程雅楠 王 巖 孫榮欣 郎佳楠 曹 斌 楊龍艷 趙 冬

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院內(nèi)分泌代謝與免疫性疾病中心，北京 101149

甲狀腺癌是世界范圍內(nèi)和我國最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。甲狀腺乳頭狀癌（papillary carcinoma of thyroid，PTC）更是占我國甲狀腺癌的99%以上[2]。其特點(diǎn)是易轉(zhuǎn)移，且復(fù)發(fā)率高達(dá)25%[3-4]。三碘甲腺原氨 酸（triiodothyronine，T3）作為甲狀腺激素（thyroid hormone，TH）的主要活性成分，能通過與TH 核受體形成復(fù)合物介導(dǎo)自身的生物活性，發(fā)揮重要的生理功能[5-6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，T3能促進(jìn)人前列腺癌[7]、肺癌[8]、乳腺癌[9]細(xì)胞的增殖，增加腫瘤治療難度。然而目前，T3對PTC 細(xì)胞增殖的影響及其確切機(jī)制仍不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，TH 受體可以調(diào)節(jié)PDZK1 的表達(dá)[10]。PDZK1 能通過受體蛋白調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖[11]。因此本課題組推測T3可能通過調(diào)節(jié)PDZK1 表達(dá)而調(diào)控PTC 細(xì)胞的增殖，本研究將對此科學(xué)問題進(jìn)行探討論證，并期望為PTC 的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系TPC-1 購自國家生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源庫；RPMI-1640 培養(yǎng)基購自Gibco（貨號：C11875500BT）；胎牛血清購自Excell Bio（貨號：FND500）；活性炭處理過的胎牛血清購自HyClone（貨號：SH30068.03）；辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白（貨號：ZB-2305）、辣根酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白（貨號：ZB-2301）和anti-GAPDH 抗體（貨號：TA-08）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；anti-PDZK1 抗體（貨號：ab121248）購自Abcam；PDZK1 過表達(dá)慢病毒（滴度：2×108TU/ml，貨號：30038-J1）、陰性對照慢病毒（滴度：2×108TU/ml，貨號：CON335）和HitransG P（25×感染增強(qiáng)液，貨號：#REVG005）均購自上海吉凱基因；PDZK1 shRNA（h）慢病毒顆粒（貨號：sc-106840-V）和shRNA 慢病毒顆粒對照-A（貨號：sc-108080）購自Santa Cruz Biotechnology；T3（3，3，5-Triiodo-L-thyronine）（貨號：S5726）購自Sigma；2×Laemmli Sample Buffer（貨號：1610737）購自BIO RAD。

1.2 TPC-1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)TPC-1 細(xì)胞。將生長良好的處于對數(shù)生長期的TPC-1 細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞密度約60%時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

T3處理細(xì)胞：配置含不同濃度T3的細(xì)胞培養(yǎng)基：用含5%的活性炭處理過的胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋T3儲液，使T3終濃度分別為0、12.5、50 ng/ml。對照組（0 ng/ml T3處理組）、12.5 和50 ng/ml T3處理組的培養(yǎng)基換成相應(yīng)T3濃度的培養(yǎng)基（每組3 個(gè)復(fù)孔），在37℃，5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，PBS溶液洗滌細(xì)胞3 遍，用含β-巰基乙醇的2×Laemmli Sample Buffer 提取總蛋白，95℃金屬浴10 min 煮樣。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：共分為四組，敲減PDZK1（shPDZK1）組、敲減對照（shNC）組、過表達(dá)PDZK1（PDZK1）組、過表達(dá)對照（Vector）組。棄培養(yǎng)基，RPMI-1640 雙無培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1 遍。配制病毒轉(zhuǎn)染混合液：A 液為40 μl 感染增強(qiáng)液（25X）用RPMI-1640 雙無培養(yǎng)基稀釋成1 ml。B 液為40 μl PDZK1 shRNA（h）慢病毒顆粒（或shRNA 慢病毒顆粒對照-A，或PDZK1 過表達(dá)慢病毒，或陰性對照慢病毒）。A 液和B 液混合后即為轉(zhuǎn)染混合液，將上述轉(zhuǎn)染混合液按分組加入6 孔板內(nèi)，放入培養(yǎng)箱24 h 后換成RPMI-1640 完全培養(yǎng)基。48 h 后傳代至10 cm 培養(yǎng)皿培養(yǎng)。待細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)，將PDZK1 過表達(dá)慢病毒及陰性對照慢病毒感染的TPC-1 細(xì)胞利用流式細(xì)胞分選儀（購自美國BD 公司，型號：FACScantoll）分選出帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的細(xì)胞，用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析技術(shù)（real-time unlabeled cell function analysis technique，RTCA）和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖

