司秀文 羅麗卿 宋向芹 陳洪娜

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1 檢驗(yàn)科 2 血液科，山東省濱州市 256603

卵巢癌是女性生殖器官中最常見的惡性腫瘤之一[1-2]，可發(fā)生于任何年齡，其組織學(xué)類型多樣，卵巢腫瘤主要來源于卵巢上皮細(xì)胞，其惡性腫瘤稱為上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)。在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌是致死率最高的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌。由于早期其無癥狀發(fā)展，不易發(fā)現(xiàn)，確診時(shí)大部分患者已是晚期(Ⅲ期或Ⅳ期),錯(cuò)過了最佳的手術(shù)時(shí)間，預(yù)后很差[3-4]。盡管卵巢癌對(duì)基于鉑類化合物和紫杉類化合物等的一線化療藥物反應(yīng)良好，但大多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或者呈現(xiàn)化療耐藥[5-6]。對(duì)于大多數(shù)癌癥而言，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者死亡的一大特征。有研究表明，重組人AMH可抑制乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等細(xì)胞的增殖[7],本實(shí)驗(yàn)研究重組人AMH對(duì)人卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，為卵巢癌診斷和治療提供新的思路，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)中心)；Gibco公司的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基；杭州四季青公司的胎牛血清；R&D公司的重組AMH抗原；Corning公司的Transwell小室。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度為37℃、飽和濕度、細(xì)胞培養(yǎng)箱CO2濃度為5%、培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，熒光顯微鏡高倍鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞創(chuàng)傷愈合試驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞遷移能力 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得出濃度為200nmol/L重組人AMH對(duì)SKOV3細(xì)胞的抑制率可達(dá)到65%，選擇將濃度是200nmol/L重組人AMH 1ml加入培養(yǎng)的卵巢癌細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)48h，經(jīng)處理的卵巢癌細(xì)胞株SKOV3作為觀察組，未經(jīng)重組人AMH處理的卵巢癌細(xì)胞株作為陰性對(duì)照組，兩組細(xì)胞分別接種6孔板中，每組平行3個(gè)孔，在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞生長(zhǎng)至平鋪滿地板時(shí)，用加樣槍把孔板中的培養(yǎng)液吸去，再用PBS沖洗細(xì)胞3次，用100μl加樣槍的槍尖在融合至完全的單層細(xì)胞中間劃“(每孔5×105個(gè)細(xì)胞)一字形”的創(chuàng)傷，此為細(xì)胞創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)的模型。每組每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行劃痕后，顯微鏡下觀察并記錄劃痕區(qū)間的距離，用PBS溶液沖洗3次，再用低血清濃度的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在劃痕0h、24h、48h分別在200倍鏡下拍照，并用專門的電子尺軟件計(jì)算劃痕細(xì)胞兩側(cè)的距離，根據(jù)遷移速度=遷移距離/遷移時(shí)間計(jì)算出遷移速度，比較觀察組和對(duì)照組兩組細(xì)胞的遷移能力。

1.4 Transwell小室體外細(xì)胞侵襲試驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力 用Transwell培養(yǎng)小室對(duì)卵巢癌細(xì)胞的體外侵襲能力進(jìn)行檢測(cè)。將基質(zhì)膠Matrigel放于4℃冰箱過夜解凍，在24孔板中放入配套的Transwell小室，每個(gè)小室加稀釋好的基質(zhì)膠60μl，放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，孵育5h，形成人工基底膜。每組平行3個(gè)小室。分別接種重組人AMH處理48h后的細(xì)胞和未處理的陰性對(duì)照細(xì)胞100μl(調(diào)整細(xì)胞密度5×105/ml)于小室上室，下室中加入600μl含20%胎牛血清的DMEM，把接種后的小室置于37℃、5%CO2濃度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。從24孔板中取出小室，PBS沖洗2遍，用棉簽小心擦去小室微孔膜上層內(nèi)的細(xì)胞，將小室倒置風(fēng)干，用結(jié)晶紫染色15min，顯微鏡下取10個(gè)視野，拍照，計(jì)數(shù),取平均值。計(jì)算相對(duì)侵襲指數(shù)：V2/V1。V2是觀察組中穿過小室基質(zhì)膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)，V1是陰性對(duì)照組中穿過小室基質(zhì)膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1 重組人AMH 對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3遷移能力的影響分析 創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)中觀察組細(xì)胞進(jìn)入劃痕區(qū)域的細(xì)胞數(shù)目少，遷移速度慢，觀察組細(xì)胞遷移速度為(2.99±0.04)μm/h,顯著慢于陰性對(duì)照組的(9.02±0.06)μm/h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=244，P=0.01)。見圖1。

