韓魯祥， 唐慧昕， 趙振峰， 李珊珊， 王全義， 孔令斌， 畢慧瑩， 舒振峰，段鐘平， 陳 煜， 洪 豐

1 濟寧醫(yī)學院 臨床醫(yī)學院， 山東 濟寧 272013； 2 首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 肝病中心四科， 北京 100069；3 臨沂區(qū)域細胞制備中心， 山東 臨沂 276000； 4 濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 山東 濟寧 272029；5 菏澤醫(yī)學?？茖W校醫(yī)學技術(shù)系， 山東 菏澤 274000； 6 上海美峰生物技術(shù)有限公司， 上海 201203

短期內(nèi)嚴重而持續(xù)的肝損傷可導致肝臟合成、代謝和生物轉(zhuǎn)化等功能迅速衰竭，出現(xiàn)以凝血障礙、進行性黃疸、頑固性腹水、肝性腦病等為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，一般藥物治療效果差，病死率極高[1]。刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)是從巴西刀豆中分離純化的一種凝集素，可激活CD4+T淋巴細胞，進而導致大量炎癥因子釋放，24 h內(nèi)即可出現(xiàn)大面積肝細胞壞死，目前該模型被廣泛用于研究免疫介導的急性肝損傷[2]。肝移植是目前內(nèi)科綜合治療難以救治的急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)最有效的方法。然而，供體肝的缺乏、術(shù)后并發(fā)癥的高發(fā)生率和高昂的經(jīng)濟成本限制了其臨床應(yīng)用。近年來，越來越多的研究表明，臍帶間充質(zhì)干細胞及其衍生的外泌體可有效治療ALF[3]。本課題組前期研究[4-5]顯示，成體人肝源性干細胞腹腔移植后可分泌大量對肝臟有保護作用的細胞因子。本實驗將進一步探討成體人肝源性干細胞外泌體(human liver stem cells-exosome，HLSC-exo)不同時間靜脈注射對ConA誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及細胞系 C57BL/6雄性小鼠56只(濟南朋悅實驗動物繁育有限公司)，SPF級，6～8周齡，體質(zhì)量19～21 g，使用許可證號：SYXK(魯)20180002，生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20190003，飼養(yǎng)于濟寧醫(yī)學院實驗動物中心。成體人肝源性干細胞(human liver stem cells，HLSC)由濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院洪豐教授建系，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，DMEM高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素)中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。

1.1.2 主要試劑及儀器 ConA(Sigma)；DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶、10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素(Gibco)；異氟烷(瑞沃德)；超凈無菌工作臺、超速離心機(Themo Fisher)；單克隆抗體CD9、CD63(潤基生物)；TNFα、IL-10試劑盒(酶免)；納米粒徑示蹤分析儀(Particle Metrix)；透射電鏡(Hitachi)。

1.2 實驗方法

1.2.1 HLSC-exo的提取及鑒定 差速離心法提取HLSC細胞培養(yǎng)上清的外泌體，Western blot檢測HLSC-exo特異性標志蛋白CD9、CD63的表達，納米顆粒跟蹤分析粒徑分布，透射電鏡拍攝電鏡圖片。

1.2.2 實驗動物及分組 采用隨機數(shù)字表法將56只C57BL/6小鼠分為7組，每組8只。空白對照組：每只小鼠經(jīng)尾靜脈給予200 μL PBS。ConA模型組：每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射PBS 200 μL，分別間隔3、6、12 h后經(jīng)尾靜脈注射ConA 12 mg/kg，分為ConA 3 h、6 h、12 h模型組；HLSC-exo治療組：每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射含3.2×109個HLSC-exo的PBS混懸液200 μL，分別間隔3、6、12 h后經(jīng)尾靜脈注射ConA 12 mg/kg，HLSC-exo 3 h、6 h、12 h治療組。各組在給予ConA 24 h后，處死小鼠，收集外周血，取標本。

1.3 肝生化指標檢測 注射ConA 24 h后，眼球取血于促凝管中，4000 r/min，10 min離心收集血清，送本院檢驗科檢測ALT、AST。

1.4 血清TNFα、IL-10水平測定 按照ELISA試劑盒說明書步驟測定血清中TNFα、IL-10水平。

1.5 小鼠肝組織病理檢測 處死小鼠后，暴露肝臟并留取照片，后取同一部位肝組織，福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，蘇木素和伊紅染色后光鏡下觀察。