RTCA 實(shí)驗(yàn)：TPC-1 細(xì)胞以2000 個(gè)/孔接種于E-plate 16 孔板中，貼壁后對照組（0 ng/ml T3處理組）、12.5 和50 ng/ml T3處理組培養(yǎng)基換成相應(yīng)T3濃度的培養(yǎng)基（每組3 個(gè)復(fù)孔），實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀（購自艾森生物科學(xué)公司，型號：xGElligene rtca）記錄細(xì)胞指數(shù)（細(xì)胞指數(shù)可實(shí)時(shí)反映細(xì)胞的生長增殖情況）。將更換為相應(yīng)T3濃度細(xì)胞培養(yǎng)基的時(shí)刻計(jì)為0 點(diǎn)，共持續(xù)記錄28 h。

克隆形成實(shí)驗(yàn)：TPC-1 細(xì)胞以1500 個(gè)/孔接種于6 孔板中，貼壁后對照組（0 ng/ml T3處理組）、12.5 和50 ng/ml T3處理組培養(yǎng)基換成相應(yīng)T3濃度的培養(yǎng)基（每組3 個(gè)復(fù)孔）。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。組織細(xì)胞固定液固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色后拍照，計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)（含有10 個(gè)細(xì)胞以上的集落為1 個(gè)克隆）。

1.4 Western blot 檢測

提取的蛋白樣品用10%SDS-PAGE 分離后轉(zhuǎn)PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。anti-PDZK1（1∶1000）抗體、anti-GAPDH（1∶3000）抗體4℃孵育過夜，TBST洗4 次，分別用辣根酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白（1∶3000）、辣根酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白（1∶3000）室溫孵育1 h，TBST 洗4 次，用Bio-Rad XRS 化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)測量信號強(qiáng)度。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的測定

shPDZK1 組及shNC 組細(xì)胞感染48 h 后，PDZK1組及Vector 組細(xì)胞感染48 h 分選后，均接種于6 孔板上，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，PBS 洗滌細(xì)胞3 遍，用含β-巰基乙醇的2×Laemmli Sample Buffer 提取總蛋白，95℃金屬浴10 min 煮樣，Western blot 檢測PDZK1 的表達(dá)。

1.6 T3 對shPDZK1 組、shNC 組、PDZK1 組和Vector組細(xì)胞增殖的影響

shPDZK1 組、shNC 組、PDZK1 組 和Vector 組 細(xì)胞分別以1500 個(gè)/孔接種于6 孔板，各組內(nèi)再分為3 個(gè)不同T3濃度的處理組（0、12.5、50 ng/ml），每個(gè)處理組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)基替換為相應(yīng)T3濃度的培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。組織細(xì)胞固定液固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色后拍照，計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選擇GraphPad Prism 8 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析作圖，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T3 對TPC-1 細(xì)胞增殖和克隆形成的影響

RTCA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，12.5 及50 ng/ml T3處理組TPC-1 的細(xì)胞指數(shù)明顯高于對照組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，12.5 及50 ng/ml T3處理組TPC-1 的克隆形成數(shù)明顯多于對照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。12.5 ng/ml T3處理組與50 ng/ml T3處理組細(xì)胞指數(shù)及克隆形成數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1。

2.2 T3 對TPC-1 細(xì)胞中PDZK1 表達(dá)的影響

Western blot 的結(jié)果顯示，12.5 及50 ng/ml T3處理組細(xì)胞中PDZK1 表達(dá)量明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。12.5 ng/ml T3處理組與50 ng/ml T3處理組PDZK1 蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖2。

