沈雁翔 梁言 王鵬 陸燕青 彭勇政 陶懿偉 曾麗*

(1上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2上海莘辛園藝有限公司，上海 201114)

舞春花（Calibrachoa hybrida），又名小花矮牽牛，因其花期長(zhǎng)、花量大、花冠顏色豐富、觀賞價(jià)值高，近年來(lái)在園林綠化中得到越來(lái)越廣泛應(yīng)用，成為了目前重要的園林綠化草本花卉之一[1-2]。舞春花雖與矮牽牛為同科不同屬植物，且舞春花具有矮牽牛缺乏的鮮艷、亮麗的黃色花品種，但兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，存在有性雜交障礙（前人對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果表明，兩者絕大多數(shù)雜種胚胎在授粉后的幾天內(nèi)就停止發(fā)育[3]），故難以通過(guò)常規(guī)雜交技術(shù)獲得鮮艷、亮麗的黃色花矮牽牛新品種。研究表明，植物原生質(zhì)體融合是克服遠(yuǎn)緣雜交親和性差的一種有效的育種手段[4]，故建立舞春花原生質(zhì)體分離體系，既能為進(jìn)一步原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合奠定基礎(chǔ)，又能為培育亮黃色矮牽牛及舞春花新品種提供一種新途徑[5]。

植物原生質(zhì)體是指植物細(xì)胞壁以內(nèi)的植物原生質(zhì)部分。自1960 年首次利用纖維素酶從番茄根尖分離出原生質(zhì)體以來(lái)，目前前人已在水稻、小麥和馬鈴薯等植物中開(kāi)展了原生質(zhì)體融合的相關(guān)研究，并實(shí)現(xiàn)了種質(zhì)資源的創(chuàng)新[6-8]。而原生質(zhì)體融合技術(shù)必須建立在高效高產(chǎn)的原生質(zhì)體分離技術(shù)上，前人也已在擬南芥、水稻、玉米、煙草、馬鈴薯、甜櫻桃等植物中建立了原生質(zhì)體分離體系[9-15]，但關(guān)于舞春花原生質(zhì)體分離的研究較少，僅Meyer等[16]于2009年對(duì)12個(gè)舞春花品種進(jìn)行了原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)，但分離效率低、可重復(fù)性差；同時(shí)，有關(guān)黃色花舞春花品種原生質(zhì)體分離體系的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。在此背景下，筆者擬以黃色花舞春花的幼嫩葉片為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)研究其幼嫩葉片的預(yù)處理方式和原生質(zhì)體分離的酶液組合、酶組合滲透壓、酶解時(shí)間等原生質(zhì)體分離的關(guān)鍵因素，來(lái)獲得適宜的舞春花原生質(zhì)體分離條件，從而建立舞春花原生質(zhì)體分離體系，進(jìn)而為舞春花與矮牽牛原生質(zhì)體融合提供實(shí)驗(yàn)材料，以及為舞春花和矮牽牛種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)采用的舞春花品種為泛美種子公司的Calibrachoa hybrid“Lindura Yellow”，該品種的花為黃色，種子購(gòu)于鄭州貝利得花卉有限公司，采用播種育苗方式獲得實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)試劑為甘露醇、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）、牛血清白蛋白（BSA）、二乙酸熒光素（FDA）、纖維素酶R-10、果膠酶Y-23、離析酶R-10、CPW溶液、CaCl2。

1.2 外植體的準(zhǔn)備

取舞春花枝條頂芽下第2～5片生長(zhǎng)健壯的幼嫩葉片，在黑暗、4 ℃條件下處理1 d，在洗衣粉水中浸泡20 min后，用流水沖洗90 min，再轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)，用75%酒精浸泡20～30 s，然后用1%次氯酸鈉消毒90～120 s，最后用無(wú)菌水沖洗3次。

1.3 原生質(zhì)體的分離和純化

將準(zhǔn)備好的外植體（葉片）切成厚度為0.5 mm的細(xì)絲，原生質(zhì)體的分離和純化參考王鵬的實(shí)驗(yàn)方法[17]。

1.3.1 適宜的離析酶濃度篩選

參照王禮強(qiáng)等[18]的研究方法和Meyer等[16]分離舞春花原生質(zhì)體的實(shí)驗(yàn)條件，設(shè)置4個(gè)酶解液組合，其中，纖維素酶和果膠酶的含量均為0.2%，離析酶濃度分別為0（Ⅰ號(hào)）、0.4%（Ⅱ號(hào)）、0.8%（Ⅲ號(hào)）、1.2%（Ⅳ號(hào)），甘露醇濃度為0.25 mol/L，附加20 mmol/L 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸（MES）、0.1%牛血清白蛋白（BSA）、0.11%CaCl2，酶解時(shí)間為6 h，測(cè)定不同離析酶濃度下舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。