2 實驗結(jié)果

2.1 外泌體鑒定 納米顆粒跟蹤分析結(jié)果顯示，約98.8%的HLSC-exo囊泡粒徑在90～110 nm(圖1)。透射電鏡下可見HLSC-exo清晰的“茶托樣”結(jié)構(gòu)(圖2)。Western blot 結(jié)果顯示，CD9和CD63蛋白均有明顯的表達(圖3)。

圖1 外泌體粒徑分析結(jié)果

圖2 外泌體電鏡下顯像(×80 000)

圖3 外泌體表面標志物的表達

2.2 肝功能指標變化 空白對照組小鼠ALT、AST水平分別為(31.81±6.74)U/L、(69.75±8.30)U/L。相較于空白對照組，ConA 3 h、6 h、12 h模型組小鼠ALT、AST水平明顯升高(P值均<0.001)；HLSC-exo 3 h、6 h治療組ALT、AST水平較ConA 3 h、6 h模型組明顯下降(P值均<0.001)；與HLSC-exo 6 h治療組相比，HLSC-exo 3 h治療組下降更明顯(P<0.001)；而HLSC-exo 12 h治療組與ConA 12 h模型組相比，ALT、AST變化不明顯(P值均>0.05)(表1)。

表1 各組小鼠肝功能ALT、AST水平

2.3 血清TNFα、IL-10水平變化 空白對照組小鼠IL-10、TNFα水平分別為(313.51±10.97)pg/mL，(476.05±7.31)pg/mL。相較于空白對照組，ConA 3 h、6 h、12 h模型組IL-10水平均明顯下降(P值均<0.001)；HLSC-exo 3 h、6 h治療組IL-10水平相較于ConA 3 h、6 h模型組明顯升高(P值均<0.001)；且與HLSC-exo 6 h治療組相比，HLSC-exo 3 h治療組升高更明顯(P<0.001)。

相較于空白對照組，ConA 3 h、6 h、12 h模型組TNFα水平明顯升高(P值均<0.001)；HLSC-exo 3 h、6 h治療組TNFα水平相較于ConA 3 h、6 h模型組明顯下降(P值均<0.001)；且與HLSC-exo 6 h治療組相比，HLSC-exo 3 h治療組下降更明顯(P<0.001)；而ConA 12 h模型組與HLSC-exo 12 h治療組比較，IL-10、TNFα水平均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

表2 各組小鼠血清IL-10、TNFα水平比較

2.4 肝臟大體和病理結(jié)果 正常小鼠肝臟大體表面光滑，質(zhì)地柔軟，呈鮮紅色，HE染色可見肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，無肝細胞變性、壞死或炎性浸潤的跡象。ConA 3 h、6 h、12 h模型組和HLSC-exo 12 h治療組小鼠肝臟表面粗糙，質(zhì)地變硬，有大面積灰白色點狀及片狀壞死，HE染色見肝細胞充血水腫明顯，肝實質(zhì)及膽管內(nèi)有炎性細胞浸潤，肝小葉受損，可見大面積壞死，界版不清。HLSC-exo 3 h、6 h治療組小鼠肝臟壞死程度較ConA組明顯減輕，HE染色可見炎癥細胞浸潤，肝細胞壞死較ConA模型組得到改善。與HLSC-exo 6 h治療組組相比，HLSC-exo 3 h治療組肝小葉基本完整，可見散在點狀壞死(圖4)，炎性浸潤和壞死程度明顯降低，而這些變化與肝功能變化一致,均提示HLSC-exo可逆轉(zhuǎn)ConA誘導的急性肝損傷，且以提前3 h注射保護作用最強。