2.3 shPDZK1 組與shNC 組中PDZK1 表達(dá)水平比較

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與shNC 組比較，sh-PDZK1 組細(xì)胞中PDZK1 表達(dá)量明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見圖3。

2.4 PDZK1 組與Vector 組中PDZK1 表達(dá)水平比較

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與Vector 組比較，PDZK1 組細(xì)胞PDZK1 的表達(dá)量明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖4。

2.5 T3 對shPDZK1 組及shNC 組細(xì)胞增殖的影響

在0、12.5、50 ng/ml T3處理下，與shNC 組比較，shPDZK1 組細(xì)胞的克隆形成數(shù)均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖5。

2.6 T3 對PDZK1 組及Vector 組細(xì)胞增殖的影響

在0、12.5、50 ng/ml T3處理下，與Vector 組比較，PDZK1 組細(xì)胞的克隆形成數(shù)均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見圖6。

3 討論

甲狀腺癌根據(jù)組織學(xué)類型分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌，以濾泡上皮細(xì)胞起源的PTC最常見[12-13]。最近一項(xiàng)數(shù)據(jù)庫分析顯示，PTC 發(fā)病率在過去幾十年里一直穩(wěn)步上升[2]，雖然短期預(yù)后良好[14]，但是易轉(zhuǎn)移[3]且復(fù)發(fā)率高[4]仍是導(dǎo)致其死亡率升高的原因[15]。因此尋找能夠防治PTC 的有效靶點(diǎn)，將對提高PTC 患者的生活質(zhì)量和生存率有重要意義。

TH 是甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞分泌的重要調(diào)節(jié)因子，能調(diào)節(jié)機(jī)體的發(fā)育、代謝及細(xì)胞的增殖、凋亡和分化[5,16-17]，其中T3是主要發(fā)揮作用的TH，能與TH 核受體形成復(fù)合物[5]來發(fā)揮生理功能[6]，對腫瘤的增殖過程也產(chǎn)生重要影響[7-8]。在本研究中，利用不同濃度的T3處理PTC 細(xì)胞系TPC-1 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)T3促進(jìn)TPC-1 細(xì)胞的增殖和克隆形成，這與之前的研究結(jié)果相類似[18-19]。

T3能作用于TH 受體發(fā)揮功能[5]，TH 受體可以調(diào)節(jié)PDZK1 的表達(dá)[10]。由此本課題組猜測T3可能通過PDZK1 調(diào)節(jié)PTC 的增殖。PDZK1 作為一種支架蛋白[20]，存在于甲狀腺組織在內(nèi)的多種組織，根據(jù)組織的特異性[21-26]在癌癥過程中起雙重作用。在本研究中，采用不同濃度的T3處理PTC 細(xì)胞系TPC-1，Western blot 結(jié)果顯示T3能夠促進(jìn)TPC-1 中PDZK1 的表達(dá)。TPC-1成功敲減PDZK1（或過表達(dá)PDZK1）后，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與shNC 組比較，shPDZK1 組TPC-1 的克隆形成能力減弱，與Vector 組比較，PDZK1 組TPC-1的克隆形成能力增強(qiáng)，提示敲減PDZK1 抑制TPC-1的克隆形成；而過表達(dá)PDZK1 促進(jìn)TPC-1 的克隆形成，提示PDZK1 在TPC-1 中有促克隆形成的作用。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)12.5 及50 ng/ml T3處理后，shPDZK1組細(xì)胞的克隆形成能力較shNC 組明顯減弱，PDZK1組細(xì)胞的克隆形成能力較Vector 組明顯增強(qiáng)，提示敲減PDZK1 后，T3對細(xì)胞克隆形成的促進(jìn)作用明顯減弱，而過表達(dá)PDZK1 后，T3對細(xì)胞克隆形成的促進(jìn)作用明顯增強(qiáng)，提示T3可能通過上調(diào)PDZK1 的表達(dá)促進(jìn)TPC-1 細(xì)胞的增殖和克隆形成。

綜上所述，T3可能通過調(diào)節(jié)PDZK1的表達(dá)影響PTC 細(xì)胞系TPC-1 的增殖，為PTC 防治提供理論依據(jù)。