1.3.2 適宜的酶解時(shí)間篩選

采用1.3.1中的Ⅲ號(hào)酶液組合，設(shè)置2、3、4、5、6、7 h共6個(gè)酶解時(shí)間梯度進(jìn)行酶解，測(cè)定不同酶解時(shí)間下舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。

1.3.3 適宜的甘露醇濃度篩選

采用1.3.1中的Ⅲ號(hào)酶液組合，設(shè)置0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L共 5個(gè)甘露醇濃度梯度，酶解5 h，測(cè)定不同甘露醇濃度下舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。

1.3.4 預(yù)處理方式的選擇

采用1.3.1中的Ⅲ號(hào)酶液組合，甘露醇濃度0.25 mol/L，設(shè)置預(yù)先質(zhì)壁分離處理（0.55 mol/L CPW溶液浸泡1 h）、低溫黑暗處理（4 ℃放置24 h）、不預(yù)處理對(duì)照共3個(gè)不同的預(yù)處理方式，測(cè)定不同預(yù)處理方式下舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。

1.4 原生質(zhì)體產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)和活力檢測(cè)

采用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量，計(jì)算公式為原生質(zhì)體產(chǎn)量=原生質(zhì)體個(gè)數(shù)÷葉片質(zhì)量，10次重復(fù)。

采用二乙酸熒光素（FDA）染色法檢測(cè)原生質(zhì)體的活力，即取洗滌過(guò)的原生質(zhì)體懸浮液0.5 mL，加入FDA溶液使其最終濃度為0.01%，混勻置于室溫條件下5 min后，用熒光顯微鏡觀察，有活力的原生質(zhì)體產(chǎn)生黃綠色熒光，無(wú)活力的原生質(zhì)體則不產(chǎn)生熒光[19]。原生質(zhì)體的活力采用一個(gè)視野內(nèi)產(chǎn)生熒光的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)占總數(shù)的百分比表示，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)10個(gè)視野，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 離析酶濃度對(duì)舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

由圖1可知，不同離析酶濃度會(huì)顯著影響舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力，適宜的離析酶濃度可促進(jìn)舞春花原生質(zhì)體的分離。隨著離析酶濃度的增加，舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)，以離析酶濃度為0.8%時(shí)，舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力表現(xiàn)最好（原生質(zhì)體形狀、大小基本一致，邊緣清晰，內(nèi)含物多，碎片少，產(chǎn)量為4.4×106個(gè)/g，活力為76%），離析酶濃度低于0.8%或高于0.8%時(shí)，舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力均下降。

圖1 不同離析酶濃度對(duì)舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

2.2 酶解時(shí)間對(duì)舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

由圖2可知，不同酶解時(shí)間會(huì)顯著影響舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)，以酶解時(shí)間為5 h的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為5.1×106個(gè)/g；隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，舞春花原生質(zhì)體的活力表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢(shì)。綜合分析，5 h為舞春花葉肉原生質(zhì)體分離的適宜酶解時(shí)間。

圖2 不同酶解時(shí)間對(duì)舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

2.3 甘露醇濃度對(duì)舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

由圖3可知，采用甘露醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑，隨著甘露醇濃度的升高，舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢(shì)，舞春花原生質(zhì)體的活力則表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)，以甘露醇濃度為0.3 mol/L時(shí)，舞春花原生質(zhì)體活力最高，為83%。經(jīng)綜合分析，甘露醇濃度為0.25 mol/L是舞春花葉肉原生質(zhì)體分離的適宜濃度。

圖3 不同甘露醇濃度對(duì)舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

2.4 預(yù)處理方式對(duì)舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

由表1可知，不同預(yù)處理方式會(huì)顯著影響舞春花原生質(zhì)體的產(chǎn)量，但對(duì)原生質(zhì)體活力的影響不顯著。經(jīng)綜合分析，低溫黑暗處理（4 ℃、黑暗放置24 h）為最適宜的預(yù)處理方法，舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量為5.62×106個(gè)/g、活力為87.13%。

表1 不同預(yù)處理方式對(duì)舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

3 討 論

在進(jìn)行葉片原生質(zhì)體分離時(shí)，對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理可提高分離效果，預(yù)處理方式一般有預(yù)質(zhì)壁分離法和低溫黑暗處理法兩種。其中，預(yù)質(zhì)壁分離法采用CPW溶液和甘露醇等高滲溶液浸泡葉片，使葉肉細(xì)胞處于質(zhì)壁分離的初始狀態(tài)，這有利于提高細(xì)胞壁的酶解效率和促進(jìn)原生質(zhì)體的釋放；低溫黑暗處理法是將植物材料放置在低溫黑暗的環(huán)境中，通過(guò)提高原生質(zhì)體的活力和細(xì)胞膜抵抗外界壓力的能力，從而達(dá)到提高原生質(zhì)體的分離效率。在本實(shí)驗(yàn)中，分別采用了預(yù)質(zhì)壁分離法和低溫黑暗處理法兩種預(yù)處理方法進(jìn)行舞春花幼嫩葉片處理，相較于不預(yù)處理對(duì)照，均提高了原生質(zhì)體的分離效率，這與李玉株等[20]的研究結(jié)果一致。