圖1 重組人AMH對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移的影響

2.2 重組人AMH 對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3侵襲能力的影響 Transwell小室體外細(xì)胞侵襲試驗(yàn)顯示觀察組細(xì)胞相對(duì)侵襲指數(shù)為0.38±0.03，與對(duì)照組相比，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40,P=0.01)。見圖2。侵襲實(shí)驗(yàn)中，用結(jié)晶紫染色后(圖3)，觀察組細(xì)胞穿過膜的數(shù)目為(15.00±1.00)個(gè)，明顯少于陰性對(duì)照組的(39.70±1.50)個(gè)。

圖2 重組人AMH對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響

圖3 重組人AMH對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響

3 討論

卵巢癌是常見的婦科致死率較高的惡性腫瘤之一[8]，常發(fā)生于圍絕經(jīng)期婦女,預(yù)后較差。由于缺乏典型的早期癥狀和有效的診斷方法，在超過70%的病例中，卵巢癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期[9]，此時(shí)進(jìn)行手術(shù)治療和化療，不能達(dá)到較好的效果。卵巢癌死亡率與診斷分期密切相關(guān),致死率在婦科癌癥中居首位。目前，對(duì)于卵巢癌的治療以手術(shù)治療為主，化療和放療為輔。而化療通常不良反應(yīng)較大，患者往往難以忍受，同時(shí)化療后腫瘤復(fù)發(fā)率較高，所以尋求新的治療方法和藥物是臨床研究的熱點(diǎn)。而腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移往往是患者死亡的一個(gè)主要原因，腫瘤是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移是臨床決定治療方案和評(píng)估判斷預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。腫瘤細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力是其轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵要素。腫瘤轉(zhuǎn)移指腫瘤從母體、原發(fā)病灶，通過各種途徑，如血液途徑、淋巴途徑、種植轉(zhuǎn)移、直接蔓延轉(zhuǎn)移到其他地方。腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程是一個(gè)復(fù)雜的多因素參與的過程。因此，探索卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲作用機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，提高患者的生存率，改善患者的生存質(zhì)量有著極其重要的臨床意義[10]。

AMH屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家庭成員之一，是由二硫鍵連接而成的相對(duì)分子質(zhì)量為140 000的糖蛋白，其基因位于人的19號(hào)染色體短臂上，在人體內(nèi)的半衰期大約為28h，完全清除大約需要8d，在性腺發(fā)育和性別分化過程中起著重要的作用。AMH也稱作苗勒管抑制物質(zhì)(MIS)，能夠引起苗勒管的退化，是生殖器官分化發(fā)育和卵泡發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子[11]。男性中AMH由睪丸支持細(xì)胞產(chǎn)生，促使胚胎中的苗勒管退化，形成男性正常生殖系統(tǒng)，同時(shí)參與精子的形成。女性中AMH主要由卵巢中的初級(jí)卵泡分泌產(chǎn)生。AMH受體主要有2類受體，抗苗勒管激素受體Ⅰ(AMHRⅠ)和抗苗勒管激素受體Ⅱ(AMHRⅡ)，AMH受體在子宮、卵巢等苗勒管起源的組織器官中呈現(xiàn)高水平表達(dá)。AMH主要通過自分泌和旁分泌，主要通過結(jié)合Ⅱ型受體發(fā)揮生物學(xué)作用。AMH濃度含量呈現(xiàn)特征性變化，在女性出生時(shí)濃度含量較低，之后含量逐漸升高，達(dá)到青春期后呈現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)期持續(xù)到25歲，之后含量逐漸下降。目前研究的AMH臨床應(yīng)用較多。精漿中AMH濃度與精子的活力有一定的相關(guān)性，可作為男性不育的一個(gè)輔助檢測(cè)指標(biāo)，為不孕癥的治療提供一個(gè)更加有效的方法。AMH可預(yù)測(cè)卵巢的儲(chǔ)備能力，能夠預(yù)測(cè)了解女性的生育功能，預(yù)測(cè)女性的絕經(jīng)年齡。AMH在多囊卵巢綜合征患者中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，在卵巢早衰患者中呈現(xiàn)低水平表達(dá)，可作為其診斷的一個(gè)輔助指標(biāo)。