注：a，空白對照組；b～d，ConA 3 h、6 h、12 h模型組；e～g，HLSC-exo3 h、6 h、12 h治療組。

3 討論

ALF進展迅速，病死率高達80%，常伴有多器官功能障礙，臨床上內(nèi)科綜合治療難以糾正的肝衰竭可選擇肝移植、血漿置換和人工肝治療。然而，肝源不足、人工肝治療的短期療效及高花費使其臨床應(yīng)用受限[6]。近年來，干細胞療法受到更多關(guān)注，但需要大量時間來培養(yǎng)細胞以達到治療所需數(shù)量，而ALF患者往往需要立即救治。外泌體是由細胞釋放到細胞外基質(zhì)中的膜囊泡，直徑30～100 nm，其成分包括DNA片段、mRNA、功能蛋白及轉(zhuǎn)錄因子等，可以用標準化技術(shù)提純冷存，且無需使用冷凍保存劑，可承受多次凍融循環(huán)，還可制備成凍干粉劑以備臨床應(yīng)用[7]。靜脈注射時，可通過肺循環(huán)到達靶器官，避免了干細胞療法肺栓塞的風險，且無致瘤副作用。

差速離心法仍是提取外泌體最廣泛的應(yīng)用方法，首先低速離心去除細胞和凋亡碎片，更高速離心以消除更大的囊泡，最后高速離心沉淀外泌體，該方法操作簡單、成本低、耗時較長、不需要分離試劑、外泌體獲量大，適合大量初始樣品的提取。商用外泌體提取試劑盒主要由2個孔徑分別為200 nm和20 nm的膜過濾器組成，樣品通過低速離心進行預(yù)處理，以分離較大顆粒和細胞碎片，高速離心使樣品通過膜過濾器，最終外泌體被截留在兩層膜中間，該方法簡單、快速、耗時短、獲量大，但存在分離試劑污染可能，而且通過膜孔的過程中由于剪切應(yīng)力和離心作用，外泌體可能會損傷，形態(tài)被改變，進而影響后續(xù)分析[8]。本實驗使用差速離心法提取HLSC-exo，獲量大，濃度可達1.6×1010個/mL，電鏡下結(jié)構(gòu)完整，可見清晰的“茶托樣”結(jié)構(gòu)。

本實驗結(jié)果表明，HLSC-exo可顯著降低轉(zhuǎn)氨酶水平，改善肝臟病理損傷，對 ConA誘導的急性肝損傷有顯著的保護作用， 尤其以提前3 h給予HLSC-exo的保護作用最好，提前6 h效果次之，提前12 h無明顯保護作用。HLSC-exo 3 h、6 h治療組轉(zhuǎn)氨酶水平較ConA 3 h、6 h組均明顯下降，且HLSC-exo 3 h治療組較HLSC-exo 6 h治療組下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義。同樣，病理結(jié)果也表明HLSC-exo 3 h、6 h治療組肝損傷程度較ConA組減輕，尤其HLSC-exo 3 h治療組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，僅有輕度充血水腫和炎性細胞浸潤，未見明顯肝細胞壞死情況。

CD4+T淋巴細胞被過度激活，TNFα、IL-1、IFNγ等炎癥因子的大量釋放以及肝組織嚴重壞死是ConA誘導的急性肝損傷模型的主要特點。IL-10主要通過抑制活化的T淋巴細胞分泌炎癥介質(zhì)，尤其是抑制輔助性T淋巴細胞(Th)1、Th2、Th17介導的免疫應(yīng)答，從而減輕肝損傷[9-10]。本實驗結(jié)果證實，HLSC-exo 3 h、6 h治療組小鼠血清TNFα水平較ConA組顯著降低，而IL-10水平較ConA組升高，表明HLSC-exo與人肝源性干細胞作用相似[5]，通過抑制促炎因子釋放，促進抑炎因子表達是減輕肝損傷的其中主要機制之一。

綜上所述，HLSC-exo靜脈注射可顯著減輕ConA誘導的小鼠急性肝損傷，調(diào)控細胞因子是其發(fā)揮治療作用的重要機制之一。此外，HLSC-exo靜脈注射時機不同可影響治療效果。

倫理學聲明：本研究方案于2021年2月13日經(jīng)由濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號：2021B169，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：韓魯祥、唐慧昕負責課題設(shè)計，實驗實施，收集數(shù)據(jù)，論文撰寫和修改；趙振峰負責干細胞培養(yǎng)及外泌體鑒定；李珊珊、畢慧瑩、舒振峰負責外泌體提取及鑒定；王全義負責病理學檢驗；孔令斌、段鐘平、陳煜負責指導動物實驗，統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)；洪豐負責指導實驗設(shè)計，審核實驗結(jié)果，指導論文撰寫與修改。