因是最快速提高其抗病毒能力的關(guān)鍵[8]。為此，首先要利用CRISPR/Cas9技術(shù)的編碼優(yōu)勢，設(shè)計(jì)具有高抗病毒性的BEL突變體基因序列，并將其嵌入到經(jīng)過特異性優(yōu)化的pSpCas9基因片段中，以pSpCas9基因片段的起始基因和終止基因?yàn)槟繕?biāo)，編碼水稻擬U6-26的啟動子。在此基礎(chǔ)上，借助獲得的BEL突變體的基因序列，以sgR-NA為編輯設(shè)計(jì)的靶標(biāo)序列，將轉(zhuǎn)化水稻愈傷基因編輯到pSpCas9基因片段中，此時的表達(dá)載體為BEL突變體。其具體操作方式如圖1所示。

圖1 CRISPR/Cas9基因敲除操作方式

需要注意的是，在進(jìn)行基因敲除處理時，水稻染色體上原有的部分純合突變體可能會表現(xiàn)出對pSpCas9基因片段的過敏反應(yīng)，這就意味著pSpCas9基因片段中存在部分編碼基因出現(xiàn)了雜交制種特定，此時需要進(jìn)一步優(yōu)化Cas9基因序列。優(yōu)化的目標(biāo)是提高pSpCas9基因片段在水稻中的表達(dá)效率，降低過敏反應(yīng)對水稻原有基因穩(wěn)定性的影響。具體的實(shí)施方法是針對水稻的OsCAO1和OsLAZY1基因?qū)嵤┒c(diǎn)突變，CRISPR/Cas9通過基因誘導(dǎo)突變的方式將水稻植株中所有產(chǎn)生過敏反應(yīng)的基因作為突變誘導(dǎo)的靶基因，令ospds突變體以上一位編碼序列為基礎(chǔ)進(jìn)行基因改良。在此基礎(chǔ)上，利用CRISPR/Cas9的載體作用對水稻的植酸合成關(guān)鍵酶基因ZmIPK2進(jìn)行PEG介導(dǎo)處理，使得水稻在病毒攻擊作用下，植酸合成機(jī)制不會受到影響，水稻的品質(zhì)能夠保持在穩(wěn)定的狀態(tài)。

2 利用CRISPR/Cas9進(jìn)行精確基因編輯

除了敲除水稻染色體上病毒抗性功能缺失的基因外，提高水稻抗病毒能力的另一個手段就是利用CRISPR/Cas9技術(shù)對基因進(jìn)行編輯操作，直接在其基因中導(dǎo)入具有高抗性的基因。對此，具體的操作可以分為單堿基編輯、基因替換和基因插入3種方式。在采用基因編輯方式實(shí)現(xiàn)該過程時，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)利用NbPDS作為編輯基因的載體，將雙鏈DNA Donor作為編輯基因轉(zhuǎn)化的催化劑，此時的外源DNA是以修復(fù)模板的形式存在的，以水稻DNA子區(qū)域?yàn)榫庉嫷陌形稽c(diǎn)，嚴(yán)格按照模板對基因進(jìn)行編輯。在完成初期的編輯后，經(jīng)過同源重組，編輯基因會與水稻原有基因發(fā)生替換反應(yīng)。此時最重要的操作環(huán)節(jié)就是避免編輯位置的DNA出現(xiàn)斷裂。因此需要借助CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對替換中出現(xiàn)的錯誤進(jìn)行修復(fù)。當(dāng)采用基因替換的方式在水稻染色體中嵌入高抗性基因時，同樣需要利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)提供外源DNA Donor，將DNA Donor的末端與非同源末端水稻OsEPSPS連接，替換對應(yīng)區(qū)間的編碼信息，這樣就可以直接獲得抗病毒的水稻。當(dāng)采用基因插入的方式在水稻的染色體中嵌入目標(biāo)基因時，首先要利用CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻基因組中的安全位置插入抗病的基因合成元件，以水稻原有基因的一條單鏈DNA片段作為模板，運(yùn)用第二代基因編輯工具對其進(jìn)行復(fù)制。Cas9切口酶在靶位點(diǎn)切斷原有的DNA雙鏈，并實(shí)現(xiàn)對堿基的替換操作。完成替換后，利用APOBEC1脫氨酶對切口位置進(jìn)行處理，確?；虻鞍椎耐耆诤希_保靶位點(diǎn)的插入基因穩(wěn)定發(fā)揮作用。

3 實(shí)例分析

在上述基礎(chǔ)上，以早秈稻為測試材料進(jìn)行了基因水稻育種效果試驗(yàn)測試，以此進(jìn)一步分析基因編輯技術(shù)在培育抗病毒水稻育種中的應(yīng)用效果。

3.1 測試方法

考慮到早秈稻屬中熟偏遲早秈品種類型，且具有較長的生育期，一般在108～111 d，因此受病毒攻擊的階段性更長，且在栽種階段，早秈稻具有株型緊湊的特征屬性，因此分蘗力相對較弱。采用CRISPR/Cas9技術(shù)對其基因進(jìn)行編輯處理后，將早秈稻的OsPIN9作為靶位點(diǎn)，進(jìn)行特異性編輯。最后分別在相同面積和土質(zhì)的地塊進(jìn)行栽種，面積均為100 m2，并觀察其生長狀態(tài)。

3.2 測試結(jié)果

在上述基礎(chǔ)上，分別統(tǒng)計(jì)了2組試驗(yàn)田中水稻的設(shè)置情況，其結(jié)果如圖2所示。

圖2 水稻基因處理前后長勢對比圖

從圖2中可以看出，未處理的水稻在幼苗階段就表現(xiàn)出病毒污染特征，整體長勢較弱，出現(xiàn)了明顯的黃葉。在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步分析CRISPR/Cas9技術(shù)處理后水稻的抗病毒效果，統(tǒng)計(jì)了相應(yīng)的基礎(chǔ)生長數(shù)據(jù)信息以及對病毒性疾病的感染情況，其結(jié)果見表1。

表1 基因編輯前后早秈稻生長數(shù)據(jù)信息

從表1中可以看出，經(jīng)過基因編輯的早秈稻不僅植株高度得到了一定提升，有效穗、成穗率以及結(jié)實(shí)率也都得到了明顯改善，且水稻結(jié)實(shí)質(zhì)量也得到了改善，千粒重由原來的22.67 g提升至26.42 g，這是因?yàn)槠涓腥景兹~枯病、水稻黃葉病、黃橙葉病、矮化病、暫黃病以及壞死花葉病的概率大大降低，表明編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對水稻的抗病毒培育。

4 結(jié)束語

水稻作為我國主要的糧食作物之一，是關(guān)系到人們基本生活質(zhì)量和飲食安全的基礎(chǔ)性因素。在病毒的作用下，水稻的產(chǎn)量以及結(jié)實(shí)質(zhì)量都會受到直接影響。本文提出基因編輯技術(shù)在培育抗病毒水稻育種中的應(yīng)用研究，分別從病毒抗性功能缺失基因敲除和高抗性基因嵌入的角度展開研究，實(shí)現(xiàn)了對水稻抗病毒能力的全面提升，優(yōu)化了水稻的產(chǎn)量以及結(jié)實(shí)質(zhì)量。