近年來，更多的研究著重在AMH與婦科腫瘤之間的關(guān)系。在女性婦科腫瘤中可以檢測(cè)到AMHR的存在，研究表明AMH與卵巢顆粒細(xì)胞瘤的相關(guān)性最強(qiáng)。Dogan等[12]研究結(jié)果表明血清中AMH濃度在子宮內(nèi)膜癌患者和對(duì)照組中無明顯差異，與腫瘤的分期和組織學(xué)類型無關(guān)，而在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移后，AMH水平呈現(xiàn)增高。AMH在上皮性卵巢癌中研究表明AMH與上皮性卵巢癌也有一定的相關(guān)性。有研究表明，AMH在子宮內(nèi)膜異位癥中能夠抑制細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡[13]。Stephen等[14]研究表明短時(shí)間內(nèi)(1～3周)經(jīng)腸外給予高純度的重組人AMH藥對(duì)卵巢癌有一定的抑制性作用，為AMH可作為卵巢癌的腸外治療藥物提供了有力的臨床實(shí)驗(yàn)證據(jù)。Pieretti-Vanmarcke等[15]研究結(jié)果表明檢測(cè) rhAMH 對(duì)轉(zhuǎn)基因卵巢癌小鼠模型及從其腹水中 提取的 AMHRⅡ陽性細(xì)胞系的作用，再次驗(yàn)證了重組人 AMH體內(nèi)外對(duì)卵巢癌細(xì)胞有一定的抑制作用，同時(shí)治療周期長(zhǎng)達(dá)20周，證明了重組人AMH 的相對(duì)無害性和安全性。Zhang等[16]用重組人AMH處理培養(yǎng)人上皮性卵巢癌細(xì)胞系 OVCAR3和 OVCAR8，研究結(jié)果表明重組人AMH 能夠通過阻滯細(xì)胞周期G1/S期抑制其卵巢癌細(xì)胞的增殖，通過減少腫瘤干細(xì)胞因子的分泌誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。肖蘭等[17]研究表明用重組人抗苗勒管激素干預(yù)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR8和OVCAR3，能夠抑制表達(dá)AMHR的卵巢癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡。

本研究通過構(gòu)建細(xì)胞創(chuàng)傷模型檢測(cè)重組人AMH對(duì)卵巢癌細(xì)胞的遷移能力的影響。把AMH作為一種新的卵巢癌治療的靶點(diǎn)治療方法研究，其優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：AMH受體在體內(nèi)表達(dá)較少，相對(duì)副作用較??；一些患者呈現(xiàn)對(duì)化療藥物的耐藥，如果給予AMH治療，可能達(dá)到較好的效果。人體內(nèi)本身就存在一定量的AMH物質(zhì)，給予其AMH治療，相對(duì)本身來說不屬于外源物質(zhì)，不良反應(yīng)相對(duì)較少。本研究遷移能力試驗(yàn)結(jié)果顯示，觀察組細(xì)胞在48h細(xì)胞劃痕的愈合程度低于陰性對(duì)照組細(xì)胞，表明觀察組細(xì)胞的遷移能力明顯低于對(duì)照組細(xì)胞。本文研究通過構(gòu)建Transwell小室侵襲模型檢測(cè)重組人AMH對(duì)卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示觀察組穿過膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組。計(jì)算其相對(duì)侵襲指數(shù)，觀察組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞結(jié)果有顯著差異，表明重組人AMH能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，為卵巢癌的臨床治療和預(yù)后提供一個(gè)理論依據(jù)和一個(gè)新思路，AMH在卵巢癌治療方面有著較好的應(yīng)用前景，但是具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。