康 樂 陳 萍 陳仲華 區(qū)文歡 司徒堅 劉 彥 廖志鵬

廣東省江門市五邑中醫(yī)院 暨南大學附屬江門中醫(yī)院 529000

臨床上由于外部創(chuàng)傷和并發(fā)感染等原因引發(fā)的骨缺損、骨不連和延遲愈合等問題給患者帶來較大不便，其治療也是骨科醫(yī)生面對的棘手問題[1]。目前，骨移植材料主要來自自體骨、同種異體骨以及異種骨三種材料，但三種材料均存在一定程度的缺點，在應用上頗為受限[2]，近年來，隨著再生組織工程學技術的發(fā)展，基于生物材料為載體的骨組織工程修復技術取得長足進步，本研究前期成功制備了一類新型的載藥仿生骨修復支架材料，主要由成骨誘導因子三七總皂苷與磷酸三鈣(TCP)生物涂層組合形成，TCP材料克服了以往由聚乳酸、殼聚糖代表的高分子材料所具有的力學性能較低，以及羥基磷狄石陶瓷等為陶瓷韌性較差等缺點[3]，同時三七總皂苷主要來源于中藥三七，現(xiàn)代藥理學結果顯示，三七總皂苷可促進成骨細胞增殖，同時增強骨折缺血組織供血能力，進而促進愈合[4]?；诖?，為了深入研究三七總皂苷-TCP骨修復復合材料在臨床應用的可行性，本研究通過體外實驗，從細胞增殖速度、生化指標和細胞形態(tài)等多方面探討材料的生物相容性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 6月齡山羊1只(上海甲干生物科技有限公司)，胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶，青霉素—鏈霉素(美國Gibco公司)；噻唑藍(MTT，美國Sigma公司)，骨鈣素和堿性磷酸酶ELISA檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，三七總皂苷(西安百川生物科技公司)，S-3000N 掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，CKX41倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 三七總皂苷-TCP骨修復復合材料制備。將三七總皂苷溶于無水乙醇。隨后在30%的Na2HPO4溶液中400℃條件下浸泡10h，去離子水沖洗10min，真空干燥，隨后將三七總皂苷無水乙醇溶液與Na2HPO4·12H2O(23.75g/L)和Ca(NO3)2(18.2g/L)溶液中70℃條件下作用48h，用4%NaOH 去離子水飽和浸泡三七總皂苷8h，隨后用去離子反復清洗飽和三七總皂苷溶液至中性，冷凍干燥得到三七總皂苷-TCP復合材料。按照此方法制備載藥量分別為200、100、50、25、12.5μg/ml的三七總皂苷-TCP復合材料，對照組僅采用單純TCP，不加入三七總皂苷，亦不用含飽和三七總皂苷的溶劑浸洗。

1.2.2 山羊骨髓間充質干細胞的分離和培養(yǎng)。取6月齡山羊1只，采用戊巴比妥鈉麻醉，應用16號骨穿針行髂骨穿刺，吸取骨髓5ml，加等量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，2 000r/min離心5min，吸除上層脂肪層，隨后移取至100cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)5d至細胞貼壁后更換培養(yǎng)基，待生長至對數(shù)生長期進行傳代，取第2代細胞分別經(jīng)堿性磷酸酶和油紅O染色鑒定為骨髓間充質干細胞后進行后續(xù)實驗。

1.2.3 掃描電鏡。三七總皂苷-TCP骨修復復合材料約4mm×3mm大小，經(jīng)干燥后表面噴金，S-3000N掃描電子顯微鏡觀察其表面形態(tài)。

1.2.4 MTT增殖實驗檢測細胞增殖。取消毒過的三七總皂苷-TCP骨修復復合材料1.5g，眼科剪剪成碎末狀，置于成軟骨誘導培養(yǎng)基含40ng/ml地塞米松，10ng/ml轉化生長因子β1，100ng/ml胰島素樣生長因子-1；無血清培養(yǎng)，用20μm微孔濾膜過濾，加胎牛血清1.5ml，分別配成含200、100、50、25、12.5μg/ml材料浸提液。山羊BMSCs細胞接種至24孔板，待細胞貼壁，加入100μl材料浸提液繼續(xù)培養(yǎng)，每孔分別于第1、3、5、7天四個時間點加入20μl MTT溶液，離心棄液，加入DMSO 150μl，振蕩混勻5min，用酶標儀在570/630nm處測定吸光度(A)。