在采用酶解法分離原生質(zhì)體時(shí)，適宜的酶種類及濃度是關(guān)鍵。目前，植物原生質(zhì)體分離常用的酶種類有纖維素酶、果膠酶及離析酶，其中，纖維素酶的主要作用是解離細(xì)胞壁中的纖維素；果膠酶可用以降解果膠質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞彼此分離；離析酶是一種多酶復(fù)合物，與果膠酶的作用相似，對(duì)原生質(zhì)體分離的傷害較小。不同植物材料因其細(xì)胞壁中纖維素、果膠的結(jié)構(gòu)和含量不同，分離原生質(zhì)體選擇的酶種類和濃度不同。例如，蔡肖等[21]以3.0%纖維素酶、0.5%離析酶、0.1%果膠酶的組合酶解液，高效分離出了小葉青楊葉片原生質(zhì)體；王姿童等[22]在水曲柳原生質(zhì)體制備中發(fā)現(xiàn)，1.5%纖維素酶+0.8%離析酶+0.4%半纖維素酶為最佳組合。同時(shí)，酶濃度過(guò)低會(huì)影響細(xì)胞壁酶解效率，酶濃度過(guò)高則會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害。此外，不同的植物材料、酶的質(zhì)量、酶解過(guò)程的振蕩頻率等，均會(huì)影響原生質(zhì)體的酶解過(guò)程。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了四種酶液組合，其中以2.0%纖維素酶+0.2%果膠酶+0.8%離析酶的酶液組合，對(duì)舞春花幼嫩葉片原生質(zhì)體的分離效果最好。

酶解時(shí)間是原生質(zhì)體分離的核心因素，對(duì)原生質(zhì)體的最終分離效果有很大影響，且采用不同的植物材料、酶液種類及濃度，需要的酶解時(shí)間也不同。例如，油棕、杉木的酶解時(shí)間分別為3.5 h、2.0 h[23-24]；Yoo等[10]報(bào)道，分離擬南芥葉肉原生質(zhì)體的酶解時(shí)間因材料生態(tài)型和基因型不同而出現(xiàn)差異，酶解時(shí)間一般為3～18 h。同時(shí)，酶解時(shí)間過(guò)短，酶解不充分，會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體釋放不完全、質(zhì)量不佳、產(chǎn)量低；酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生毒害作用，從而損傷細(xì)胞膜，造成原生質(zhì)體活力下降。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)舞春花幼嫩葉片的適宜酶解時(shí)間進(jìn)行了研究，隨著酶解時(shí)間的增加，舞春花原生質(zhì)體活力降低，原生質(zhì)體產(chǎn)量先升高再降低，以酶解時(shí)間為5 h時(shí)，舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，故舞春花原生質(zhì)體最適的酶解時(shí)間為5 h，該結(jié)果與Meyer等[16]的研究結(jié)果相比，酶解時(shí)間縮短了近10 h。

植物原生質(zhì)體對(duì)外界的滲透壓變化敏感，適宜的滲透壓是保證原生質(zhì)體質(zhì)量的重要因素，外界滲透壓過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體失水皺縮；外界滲透壓過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體吸水脹破。一般在酶解過(guò)程中可通過(guò)添加甘露醇來(lái)調(diào)節(jié)酶解液滲透壓，使其與原生質(zhì)體內(nèi)部滲透壓基本一致，但是，不同植物的原生質(zhì)體的滲透壓差異較大，需針對(duì)不同的植物材料分別進(jìn)行摸索。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了5個(gè)甘露醇濃度梯度，最終得出舞春花原生質(zhì)體分離適宜的甘露醇濃度為0.25 mol/L，與已報(bào)道的原生質(zhì)體適宜的酶解液甘露醇濃度為0.23～0.90 mol/L的研究結(jié)果相符[25]，但與Meyer等[19]的研究結(jié)果不同。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)初步探明了舞春花葉肉原生質(zhì)體的分離條件，即葉片于低溫（4 ℃）黑暗條件下預(yù)處理24 h，酶液組合為2%纖維素酶+0.2%果膠酶+0.8%離析酶+0.25 mol/L甘露醇+20 mmol/L MES+0.1%BSA+0.11%CaCl2，酶解 5 h，在此分離條件下，舞春花原生質(zhì)體產(chǎn)量為5.62×106個(gè)/g、活力為87.13%。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)論對(duì)舞春花的基因研究、遺傳改良和新品種培育具有重要意義。