1.2.5 ELISA檢測骨鈣素和堿性磷酸酶含量。取經(jīng)不同濃度材料處理過并已培養(yǎng)7d的山羊BMSCs細胞，1 000r/min離心10min，去上清，PBS漂洗3遍，離心去上清，參照試劑盒說明測定細胞堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(OCN)含量。

2 結果

2.1 不同載藥量三七總皂苷-TCP復合材料的掃描電鏡觀察 仿生構建的三七總皂苷-TCP復合材料孔隙率適宜，孔隙相互聯(lián)通，孔徑均勻一致，均約為150μm，此空間結構適合細胞生長；載三七總皂苷劑量大小對TCP復合材料的結構無明顯影響，結構相似。詳見圖1。

a b c

2.2 三七總皂苷-TCP復合材料對細胞增殖影響 山羊 BMSCs在三七總皂苷-TCP復合材料浸提液中正常生長，增殖良好，5個濃度組與對照組的增殖率存在顯著性差異(P<0.05)。隨著三七總皂苷-TCP浸提液濃度的增大，山羊BMSCs的增殖率越高，并呈時間—劑量依賴效應(P<0.05)。詳見表1。

表1 三七總皂苷-TCP復合材料對細胞增殖率影響

2.3 三七總皂苷-TCP復合材料對ALP和OCN的影響 隨著三七總皂苷含藥濃度增高，ALP和OCN含量依次明顯增加，呈現(xiàn)劑量效應(P<0.05)，詳見表2。

表2 三七總皂苷-TCP復合材料對ALP和OCN影響

3 討論

現(xiàn)代藥理學研究結果表明三七總皂苷可誘導體外條件培養(yǎng)的間充質細胞向成骨細胞分化，具有促進骨折愈合的功效[5]。因此，三七總皂苷作為種骨誘導活性因子為用于骨組織工程研究提供了理論基礎。

隨著仿生學的發(fā)展，模擬新骨生長過程的復合材料逐漸得到應用，現(xiàn)有研究表明，TCP材料具有疏松多孔的表層，為植入體內的骨長入提供了良好的物理結構，同時生物相容性較好，可在體內誘導骨生成，促進愈合，目前已在骨修復領域中得到廣泛應用[6]。近年來，基于生物材料聯(lián)合成骨誘導活性因子的骨修復策略愈發(fā)受到關注。根據(jù)本研究前期細胞學實驗結果，最大載藥量可達200mg，其對材料的孔隙結構不發(fā)生顯著干擾，因此本研究制備了載5種不同劑量的三七總皂苷-TCP復合材料，同時采用的最大載藥量為200mg，電鏡掃描的載藥材料的結果顯示，載藥劑量對材料的密度、孔隙率和孔徑的影響甚小，因此可以判斷不高于200mg的載藥量對三七總皂苷-TCP材料的空間結構不會造成實質影響。從細胞相容性來看，采用材料浸提液培養(yǎng)第二代山羊骨髓間充質干細胞7d，單純TCP材料未抑制細胞增殖，表明該材料本身具有較高的安全性；載三七總皂苷材料明顯促進骨髓間充質干細胞的增殖，且具有時間和劑量效應，其原因主要是三七總皂苷的骨誘導活性因子發(fā)揮作用，可促進骨細胞增殖和分化，同時由于TCP材料成分主要是無機鈣，其隨著時間的延長逐漸降解，在細胞局部形成高鈣環(huán)境，為期增殖提供鈣源，從而促進成骨細胞增殖以及分化成熟，因此，三七總皂苷-TCP復合材料可協(xié)同促進細胞增殖，增進骨愈合。堿性磷酸酶可直接反映成骨細胞的活性或功能狀況，是反映成骨細胞活性和數(shù)量的專一標志物，是目前最常用的評價骨形成和骨轉換的指標[7]。骨鈣素又稱骨R-羥基谷氨酸蛋，在調節(jié)骨鈣代謝中起重要作用，能夠參與人體骨骼的新陳代謝，是研究骨代謝的一項新的生化標志物[8]。本研究結果顯示堿性磷酸酶和骨鈣素的含量具有劑量效應關系，也可進一步證實細胞增殖旺盛，促進向骨細胞分化，綜上來看，三七總皂苷-TCP復合材料同時可協(xié)同發(fā)揮促進成骨細胞增殖、分化和成熟[9]。

綜上所述，通過原位復合技術可構建出具有三維空間結構和要求的三七總皂苷-TCP復合材料，該材料生物相容性良好，為下一步開展的體內成骨實驗研究提供依據(jù)。